荧光假单胞菌2P24中phlF基因对抗生素24二乙酰基间苯三酚产生的影响

植物病理学报 ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA 40(2)：144150(2010) 荧光假单胞茵2 P24中p 基因对抗生素 2，4一二乙酰基间苯三酚产生的影响 周宇平 ，吴小刚 ，周洪友。，何月秋 ，张力群h ( 中国农业大学植物病理学系农业部植物病理学重点开放实验室，北京100193； 云南农业大学教育部生物多样性与病虫害控制 重点实验室，昆明650201；。内蒙古农业大学农学院，呼和浩特010019； 云南农业大学农学与生物技术学院，昆明650201) 摘要：Pseudomonas fluorescens 2P24是分离自山东小麦全蚀病自然衰退土的l株生物防治菌株，产生抗生素2，4-二乙酰基 间苯三酚(2，4-diacetylphloroglucinol；2，4一DAPG)是其主要防病机制。2，4-DAPG是由phlACBD基因簇合成，受多种调控因 子调控。本研究用Tn5转座子插入技术，获得I株phlA基因转录增强的突变体，其突变基因为抗生素合成的负调控基因 phlF。与野生菌相比，phlF基因的缺失突变体中phlA的转录增强约100倍，抗生素产量提高492倍。同时，菌株2P24的 phlF缺失突变体对病原真菌的拮抗作用明显增强。但2，4-DAPG过量表达菌株对多种作物种子根生长有抑制作用。 关键词：假单胞菌；生物防治；2，4一二乙酰基问苯三酚；调控 Effect of gene p，7，F on 2，4一diacety Jph10r0glucjn0 J production in Pseudomonas fluo rescens 2 P24 ZHOU Yuping ，WU Xiaogang ，ZHOU Hongyou。，HE Yueqiu ”，ZHANG Liqun ( The Key Laboratory of Plant Pathology，Ministry of Agriculture，and Department of Plant Pathology，China Agricul tural University，Beijing 100193，China； Key Laboratory of Agricultural Biodiversity and Pests Control；Ministry of Education； Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，China； College of Agriculture，Agricultural University of InnerMongolia，Hu hehot 010019，China； Faculty of Agronomics and Biotechnology，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，China) Abstract：Pseudomonas fluorescens 2P24，a biocontrol agent isolated from suppressive soil of wheat takeall， protects plants against soilborne diseasesProduction of antibiotic 2，4一diacetylphloroglucinol(2，4一DAPG)is a major mechanism contributed to its biocontrol activitiesBiosynthesis of 2，4-DAPG is encoded by a genetic locus phlACBD and regulated by a number of regulatorsA mutant with an enhanced phlA transcription was created by Tn5 mutagenesis，and the Tn5一targeted gene，phIF，was identifiedCompared to the wildtype strain 2P24，the transcription of phIA and the production of 2，4一DAPG in phlF defective mutant increased about 100 and 492 times，respectivelyMoreover，the phiF mutant had enhanced inhibitory effect on the myce lial growth of pathogenic fungi in culture medium compared to the wild type 2 P24After coated on seeds，the phlF mutant showed obvious inhibitory effect on root growth in several crops Key words：Pseudomonas；biological control；2，4一diacetylphloroglucinol；regulation 中图分类号：$4761 文献标识码：A 文章编号：0412-0914(2010)02-014407 假单胞菌(Pseudomonas spp)的一些菌株是 常见的植物病害生物防治细菌。抗生素的产生一 直被认为是其主要的生防机制之一 。荧光假单 胞菌(Pfluorescens)可产生多种抗生素，如： 收稿日期：2009-05-l】；修回日期：2010-01-03 基金项目：国家“863计划”(2006AA10A211)；国家自然科学基金资助项目(30871666；30860166)；MOSTDEST国际合作项目 (2007DFA31570) 通讯作者：张力群，副教授，主要从事细菌分子遗传学和植物病害生物防治研究；Tel(Fax)Email：zhanglqcaueduClfl 第一作者：周字平(1982一)，男，江苏苏州人，硕士研究生，主要从事植物病害生物防治研究。 2期 周宇平，等：荧光假单胞菌2P24中phlF基因对抗生素2，4-二乙酰基间苯三酚产生的影响 2，4一二乙酰基间苯三酚(2，4-diacetylphloroglucinol； 2，4一DAPG)、吩嗪1一羧酸(phenazinelcarboxylic acid；PCA)、藤黄绿脓素(pyoluteorin)、硝吡咯菌 素(pyrrolnitrin)和氰氢酸(HCN)等 。其中抗生 素2，4-DG因对多种植物病原真菌、细菌和线虫 具有抑制或杀死作用而得到较深入的研究 J。生 防假单胞菌Q2-87和CHA0产生的2，4-DAPG是 防治小麦全蚀病 和烟草黑根腐病的主要因 子 ，菌株Fl13产生的2，4一DAPG是其防治马铃 薯细菌性软腐病 和马铃薯胞囊线虫病的主要机 制 J。抗生素2，4-DG的合成基因簇phlACBD 已经被克隆并测序，其转录和翻译受到多个上游基 因的调控，如GacSGacA双因子调控系统u， ， 小RNA因子RsmY和PrrBu ，HNS家族蛋白 MvaT_l ，二硫键形成蛋白DsbA_l 等。 Pfluorescens 2P24分离自山东小麦全蚀病自 然衰退土，可以产生多种抗菌次生代谢物，对小麦 全蚀病和番茄青枯病具有显著的生物防治效 果 12,13，其中抗生素2，4-DG在其植物病害生 物防治中起主要作用 31H J。因此，研究2，4-DG 在菌株2P24中合成的调控因子对进一步理解该菌 株的防病机制、发挥菌株的生防效果都有重要意 义。前期研究已经证明GacSGacA双因子调控系 统和小RNA因子RsmZ是2，4一DAPG合成的正调 控因子 。本文通过Tn5随机插入突变的方法寻 找生防菌株2P24中抗生素2，4一DAPG合成基因表 达的负调控因子，为生防菌株的遗传改造积累材料。 1材料和方法 11菌株和质粒 本试验所用的菌株与质粒见表l。大肠杆菌 在LB培养基中37培养，2P24在LB和King S B 固体培养基或培养液中28培养，真菌在PDA培 养基中25培养。 Table 1 Strains and plasmids used in the study Note：Ap ，Kin ，Cm and Tc indicate resistance to ampicillin，kanamycin，chloramphenicol and tetracycline 植物病理学报 40卷 12工具酶和试剂 限制性内切酶购自TaKaRa公司，连接酶和 Taq DNA聚合酶购自北京赛百盛公司，PCR产物 回收试剂盒购自Omega公司。2，4-DAPG标样购 自TRC公司。除乙腈和甲醇为色谱纯外其它试剂 均为国产分析纯。 13 DNA操作技术 131 DNA的提取、酶切、纯化、回收和连接参 照文献16的方法实施。 132 Tn5随机插入法突变及突变子的筛选和鉴 定在助手质粒pRK600的协助下，通过三亲交 配 将连接有miniTn5的载体pUTkm从Ecoli DH5c转入Pfluorescens 2P24，Tn5随机插入菌 株2P24染色体DNA。即将过夜培养的供体菌、受 体菌PM901和助手菌的菌悬液等体积混合，离心 收集菌体，无菌水清洗3次后悬浮于100 L的无 菌水中，将菌液点接于LB平板，28培养5 h后收 集菌体，系列稀释，涂于含Amp、Km和Xgal的 ABM培养基平板上，28培养48 h，长出的菌落即 为Tn5突变菌株。 得到突变菌株后用鸟枪法将其Tn5侧翼序列 克隆到pMD一18上测序，再用BLAST比对分析。 133 phIF基因的缺失突变和互补 分别利用 引物对ph1667：5 一GcTcTGCAGcATTGTccAT GAGCTCATC-3 (下划线为 f I酶切位点)，phll900： 5 一GAGAGATCTCCATTCAGCAAGGCGAGT3 (下划线为Bgl酶切位点)和ph12267： 。 ( Gr CI G0 | (下划线为Bgl I1酶切位点)，phi271： 5 一GC GAATTC TATTCACATTCAGTGCTCG3 (下划线为EcoR I酶切位点)，以菌株2P24基因组 为模板，PCR扩增phlF基因上游和下游片段，所得 片段分别经Pst IBgl和Bgl一EcoR I酶切后， 与经 I-EcoR I酶切的pHSG299连接得到自杀载 体p299一AphlF(图1)。将该载体转入Pfluorescens 2P24中，经二次同源重组后，得到phlF基因内缺失 突变体PM911。该突变体通过引物ph1667和 ph14271进行PCR验证。相同的方法得到PM102的 phlF基因内缺失突变体PM912。 设计引物ph11274：5 一GAGGAAAGCTTGT ATGGGAA一3 (含Hnd酶切位点)和phi411： 5 r_GCTTCTCGAGAGAATCCTAT一3 (含Xho I酶 切位点)，以Pfluorescens 2P24基因组为模板进 行PCR扩增。扩增产物经-rid111和Xho I双酶切 后连接经相同酶切过的穿梭载体pME6010，获得 p6010一phlF(图1)。将重组载体电击转入PM911 和PM912，得到phlF基因互补菌株PM9llF和 PM912一F。 800 bp f-_ 一、) 1 phlG phlF pho phM 一 罱= 芑 8137 Fig1 Organization of phlG，phlF and phlACBD region of Pseudomonas fluorescens 2P24 and description of the constructed vectors phlACBD is the synthetic locus of antibiotic 2，4-DAPGPhlG is a hydrolase that specifically degrades the 2，4-DAPG驯 Ph1F is a negative regulator of phlACBD operonPho is the putative binding site by PhlF protein ， P C ， 矗 p H rJ IIIIp 2期 周宇平，等：荧光假单胞菌2P24中phlF基因对抗生素2，4-二乙酰基问苯三酚产生的影响 147 14 3-半乳糖苷酶酶活性测定 将PM102(phIA：LacZ)及其衍生菌在28下 用LB培养液，120 rrain摇培36 h，按l：1 000(V ：V)的比例转接到40 mL LB培养液中，继续摇培 6 h后开始取样，之后每3 h取一次样，直到细菌生 长达到稳定期，酶活性测定方法见文献21。 15抗生素2，4一DAPG产量的定量检测 将Pfluorescens 2P24及其衍生菌株在KingS B培养液中培养48 h，将菌液用l molL的HC1酸 化至pH 20，离心后取上清液用等体积乙酸乙酯 萃取，旋转蒸发抽干有机相，干物质溶于01 mL 甲醇，用HPLC测定其中的2，4一DAPG。HPLC使 用Agilent TCC18反向色谱柱(46 X 150 mn1)，检 测波长270 nln，进样体积5 txL，流动相为乙腈：水 (vv=60：40)，流速10 mLmin 。 16 Pfluorescens 2P24野生型菌株及其突变 菌株对病原茵的拮抗作用 在PDA平板中央接入直径为6 mnl的病原真 菌菌饼，同时在距离菌饼25 cm处接种待测生防 菌。25培养，当病原真菌长到培养皿边缘时测量 抑菌带距离。每处理3个重复。 17 Pfluorescens 2P24野生型菌株及其突变 菌株对植物种子发芽的影响 将Pfluorescens 2P24及其衍生菌在28下 用LB培养液摇培24 h至OD6oo=14，将种子在菌 液中浸泡30 min，摆放在两层充分润湿的滤纸问， 将纸卷竖立(胚根朝下)，放置在25恒温的光照 培养箱中，12 h光照12 h黑暗培养 。3 d后观 察结果，测量种子根生出长度。 2结果与分析 21 Pfluorescens 2 P24突变子的筛选和鉴定 报告菌株PM102(phlA：LacY)在含XOal的 ABM培养基上形成的菌落显浅蓝色，如果Tn5插 人破坏了phlA基因的调控基因，突变体PM102菌 落蓝色的深浅会发生变化。通过三亲交配得到大 约80 000株出发菌株PM102的Tn5插入突变体， 其中筛选到25株在含X Gal的ABM培养基上蓝 色增强的突变菌株，突变率约为l：3 200。其中，突 变体PM102一H5菌落显蓝色增强最为明显，B半乳 糖苷酶活性比PM102增强75倍。鸟枪法克隆突 变体PM102H5染色体上插入Tn5的DNA序列 并连接到pMD一18上测序，序列比对分析的结果显 示转座子Tn5破坏的基因与Pfluorescens Fl13 中phlF基因同源性高达92_2 。菌株2P24中 phlF由627个核苷酸编码，与phlA的转录方向相反 (图1)，中间间隔423个碱基 。phlF是抗生素2， 4一DAPG生物合成的负调控基因，在Pfluorescens CHA0_2 和Pfluorescens Fl13l24 中均有报道。 22野生型phlF基因的克隆和突变体互补 将自杀载体p299AphlF转入野生型2124和 突变体PM102(phlA：tcZ)中，经二次同源重组 后，分别得到缺失301 bp DNA片段的phlF基因内 缺失突变体PM911(AphlF)和PM912(aphlr， phlA：LacZ)。 以野生型21：2-4基因组为模板PCR扩增得到 含有完整phlF基因的1137 bp DNA片段，连接到 穿梭载体pME60IO，获得互补质粒p6010一phlF。将 重组载体电击转入PM911和PM912，分别得到 phlF基因互补菌株PM911一F和PM912一F。 2。3 phlF基因对phlA基因转录的影响 菌株PM901(phlA： cZ)、PM912(AphlF， phlA：LacZ)和phlF基因互补菌株PM912F在 LB培养液中的生长情况没有明显的差异(图2)。 但phW基因缺失后phlA基因的转录水平在各生 长阶段都显著高于出发菌PM901。而且随生长时 间的延长，菌株PM912中phlA基因的转录水平还 在不断提高，对数生长末期和静止期高于对数生长 期。用phlF基因互补该突变体后B一半乳糖苷酶活 性又显著下降，趋向于出发菌PM901的水平(图 2)。表明phlF基因对抗生素2，4-DAPG合成基因 phlA的转录起到负调控作用。 24 pnF基因对2，4一DAPG产量的影响 抗生素2，4-DAPG是菌株2P24防病作用的关 键因子。菌株2P24在KingS B培养液中摇培48 h后，2，4一DAPG产量可达004 mg(mL OD6oo)，phlF缺失菌株PM911的2，4-DAPG产量 植物病理学报 40卷 比野生型2P24提高了492倍，而互补菌株的产量 又恢复到与菌株2P24相似的水平(图3)。表明 phlF基因对2，4-DAPG的产量起负调控作用。 10 000 6 9 12 l5 l8 21 24 Hours after inoculation(h) Fig2 Effects of phlF gene on transcription of phlA gene Strain PM901(ph ：LacZ)，its phlF gene mutant PM912 and the complemented strain PM912-F were grown in LB li- quid mediumSamples were taken at various time points and the OD60o(1ine)and Bgalactosidase activities(column) were detected 100 O01 2P24 PM9l1 PM91 1-F 25平板拮抗测定 影响生防菌2P24平板拮抗能力的主要因素是 抗生素2，4-DAPG的产量，抗生素合成基因phlD 的突变菌株PM102完全丧失了拮抗活性(表2)。 phlF基因缺失菌株PM911对立枯丝核菌(Rhizoc tonia solani)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)和瓜果腐 霉(Pythium aphanidermatum)的拮抗圈明显大于野 生型2P24，说明负调控基因phlF的缺失提高了 2P24对病原真菌的拮抗能力(表2)。但试验中发 现phlF基因互补菌株几乎没有拈抗活性，可能是 平板培养条件下phlF基因互补菌株2，4-DAPG的 产量不足以对病原菌产生明显的拮抗表型。 26抗生素2，4一DAPG过量表达菌株对种子根 生长的影响 已有报道认为高浓度2，4-DAPG对植物生长 有抑制作用，而且不同植物对该抗生素的敏感程度 不同 J。在本文试验条件下，多数植物种子经野 生型2P24菌液处理后，根的生长与对照没有明显 变化。但野生型2P24处理的棉花根长明显短于对 照，说明所用棉花品种可能对该抗生素比较敏感。 而萝卜种子用野生型2P24菌液浸泡后根生长比对 照显著增长，有可能是因为萝卜对该细菌发酵液中 某些可刺激植物生长的代谢物比较敏感(表3)。 经过量表达2，4-DAPG的PM911菌液浸泡过的种 子中，除了黑麦和油菜以外，其它作物根生长长度 都比野生型2P24处理显著减小，而phlF互补菌株 菌液浸泡过的种子根生长与野生型2P24处理相比 没有显著变化(表3)，说明phlF突变体2，4-DAPG 的产量已经超过了多种植物正常生长的耐受程度。 3结论与讨论 Fig3 Production of 2，4-DAPG in Pseudomo- nas fluorescens 2P24，its phlF gene 前期遗传学研究证明生防菌株Pfluo c mutant PM91 1 and the complemented 2P24中抗生素2，4-DAPG的产生是其防治植物病 strain PM911一F 害的主要因子 M 。因此，对该抗生素合成基因表 Table 2 Antibiosis ability of Pseudomonas fluorescens 2P24 and its derivates to pathogenic fungi(mm) 。 口0 6 4 2 8 6 4 2 l l 1 l O 0 0 0 O 0 O O 1 O O l O 1 II 矗_I一一目一 砖口一0 _【 l 一囊90oI_1g吕一 l10 uj乜0I 0dvQ寸 2期 周宇平，等：荧光假单胞菌2P24中phIF基因对抗生素2，4-二乙酰基间苯三酚产生的影响 Table 3 Effects of Pseudomonas fluorescens 2 P24 and its derivates on plant root growth(cm) Data followed by different letters in the same column mean significant difference at 005 level 达调控的研究有利于阐释菌株2P24的防病机制。 本研究表明，2P24中phlF基因在转录水平上负调 控抗生素合成基因phIACBD的表达，与生防细菌 Pfluorescens CHA0 和Pfluorescens Fl13 。 的前期研究结果基本一致。所不同的是菌株 Fl13【24 中phlF基因对抗生素合成基因的负调控 作用只表现在菌株的对数生长期，而菌株2P24的 phlF突变体PM912中B一半乳糖苷酶酶活性在菌 株整个生长期都显著高于野生型，这可能与菌株问 的差异有关，也可能是因为所构建的转录报告结构 不同。Pfluorescens Fl13菌株的研究工作证明低 浓度2，4DAPG可解除PhlF蛋白对phlA基因转 录的阻遏L24 J，而突变体PM912中phlA和lacZ基 因是在染色体上融合，因此该突变体本身不产生 2，4一DAPG，没有对phlA基因的反馈调控，因而在 对数生长后期和静止期phlA基因的转录仍保持与 野生型有显著差异。 菌株2P24及其phlF基因突变体的互补菌株 PM911一F在KingS B培养液中抗生素2，4一DAPG 的产量差异不大(图3)，但在固体PDA培养基上 二者拮抗能力完全不同。菌株2P24对病原真菌有 明显拮抗作用，而PM911F几乎没有抑菌作用(表 2)。培养条件对细菌抗生素等次生代谢物的产生 有较大影响。初步研究表明，在固体PDA培养基 上菌株PM911F与菌株2P24的2，4一DAPG产量 比值远小于KingS B液体培养时的比值(未发表 数据)，这可能是造成菌株PM911F没有表现出对 真菌拮抗活性的原因之一。但phlF基因在不同环 境条件下对2，4一DAPG合成基因的调控有何不同 之处，还需进一步的试验研究。 提高抗生素产量是生防微生物遗传工程改造 的常用策略。但本研究在利用phlF基因突变菌株 进行病害防治试验时，发现过量产生抗生素2，4一 DAPG对多种作物的生长有显著抑制作用。进一 步的植物毒性试验说明(表3)，虽然野生型2P24 菌株产生的2，4-DAPG对多数供试材料的生长没 有抑制作用，phlF基因突变体的抗生素产量还是 超出了多数作物的耐受水平。因此，对于特定的生 防菌来说，单一提高抗生素产量可能不是遗传改造 的适宜策略。抗生素产量与防病效果之间的关系 也可能因菌株而不同，前期工作曾证明，将2，4一 DAPG抗生素合成基因簇phlACBD分别转化生防 菌株Pfluorescens P32，CPFl0和2P24后，抗生 素2，4-DAPG的产量都得到显著提高，但只有菌株 P32和CPF10的防病效果得到提高，而2P24工程 菌与野生型对小麦全蚀病的防效却没有显著差 异 。这也说明在实际应用中，生防菌抗生素的 产量应控制在一个合理有效的范围内。 参考文献 1Haas D，Keel CRegulation of antibiotic production in rootcolonizing Pseudomonas sppand relevance for biological control of plant diseaseJAnnual Review ofPhytopathology，2003，41：117153 2Vincent M N，Harrison L A，Brackin J M，et a1Ge netic analysis of the antifungal activity of a soilborne Pseudomonas aureofaciens strainJApplied and En vironmental Microbiology，1991，57(10)：2928 2934 3Ked C，Schnider U，Maurhofer M，el al，Suppression of root diseases by Pseudomonas fluorescens CHA0： importance of the bacterial secondary metabolite 2，4一 diacetylphloroglucinolJMolecular PlantMicrobe Interactions，19925：413 4Defago G，Haas DPseudomonads as antagonists of soilborne pathogens：modes of action and genetic anal ysisMNew York：Marcel Dekker Press，1990 249291 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