第二节细胞培养方法及应用实例

第二节 细胞培养方法及应用实例一、动物细胞培养方法二、植物细胞培养方法三、细胞培养反应器四、细胞工程应用实例Cell development method and its applied solid example一、 动物细胞培养方法根据动物细胞的生长特点，常见的细胞培养方法有贴壁培养、悬浮培养及固定化培养等三种方法。1.贴壁培养所谓贴壁培养是指细胞贴附在一定的固相表面（如：培养皿、培养瓶等）进行的培养。 生长特性贴壁依赖型细胞在培养时要贴附于培养（瓶）器皿壁上，细胞一经贴壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。一般数天后就铺满培养表面，并形成致密的细胞单层。 主要优点细胞紧密黏附于固相表面，易更换培养液；易采用灌注培养，从而达到提高细胞密度的目的；因细胞固定表面，不需过滤系统；适用于所有类型细胞。 主要缺点与悬浮培养法相比：扩大培养比较困难，投资大；占地面积大；不能有效监测细胞的生长。 细胞贴壁的表面要求具有净阳电荷和高度表面活性。对微载体而言还要求具一定电荷密度；若为有机物表面，必须具有亲水性，并带阳电荷。2.悬浮培养悬浮培养是对非依赖性细胞培养的一种方法。 某些贴壁依赖性细胞经过适应和 选择也可用此方法培养。悬浮培养投资较小，扩大培养规模简单（只须增大培养体积）。如：淋巴细胞的培养可采用悬浮培养法。细胞悬浮培养瓶进入分裂的静止期。对于多数悬浮培养物来说，细胞在培养到第 18 25d 时达到最大的密度，此时应进行第一次继代培养。在继代培养时，应将较大的细胞团块和接种物残渣除去。若从植物器官或组织开始建立细胞悬浮培养体系，就包括愈伤组织的诱导、继代培养、单细胞分离和悬浮培养。在悬浮培养过程中应注意及时进行细胞继代培养，因为当培养物生长到一定时期将3.固定化 培养所谓固定化培养是指，将动物细胞与不溶性载体结合起来进行培养的方法。简单地，说就是将被培养生物体固定在一定的培养基上进行培养的过程。动物细胞的固定化易于细胞与产物的分离及产品的纯化。因此，固定化是实现动物细胞高密度长期培养、从而提高生物反应器生产效率的重要技术途径。常见的固定化方法有：吸附法、共价贴附法、交联法和包埋法等。 吸附法所谓吸附法是指：用固体吸附剂将动物细胞吸附在其表面，从而使细胞固定化。吸附法的主要优点是：操作简便、条件温和；其主要缺点是：载体的负荷能力低，细胞易脱落。 共价贴附法所谓共价贴附法是指：利用共价键将动物细胞与固体载体结合的细胞固定化方法。共价贴附法连接键非常牢固，能有效地减少细胞泄漏；因化学试剂的引入，对细胞的活性有一定的影响。 交联法使用双功能或多功能试剂，直接与细胞表面的反应基团如氨基、羧基等进行交联，形成共价键来固定细胞，其结合力是共价键。此法制备的细胞与载体结合紧密，但制备麻烦，活力损失较大。包埋就是将细胞包裹在有限空间内，制成固定化细胞。包埋后的细胞不会扩散到周围介质中去，而底物和产物却能自由扩散。包埋法仅只是将细胞包埋起来，不与载体发生反应，故包埋法细胞的活性损失较小。包埋法根据其包埋的形式不同，又可将其分为格子型和微胶囊型两种。 包埋法二、植物细胞培养方法常见的植物组织细胞培养有愈伤组织培养、原生质体培养、花粉培养等方法。1.愈伤组织培养所谓愈伤组织培养是指， 将外植体接种到人工培养基上，在激素作用下，进行愈伤组织诱导、生长和分化的培养过程。植物组织(消毒 )MS培养基 愈伤组织切取 接种 培养什么是愈伤组织？长出茎、叶生根培养试管苗资料卡片愈伤组织（ callus）在无菌条件下，将植物器官或组织（如芽、茎尖、根尖或 花药 ）的一部分切下来，放在适当的人工 培养基 上进行培养，这些器官或组织就会进行 细胞分裂 ，形成新的组织。不过这种组织没有发生分化，只是一团薄壁细胞，叫做愈伤组织。愈伤组织 在适合的光照、温度和一定的营养物质与激素等条件下，愈伤组织便开始分化，产生出植物的各种器官和组织，进而发育成一棵完整的植株。在植物的组织培养中，从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期。即：启动期（细胞准备进行分裂期）、分裂期和形成期。2.原生质体培养取植株的幼胚、根、茎或叶等组织细胞，用纤维素酶或果胶酶除去植物体细胞的细胞壁（原生质体），在培养基上生长分裂，通过愈伤组织诱导分化长出茎、叶，再长出根形成植株。植物细胞愈伤组织长出茎、叶生根培养驯化移栽原生质体分离 破壁 接种、培养分化培养生根试管苗3.花粉培养在无菌条件下取出花药或花粉粒（小孢子），置于培养基上进行人工培养，形成花粉胚或花粉愈伤组织，最后形成花粉植株。接种花药花粉愈伤组织单倍植株花粉植株三、细胞培养反应器细胞培养反应器种类繁多，根据细胞的培养方式不同，可将其分为悬浮培养反应器、贴壁培养反应器及固定化培养反应设备等。1.悬浮培养反应器 搅拌式反应器常见的悬浮培养反应器如：搅拌式反应器、液体循环式反应器和鼓泡式反应器等类型，其工作原理与相应的微生物反应器（发酵罐）相同。对于动物细胞，因没有细胞壁的保护，对搅拌剪切作用十分敏感，直接的机械搅拌很容易对其造成损害。同样，植物细胞 的纤维素细胞壁虽然使细胞具有很强的抗张强度，却使其抗剪切的能力相当弱。因此， 传统用于微生物的搅拌反应器用作细胞的培养，须对搅拌方式加以改进。5L 细胞培养罐一般情况下搅拌式反应器还常伴有鼓泡，为动物细胞生长提供所需氧分。由于动物细胞对鼓泡的剪切也很敏感，所以须供氧方式上进行改进。笼式供氧是搅拌式动物细胞反应器供氧方式的一种，即气泡用丝网隔开，不与细胞直接接触。这样，反应器既能保证混合效果又有尽可能小的剪切力，以满足细胞生长的要求。 供氧方式的改进搅拌桨的形式对细胞生长的影响非常大，这方面的改进主要考虑如何减小细胞所受的剪切力。例如：采用双螺旋带状搅拌桨，并在顶部法兰盖安装 3块表面挡板。挡板以相对于径向的夹角为 30 垂直插入液面。由于挡板的存在，可有效地减小反应器内液面上的旋涡。 搅拌浆的改进中空纤维反应器因其剪力小被广泛运用于动物细胞的培养。中空纤维反应器主要由 中空纤维管 组成，中空纤维管的内径为 200m ，壁厚为50 70m 。管壁是多孔膜， O2 和 CO2等小分子可以自由透过膜扩散，动物细胞贴附在中空纤维管外壁生长，可以很方便地获取氧气。封闭式中空纤维反应器循环系统2.贴壁培养反应器 中空纤维反应器常见的贴壁培养反应器如：中空纤维反应器、玻璃珠床反应器、陶质矩形通道蜂窝状反应器等类型。3.固定化细胞培养设备细胞到生长后期，其生长速度降低，有利于细胞分化及次级代谢产物积累，则需对其进行固定化培养。固定化培养有利于细胞组织化，易获得高密度细胞群体，易于控制培养条件及获得代谢产物。 平床细胞培养系统平床培养又称为平板培养，该系统是由培养床、储液罐和蠕动泵等部件构成。平床培养系统示意图蠕动泵培养床进液管储液罐将新鲜细胞固定在由聚丙烯材料编织成的无菌平垫（床）上，通过储液罐下方管道滴注培养液。培养床上的培养液再经过蠕动泵循环送回储液罐中。平床细胞培养系统设备较简单，比悬浮细胞培养能更有效地合成次级代谢产物。 立柱细胞培养系统立柱培养系统同样是由培养床、储液罐和蠕动泵等部件构成。立柱培养系统示意图蠕动泵培养床进液管储液罐立柱式细胞培养系统主要用于植物细胞培养。该培养系统是将植物细胞与琼脂或褐藻酸钠混合，制成 2 3cm3的细胞团块，并将其集中于无菌立柱中。这样，由储液罐滴注的培养液流经大部分细胞 “ 滴液区 ” 比例与平床培养系统相比，将大大提高。问题思考与讨论8 5 常见的动物、植物组织细胞培养方法有哪几种？8 6 什么是细胞的固定化培养？8 7 什么是愈伤组织？四、动物细胞工程应用实例20世纪 60年代为了满足生产疫苗的需要，开始运用动物细胞大规模培养技术。后来随着 动物细胞大规模培养技术的逐渐成熟和转基因技术的发展与应用，人们发现利用动物细胞大规模培养技术生产大分子药用蛋白质比原核细胞表达系统更有优越性。1.甲型 H1N1流感疫苗的生产甲型 H1N1流感病毒与其它季节性流感病毒不同，该病毒毒株包含有猪流感、禽流感和人流感三种流感病毒的基因片段。人群对甲型 H1N1流感病毒普遍易感，并可以人传染人。 甲型 H1N1流感病毒 甲型 H1N1流感疫苗的生产流程原始种子（基因重组病毒株） 病毒接种 增殖培养 生产用病毒种子生产前准备病毒接种病毒培养病毒液病毒灭活液 病毒灭活病毒纯化液浓缩纯化配比 分包 疫苗产品病毒培养 原始种子 基因重组病毒株世卫组织提供的 6支甲型 H1N1流感原始毒株 当两种有亲缘关系的不同病毒感染同一宿主细胞时，它们的遗传物质发生交换，结果产生不同于亲代的可遗传的子代，称为基因重组。基因重组病毒有 “ 活病毒基因重组 ” 、 “ 灭活病毒基因重组 ” 及 “ 死活病毒基因重组 ” 。 重组病毒株原始种子属于死活病毒间的重组。基因重组病毒株原始种子保留了病毒的抗原性和复制能力，降低了病毒的致病力（由世卫组织提供）。因为 世卫组织提供的基因重组病毒株 量较少，不足以进行批量生产疫苗，必须对其进行扩增培养，制备病毒种子批。例如：将能在鸡胚中生长良好的甲型流感病毒（ A0或 A1亚型）疫苗株经紫外线灭活后，再加亚洲甲型（ A2亚型）活流感病毒一同培养，产生出具有前者特点的 A2亚型流感病毒，可供制作疫苗。 生产前准备无菌生产鸡胚原始种子（基因重组病毒株） 病毒稀释增殖培养生产用病毒种子选胚接种培养基【 选胚 】培养生产用病毒种子需要无菌生产的 911 日龄鸡胚。要求鸡胚的外壳为白色、整洁，透光性好，在暗室光源的照射下，可以清晰地看到鸡胚里的血管等，这样可以很容易剔除弱胚、死胚等。【 接种、培养 】将稀释后的病毒种入选择的鸡胚尿囊腔中，随后将鸡胚放入密闭、无菌、恒温的孵化箱中繁殖病毒。最后从鸡胚尿囊腔里中液体中得到疫苗生产用的种子。 病毒培养原始种子病毒培养生产用病毒种子生产前准备 病毒接种（鸡胚）病毒液将得到的生产用病毒种子接种到无菌鸡胚中进行培养，得到病毒液。清洗消毒接种病毒灭活灭活试验及其它检验灭活剂 (HC H)病毒灭活液世卫组织提供给疫苗生产厂家的毒种尽管感染性很低，但由于仍然是活的病毒，所以还需要对生产出来的病毒进行灭活处理以去除病毒的致病力。通过往病毒收获液中加入灭活剂（如：甲醛），破坏病毒外壳的酯类成分，使其丧失感染正常细胞的能力。 病毒灭活病毒液病毒收获机在进入下一工序前，须对病毒灭活液进行灭活试验，确保疫苗已经灭活 得到病毒灭活液。O2 87 10D 病毒灭活液中有很多的杂质，必须加以纯化，以保留病毒作为疫苗的有效成分 抗原，去除病毒灭活液中的其它杂质，避免这些杂质对人体产生不良反应。病毒灭活液的浓缩纯化有多条路线可走。例如： 浓缩纯化病毒灭活液 浓缩液超滤浓缩 层析蔗糖液or密度梯度离心法层析液病毒灭活液超滤蔗糖洗脱裂解超滤液裂解剂除菌过滤病毒纯化液配比分包疫苗产品病毒纯化液检定抗体是由 B淋巴细胞 分化形成的浆细胞合成、分泌的。每一个 B淋巴细胞在成熟的过程中通过随机重排只产生识别一个抗原的抗原受体基因。动物 脾脏 有上百万种不同的 B淋巴细胞系，重排后具有不同基因不同的 B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受 抗原 刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的 B细胞 。被激活的 B细胞分裂增殖形成效应 B细胞（浆细胞）和记忆 B细胞，大量的浆细胞 克隆 合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中。如果能选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群 单克隆。单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体 。 单克隆抗体是由一种类型的 细胞 制造出来的抗体。浆细胞2.HBsAg单克隆抗体的生产 单克隆抗体 单克隆抗体要制备单克隆抗体，首先需获得能合成专一性抗体的单克隆 B淋巴细胞，但这种 B淋巴细胞不能在体外生长。 单克隆抗体 技术的基本原理B细胞 HGPRT+ HGPRT 骨髓瘤细胞融合(HAT)培养基HGPRT+HGPRT存活的杂交瘤长期体外培养死亡有氨基蝶呤死亡实验发现骨髓瘤细胞可在体外生长繁殖，应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，既具有 B淋巴细胞合成专一抗体的特性，又有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。HGPRT：次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶HAT：次黄嘌呤 氨基蝶呤 胸腺嘧啶待融合用骨髓瘤细胞（准备）脾淋巴细胞制备 HBsAg单克隆抗体的生产流程抗乙型肝炎表面抗原 (HBsAg)单克隆抗体是专一识别 HBsAg的单一抗体，能与 HBsAg产生免疫反应。运用免疫大鼠脾淋巴细胞与大鼠骨髓瘤的 IR983F细胞融合技术制造抗 HBsAg单克隆抗体的生产流程如下：健康大鼠(处死 )饲养细胞制备脾脏大鼠骨髓瘤(IR983F细胞 ) 细胞融合饲养备用细胞培养浓缩纯化冻干抗 HBsAg单克隆抗体（精品）生产前准备【 抽取细胞液 】先将大鼠处死，并向其腹腔内注射 10mLDMEM培养液，轻压腹腔使细胞悬浮，吸出全部细胞悬浮液。【 细胞分离 】离心分离 5min，用 0.1mol/L磷酸缓冲液（ p