动物细胞培养和核移植技术(上课用)【1】【课资课堂】

1、动物细胞培养和核移植技术,第一课时,1,专业应用,动物细胞工程常用的技术手段：,动物细胞培养、 动物细胞核移植、 动物细胞融合、 单克隆抗体 动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。,提问：,植物细胞工程常用的技术手段有哪些？,植物组织培养, 植物体细胞杂交,2,专业应用,从动物机体中取出相关组织，将它们分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。,一、动物细胞培养 1 、动物细胞培养的概念,3,专业应用,动物组织块,细胞悬液,原代培养,传代培养,胰蛋白酶或胶原蛋白酶 处理分散成单个细胞,（幼龄动物的器官、组织或胚胎）,加入培养液,用胰蛋白酶等处理贴壁细胞，使细胞从瓶壁

2、脱落,适宜条件,2.动物细胞培养的过程,4,专业应用,原代培养: 将动物组织经胰蛋白酶等处理后的初次培养。 传代培养: 对贴满瓶壁的细胞用胰蛋白酶处理，然后再分瓶继续培养。,5,专业应用,动物组织,单个细胞,细胞悬液,贴壁生长,分瓶培养,10代细胞,50代细胞,不死细胞,原代培养,传代培养,胰蛋白酶或胶原蛋白酶,剪碎,加培养液,接触抑制,少数癌变,少数,动物细胞培养技术流程,失去接触抑制现象,细胞核型不变,6,专业应用,当贴壁细胞生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖细胞出现接触抑制。,哪些细胞失去了接触抑制？,传代培养时，少数超过50代的细胞，由于遗传物质发生改变，可无限增殖，并失去了接

3、触抑制肿瘤细胞。,接触抑制,7,专业应用,动物胚胎或幼龄动物的组织、器官,胰蛋白酶,10代细胞,无限传代（不死性）,遗传物质改变,遗传物质未改变,8,专业应用,多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，根据你所学的内环境的知识，思考以下问题： 1.体外培养细胞时需要提供哪些物质？ 2.体外培养的细胞需要什么样的环境条件？,P46讨 论,充足营养（糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等合成成分及血清、血浆等天然成分。）,适宜温度、PH和气体环境；无菌无毒环境,9,专业应用,4、动物细胞培养条件：,1、无菌、无毒的环境 （添加一定量的抗生素，定期更换培养液） 2、营养 （葡萄糖、氨基酸、无机盐、

4、维生素、动物血清等。） 3、温度和PH 36.5+（-）0.5度, 7.2-7.4 4、气体环境： O2和CO2（95%空气和5% CO2 ）,保证细胞顺利的生长增殖,维持培养液的PH,10,专业应用,5、动物细胞培养应用,大规模培养生产生物制品（病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体） 作为基因工程中的受体细胞 培养的动物细胞可以用于检测有毒物质，判断某种物质的毒性 为治疗和预防癌症及其他疾病提供理论依据,11,专业应用,思考：,2、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？,1、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独特之处？,3、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细

5、胞？,4、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？,主要成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。独特之处有：1、液体培养基 2、成分中有动物血清等,因为这些组织或器官上的细胞生命力旺盛，分裂能力强,成块组织不利培养，分散了做成细胞悬浮液利于培养,不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体,12,专业应用,细胞的全能性,细胞株、细胞系,植物体或组织,培养结果,快速繁殖、培育无病毒植株等,培养目的,葡萄糖、动物血清,蔗糖、植物激素,培养基特有成分,液体培养基,固体培养基,培养基性质,细胞增殖,原理,动物细胞培养,植物组织培养,比较项目,试一试,13,专业

6、应用,第二课时,动物细胞培养和核移植技术,14,专业应用,二.动物细胞核移植技术和克隆动物,将动物的一个细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成为一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体（克隆动物）。,1.动物细胞核移植概念：,（难度高）,15,专业应用,细胞质,细胞核,细胞核移植,多莉羊的培育过程,16,专业应用,2、体细胞核移植的过程：,请看教材P48图2-21,思考： 1.核移植的受体细胞是什么？处在什么时期？用此细胞作为受体细胞有什么好处？ 2.通过什么手段激活受体细胞，构建重组胚胎？,M中期卵母细胞,诱导方法：物理或化学方法激活受体细胞，完成 细胞分裂和发育进

7、程。,卵母细胞体积大，便于操作；含有营养物质丰富，提供早期胚胎发育所需的营养；含有激活细胞核体现全能性的物质。,17,专业应用,胚胎 移植,2.体细胞核移植过程（体细胞克隆动物）,原理：动物细胞核具有全能性,显微 操作,18,专业应用,3.体细胞核移植技术的应用前景：,1.加速家畜遗传改良的进程,2.保护濒危物种,3. 生产医用蛋白质及组织器官的移植,4.了解胚胎发育和衰老过程；追踪研究疾病的发展过程和治疗疾病,19,专业应用,4、体细胞核移植技术存在的问题 P173,（1）成功率非常低 （2）克隆动物以表现早衰、生理缺陷等健康问题 成功率低，绝大多数克隆动物存在健康问题并表现出遗传和生理缺陷

8、：如体型过大，异常肥胖，发育困难，脏器缺陷，免疫失调等。,20,专业应用,讨论：（教材P49）,1.在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？,为使核移植的胚胎或动物的遗传物质全部来自有重要利用价值的动物提供的体细胞，在供体细胞的细胞核移至受体细胞之前，必须将受体细胞的遗传物质去掉或将其破坏。,21,专业应用,培养的动物细胞一般当传代至1050代左右时，部分细胞核型可能会发生变化，其细胞遗传物质可能会发生突变，而10代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型。因此，在体细胞核移植中，为了保证供体细胞正常的遗传基础，通常采用传代10代以内的细胞。,2.用于核移植的供体

9、细胞一般都选用传代10代以内的细胞，想一想，这是为什么？,22,专业应用,3.你认为用上述体细胞核移植方法生产的克隆动物，是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？,克隆动物绝大部分DNA来自于供体细胞核，但其核外还有少量的DNA，即线粒体中的DNA是来自于受体卵母细胞。,此外，即便动物的遗传基础完全相同，但动物的一些行为、习性的形成与所处环境有很大关系，核供体动物生活的环境与克隆动物所生活的环境不会完全相同，其形成的行为、习性也不可能和核供体动物完全相同，从这一角度看，克隆动物不会是核供体动物100%的复制。,23,专业应用,1.动物细胞培养取材时，一般是取胚胎组织或幼龄动物的组织或

10、器官，请解释原因。,细胞的衰老与动物机体的衰老有着密切的关系，细胞的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物则相反。所以，一般来说幼年动物的组织细胞比老年动物的组织细胞易于培养。同样，组织细胞的分化程度越低，则增殖能力越强，所以更容易培养。,肿瘤组织或细胞 正常组织或细胞,拓展-动物组织或细胞培养的难易程度,幼体组织或细胞 老龄组织或细胞,分化程度低的组织或细胞 分化程度高的组织或细胞,思考与探究（教材P50）,24,专业应用,思考与探究（教材P50）,2.动物细胞培养要经过脱分化的过程吗？为什么？,动物细胞培养不需经过脱分化过程。因高度分化的动物细胞发育潜能变

11、窄，失去了发育成完整个体的能力，所以，动物细胞也就没有类似植物组织或细胞培养时的脱分化过程了。要想使培养的动物细胞定向分化，通常采用定向诱导动物干细胞，使其分化成所需要的组织或器官。,25,专业应用,3.1997年，美国威斯康星州的一个奶牛场有一头名叫卢辛达（Lucinda）的奶牛，年产奶量为30.8 t，创造了世界奶牛产奶量最高新纪录。目前世界各国高产奶牛场奶牛，年平均产奶量一般为十几吨，而我国奶牛产奶量年平均水平仅为34 t。 （1）能利用体细胞核移植技术克隆高产奶牛卢辛达吗？请说明理由。,可以。卢辛达的产奶量很高，有高产奶的遗传基础，利用卢辛达的体细胞克隆的奶牛其遗传物质基本上全部来自该

12、奶牛，其克隆牛具有高产的遗传基础，如果精心培育和饲养，有可能在世界范围内推广，克隆牛再与高产的公牛自然繁殖，可得到很多高产的后代，从而加快奶牛改良进程。,该克隆牛不能无限制地推广，其数量不宜过多，尤其是在小范围内不能无限的繁殖，以避免奶牛群出现近亲繁殖而引起种质衰退。,26,专业应用,（2）如果将克隆高产奶牛卢辛达的任务交给你，你将如何对它进行克隆？,从卢辛达耳朵（也可用别的组织、器官，耳朵在活体上容易取）上剪取一小块组织，在体外培养获得该组织（如软骨组织）的细胞。从屠宰场取废弃的牛卵巢，抽取卵母细胞体外培养成熟。用显微针去除卵母细胞的核，再将耳细胞注入卵母细胞，用电刺激方法使卵母细胞与体细胞

13、融合，这时供体核就进入了受体卵母细胞，再用电刺激或化学物质激活注入了体细胞核的卵母细胞，使其完成减数分裂和发育过程。核移植胚胎在体外短时间培养后，挑选正常卵裂的胚胎植入经同期发情处理的受体母牛体内。,27,专业应用,4.体细胞核移植技术在研究和应用上还存在什么问题？请你查阅资料，了解这方面的前沿动态。,研究方面：克隆动物基因组重新编程的机制尚不清楚，克隆技术效率低，克隆动物畸形率高、死亡率高、易出现早衰等问题。这些问题尚在研究中。 应用上：生产克隆动物费用昂贵，距大规模应用还有一定距离。,28,专业应用,知识拓展,1.动物细胞培养技术是如何发展起来的？,1907年，哈里森（Harrison）在

14、无菌条件下用淋巴液作培养基，培养蛙胚神经组织存活数周，并观察到神经细胞突起的生长过程，由此创建了盖片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法，奠定了动物组织体外培养的基础。之后，又有人将悬滴培养法改良为双盖片培养，提高了传代效率并减少了污染。1923年，卡雷尔（Carrel）设计了卡氏瓶培养法，扩大了组织生存空间。 1951年， 厄尔 （Earle） 发明了体外培养动物细胞的人工合成培养基。1951年，波米拉（Pomerat）设计了灌流小室，使细胞生活在不断更新的培养液中，便于作显微摄影和细胞代谢的研究。1957年，格拉夫（Graff）用灌流技术进一步提高了细胞悬浮培养的效率。1957年，杜尔贝科（Dulbec

15、co）等人采用胰蛋白酶消化处理和应用液体培养基的方法，获得了单层细胞培养。单层培养法的出现，对组织培养的发展起了很大的推动作用。此后单层培养成为组织培养普遍应用的技术。20世纪60年代后，动物细胞大规模培养技术开始起步，并逐步发展。20世纪80年代后，随着基因工程和其他细胞工程技术的发展，细胞培养技术已成为转基因技术、生物制药及其他许多技术的基础，在现代生物技术中发挥着重要的作用。,29,专业应用,知识拓展,2.为什么动物细胞要分散成单个细胞培养？用酶消化的是什么物质？,细胞原代培养时可以分散成单个细胞培养，也可以用细胞群（团）、组织块培养，经传代培养后，最终都为细胞培养。 分散成单个细胞、细

16、胞群（团）后容易培养，细胞所需的营养容易供应，其代谢废物容易排出；而用大块组织培养时，内部细胞的营养供应和代谢废物的排出都较困难，因此，这些细胞在体外长时间的生存和生长就较困难。同时，分散成单个细胞培养，可使得在细胞水平操作的其他技术得以实现。 用酶消化的是细胞间基质，细胞间基质主要成分有胶原蛋白、层粘连蛋白、纤粘连蛋白、弹性蛋白等成分。用蛋白酶可使其消化，从而使细胞相互分离。,30,专业应用,知识拓展,3.体细胞核移植技术为什么要选择M期的卵母细胞做受体细胞？,细胞核移植技术中能用作受体细胞的通常有M期卵母细胞和受精卵（合子）。早期核移植技术中常用受精卵，后来基本上用M期卵母细胞取代了受精卵，主要因为两者的细胞质环境不同。有人认为重组需要的因子存在于M期卵母细胞的胞质中，而在原核形成时这些因子已被降解或用光，因此，原核扩张后受精卵去核可引起胞质中重组因子缺乏。成熟促进因子（MPF）是卵母细胞细胞质中重要的胞质影响因子，MPF的活性在卵母细