培养基的灭菌

1、培养基的灭菌,灭菌的原理及方法 培养基和发酵设备的灭菌工艺,灭菌：指用化学或物理的方法杀灭或去除物料及设备中所有生命物质的技术或工艺过程。 消毒：消除病原微生物的措施。 在工业中一般都笼统地称为杀菌或灭菌。,生产菌和杂菌同时在培养基中生长，结果丧失了生产能力。杂菌的生长速度有时比生产菌生长得快，结果使反应器中以杂菌为主。杂菌会污染最终产品。杂菌所产生的物质，使提取产物时发生困难。杂菌降解所需要的产物。发酵如污染了噬菌体，可使生产菌株发生溶菌现象。,如有杂菌，可引起以下的后果：,第一节 灭菌的原理及方法,一. 几种常见的灭菌方法,1. 化学试剂灭菌法,原理：药物与微生物细胞中的成分反应，使蛋白质

2、变性、酶失活。,使用范围：,器皿、双手和实验室、无菌室的环境灭菌， 不能用于培养基灭菌。,常用的灭菌剂:,常用的灭菌剂,2.辐射灭菌,原理：利用高能量的电磁辐射与菌体核酸的光化学反应造成菌体死亡。 常用：紫外线、X射线和射线。 使用范围：用于室内空气及器皿表面灭菌。,3干热灭菌法,原理：利用高温对微生物有氧化、蛋白质变性和电解质浓缩作用而杀灭微生物。 常用方法：灼烧和电热箱加热，140-180 1-2小时。 使用范围：玻璃及金属用具及沙土管灭菌,4湿热灭菌法,原理：蒸汽冷凝放出大量潜热，具有穿透力，且在高温有水分条件下，蛋白质易变性。 常用方法： 水煮常压灭菌：100 饱和蒸汽灭菌：一般121

3、，30分钟 使用范围：培养基和发酵设备灭菌,5过滤除菌法,原理：利用微生物不能透过滤膜除菌。 方法: 0.010.45 m孔径滤膜。 使用范围：用于压缩空气、酶溶液及其他不耐热化合物溶液除菌。,6火焰灭菌法,原理：利用火焰直接杀死微生物。 使用范围：接种针、玻璃棒、三角瓶口,1.微生物热死动力学（对数残存定律） - dN / dt =K N N：菌体个数（个） t : 灭菌时间（S） k：反应速度常数（S-1） dN / dt: 菌体受热死亡速率,Ln N/ N0 = - K t N= N0 e- K t 以菌体的残留数Ln N/ N0的对数与时间t 作图，得出一条直线，其斜率为- K 。,2

4、 .反应速率常数K,如何通过实验根据对数残存定律确定某一温度,某一微生物的K ？,1). K 与菌种的特性有关,相同温度下，微生物越耐热， k值越小。 相同温度下，微生物越不耐热，k值越大。,2). K 与灭菌温度有关 K=A e E / RT （阿累尼乌斯方程） Ln K =Ln A- E/ RT A：比例常数 R：气体常数(J/ mol K) T：绝对温度( K) E：杀死细菌所需的活化能（J/ mol）,第二节 培养基和发酵设备的灭菌工艺,一培养基灭菌时间的选择,t =1/ k * Ln( N0/ N),其中 K：一般耐热的细菌芽孢的K值 N0 ：细菌及芽孢数之和 N：10 -3,二.

5、培养基灭菌温度的选择,选择即能达到灭菌要求，又保证营养成分不被破坏的温度。,三 影响灭菌效果的因素,微生物种类：不同的微生物k值不同。 初始菌量：在保持N值不变的前提下，t 与初始菌量N0的对数成正比。 培养基成份：油脂、蛋白质增加微生物的耐热性。 传热与混合状况：影响受热均匀度。 培养基中固体颗粒的存在影响热穿透。 蒸汽中空气的存在降低蒸汽分压和灭菌温度。 pH：酸性pH下可加快微生物热死速率 。,四. 培养基和发酵设备的灭菌方法,（一）实验室种子培养基灭菌方法,手提式灭菌锅。 容量小。,使用高压蒸汽灭菌锅,立式或卧式灭菌锅。 容量较大， 一般能装几十瓶或几百瓶。,灭菌柜。 要和蒸汽锅炉配套

6、，用于大量种瓶培养基的灭菌，一次能装几百至几千瓶(袋)。,（二）分批灭菌(batch sterilization）,1定义： 将配制好的培养基输入发酵罐中，用蒸汽加热，使培养基和设备同时灭菌的一种灭菌方式。,2操作过程：,空罐准备：清洗、检修和检测。 升温：把培养基加热到灭菌所需的温度。 保温维持：在灭菌温度下保持灭菌所需时间。 冷却保压：把培养基的温度降低到接种的温度。,温度随灭菌时间的变化,四路出汽：直接蒸汽从排气、接种、进料和消沫剂管排气,分批灭菌设备示意图,三路进汽：直接蒸汽从通风、取样和出料口进入罐内直接加热，直到所规定的温度，并维持一定的时间。这就是所谓的“三路进气”。,（三）连续

7、灭菌（continuous sterilization）,1定义：将培养基通过专门设计的灭菌器，进行连续流动灭菌后，进入预先灭过菌的发酵罐中的灭菌方式。,2流程：,1)由热交换器组成的灭菌系统 2)蒸汽直接喷射型的连续灭菌系统 3)由连消塔、维持罐和喷淋冷却组成的灭菌系统,1)由热交换器组成的灭菌系统工艺流程图,温度随时间的变化,2)蒸汽直接喷射型的连续灭菌系统,温度随灭菌时间的变化,3)由连消塔、维持罐和喷淋冷却组成的灭菌系统,（四）连续灭菌与分批灭菌的比较与选择,分批灭菌 优点： 1. 不需附加设备 2. 蒸汽利用率高 3. 节约劳动力 缺点 1.培养基质量比较差 2.罐的利用率低 3.冷

8、却水用量大,连续灭菌 优点: 1.采用高温快速灭菌法 2.可以把培养基按性质分开灭菌 3.有利于自动控制 4.节省冷却水 缺点 1.投资费用高 2.对物料要求高,选择原则：,1培养基成份（易降解成分、液化情况等 ) 2设备状况（冷却面积、传动装置等） 3. 动力条件,(五)、发酵罐的灭菌,培养基的灭菌如果是采用连续灭菌法。则发酵罐应在加入灭菌的培养基前先行单独灭菌。通常是用蒸汽加热发酵罐的夹套或设管并从空气分布管中通入蒸汽，充满整个容器后，再从排气管中缓缓排出。容器内的蒸汽压力保持1公斤，20分钟。在保温结束后，关键是随即通入无菌空气，使容器保持正压，防止形成真空而吸入带菌的空气。,(六)、补料液的灭菌,在发酵过程中，往往要向发酵罐中补入各种不同的料液。这些料液都必需经过灭菌。 灭菌的方法则视料液的性质、体积和补料速率而定。 如果补料量较大，而具有连续性时，则采用连续灭菌较为合适。 也有利用过滤法对另补料液进行除菌。 补料液的分批灭菌，通常是向盛有物料的容器中直接通入蒸汽。 所有的附属设备和管道都要经过灭菌。,四、高温对培养基成分的有害影响及其防止,消除高温有害影响的措施,(1）采用特殊加热