流式细胞仪技术ppt课件

流式细胞术流式细胞术Flow Cytometry（ FCM）概 述流式细胞技术的发展流式细胞技术的发展1930s1950s:开始出现自动细胞分析技术 （ 细胞的计数，光电仪记录流过一根毛细管的细胞 ,结合了荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白，应用分层鞘流原理，成功的设计红细胞光学自动数器。） 1960s晚期发展 ：（ 荧光检测细胞计 ，细胞分选器检测细胞的荧光信号 ，单克隆抗体技术 ， 1973年， BD公司与美国斯坦福大学合作，研制开发并生产了世界第一台商用流式细胞仪 FACS I。）仪器特点：单个细胞通过狭窄， 激光束产生能够反映细胞大小的信号，激光束激发不同的荧光素所标记的细胞成分能发射出不同的荧光。流式细胞仪技术在医学与生物学中的应用 流式细胞术 ( Flow Cytometry, FCM) 是一种对细胞或亚细胞结构进行快速测量及分选的技术。它利用高能量的激光照射高速流动的被荧光色素染色的单细胞（或微粒） ,测量其产生的散射光和发射荧光的强度，对细胞 (或微粒 ) 的物理性状、细胞的生理和生化反应、细胞免疫、血液病的诊断及治疗、移植医学、肿瘤细胞的增殖及凋亡、临床病菌的检验等进行定性或定量检测。在生物学、基础医学和临床诊断及治疗等领域得到广泛的应用。FCM基本结构1.激光 , 光路系统及光电倍增管 (探测器 )2.液流系统3.计算机处理系统 FCM结构图1. 激光激光 , 光路系统及光电倍增管光路系统及光电倍增管 (探测器探测器 )原理示意图原理示意图光学系统 FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片、小孔组成，它们分别将不同波长的荧光信号送入到不同的电子探测器。 2. 液流系统流动室激光聚焦激光波长 : 488nm, 635nm3.流式细胞仪工作原理提 要流式细胞仪使用的基本知识流式细胞仪检测的生物学意义流式细胞仪检测在临床诊断的应用1 流式细胞仪使用的基本知识前向散射光 (FSC)与侧向散射光 (SSC)的含义荧光素的选择检测通道的确定自发荧光的产生消除非特异性结合 -FcR阻断对照的设置多色 荧光补偿的调节设门的意义样品处理的要求FSC和 SSC的原理前向散射光(FSC)与侧向散射光(SSC)的含义前向散射光侧向散射光血细胞双参数点图Fluorescein Isothiocyanate (FITC)异硫氰酸荧光素Phycoerythrin (PE)藻红素Allophycocyanin (APC)异藻蓝蛋白Peridinin-Chlorophyll Protein (PerCP)多甲藻黄素 -叶绿素蛋白Tandem DyesPE-Texas Red (ECD)PE-Cy5 (PC5)PE-Cy5.5 (PC5.5) (futures)PE-Cy7 (PC7) (futures)Propidium iodide（ PI ）碘化丙碇常用荧光染料 (488nm,633nm激发 )荧光素的选择：荧光强度FITCPEAPC依次增加；弱信号采用 PE或APC，强信号采用 FITC荧光素的选择常用荧光染料的特性荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长 (nm) 用途 颜色FITC 488 525 免疫荧光 绿色PE(RD1) 488 575 免疫荧光 橙色 PerCP 488 670 免疫荧光 红 色APC 633 670 免疫荧光 红色PI 488 620 DNA染色 橙红ECD 488 620 免疫荧光 橙红PeCy5 488 675 免疫荧光 红色通道 发射波长 荧光颜色FL1 530/30 绿色 FL2 585/42 橙色FL3 650 橙 红FL4 661/16 红色FL2 - Area FL2 - Width 检测通道的确定自发荧光的产生末染色 的细胞受到光照射后所发出的荧光称自发荧光。用流式细胞计测定细胞的特异性荧光染料的荧光时，这种自发荧光对所欲测定的特异性荧光是一种 本底信号 ，自发荧光在多种情况下都会干扰特异性荧光信号，尤其是对低水平结合的荧光抗体它能减低染色的和未染色的细胞间的区别，使我们难以确定细胞中荧光信号的水平。自发荧光的强弱与细胞的大小、细胞的类型、激发光的波长、发射光的检测范围等都有关系。产生自发荧光的分子可能是 正常细胞的组成成分 如核黄素、细胞色素等。消除非特异性结合 -FcR阻断 对于小鼠细胞需要用于FcR阻断剂 (纯化的抗FcII/III受体抗体 )减少非特异性荧光染色； 对于人和兔细胞可以应用纯化同种的 Ig或血清预先阻断 Fc受体对照的设置 细胞固定和膜穿透后，应用同一克隆的无荧光素结合抗体处理，能够区分细胞因子特异和非特异染色 荧光素结合的 Isotype Ig作为阴性对照，阴性对照的抗体浓度应该与抗细胞因子抗体的浓度相同； 细胞内细胞因子检测 ,可设阳性对照细胞。激发光源与荧光标记物示意图光谱重叠示意图荧光补偿 流式细胞仪常用的荧光染料多数存在发射光谱的重叠，流式细胞仪的光学滤片系统最大限度地减少这些信号。 色彩补偿 (Color Compensation):利用电子或数学方法从一个信号减少另外一个信号成分的技术，典型例子是校对一个波长区域的荧光信号在垂直轴的第二荧光的重叠。光谱重叠的校正的示意图多色荧光补偿的调节两种发射荧光重叠的部分利用荧光 (色彩 )补偿调节来消除。色彩补偿