t载体-b载体与pcr克隆困扰

T载体-B 载体与 PCR克隆困扰 盘古基因 李万波 PCR 技术给基因工程带来了巨大的变革，生物学家可以配合 DNA 内切酶 随意放大、克隆基因。 一、T-载体与 B-载体 PCR 产物的克隆技术也得到了长足发展，T/A 克隆载体（简称“T 载体” ） 就是上世纪末发展起来的。Taq 酶是第一个被克隆的嗜热菌 DNA 聚合酶，由 于发现了 Taq 酶具有不依赖 DNA 模板的核苷酸末端转移酶活性，能够给双链 DNA 的 3-末端添加 1 个碱基，所以 T/A 克隆技术应运而生。Taq 酶在 dNTP 俱全的情况下，优先添加 1 个 A 碱基（3-A Protruding）, 当只有其 它某个碱基时，她就退而求其次，也能加上 1 个其它碱基，比如“dTTP” 。 PCR 产物的平端连接效率本来很低，这是因为常规合成的寡核苷酸引物 5-端不带磷酸， T4 DNA 连接酶只能将 DNA 链的 3-OH 和另一 DNA 链 的 5-P(磷酸基团) 相连。DNA 内切酶切开的平末端 5带有磷酸基，只有这 条链能与 PCR 产物的 3-OH 发生连接反应，另一条链没有粘性。T/A 克隆时 也一样，只能连接单链，另一条链上的缺口（Nick）需要受体菌（Host Bacteria）体内的激酶和连接酶帮助修补，才能成为完整的环状质粒，完成滚 环复制，抵抗筛选压（抗生素毒性） 。所以，如果质粒转化感受态菌后的 37 温育不够 1 小时，菌落数是会减少的。 上世纪 80 年代，拓扑异构酶 1B 的发现使得 PCR 产物的平端克隆技术 （Blunt-end cloning vector, B-载体）取得了巨大改进。拓扑异构载体对平末 端的连接速度和效率至今无可匹敌。这类载体有盘古基因的 pACK4a 系列、原 核表达载体 Topoied 系列、哺乳类载体 Topoied 系列，此外还有 Invitrogen 和全式金的相应载体。该类载体由于 Topoisomerase Ib 的微弱的记忆功能， 需要 PCR 引物的 5第一个碱基尽量与载体处理前切除的 5端碱基相同，这 样才能获得近乎 100%的克隆率。通常由于受 PCR 退火温度的限制，引物设计 时 5-添加 1 个“A“碱基是较少影响引物的 Tm 值的。5端添加 G 或 C 则 会显著增加 Tm。 上世纪与 TOPO 载体同时发展起来的还有 “同源重组“克隆技术，由于其 需要 PCR 引物的 5端附加较长的同源尾巴（与模板不配对的） ，一直不能被 广泛接受，因为长达 15 个以上附加碱基的引物常常会使 PCR 困难（增加非特 异性扩增的机会，分散了 PCR 酶精力，使主条带变弱） 。但该技术在 DNA 序 列拼接和点突变方面有其长处。 二、PCR 酶 PCR 酶就是 DNA 聚合酶（DNA Polymerase） 。 PCR 酶按其掺入错误几率来分，有高保真酶和 Taq 酶。 高保真酶的 Error Rate 在 1/100 万，即每聚合 1 百万个碱基时，可能出 现 1 个掺入错误；而 Taq 酶的错配率在 5/10 万。 市场上的常见高保真酶种类很多： 有 Pab、Pfu、Pwo、 Kod 等，以 Pab 的错配率最低（ 0.66 x 10-6）, 耐 热程度最高（100煮沸 5 小时，还有 80%活性） 。 目前市场上的 PCR 酶按其组成成份来区分，可分为下列几种： 1、纯高保真酶： 扩增速度较慢，保真性最高，但扩增长度 4-6kb； 2、纯 Taq 酶： 扩增速度较快，但峰值仅 4kb 左右； 3、嵌合分子 PCR 酶： 如 NEB 的 Phusion，PangoGene 的 Paq 等，这 类 PCR 酶集保真性、速度、长度于一身，保真性强于 Taq，扩增长度可达 810kb。 4、混合 PCR 酶（Blend DNA Polymerase）：高保真酶由于 35 外 切酶活性， “能进能退“，常常进 3 步退 2 步，所以，其总体聚合速度慢 （30 60 bases/sec） ，但其具有修改错误的能力；Taq 酶的聚合速度快 （80 120 bases/sec）, 但”不细心“，常常拿错了碱基，一旦发生了掺入 错误，她就会停下来等待，由于其没有 35外切酶活性，所以，要么就” 将错就错“掺入，要么就撒手逃跑，留下没有完成的残缺链。但如果与高保真 酶配合，其高速度得以实现，Taq 酶是长跑健将，高保真酶充当交通警察，两 者合并，实现了高速度和长度的优势。 5、融合蛋白 PCR 酶：这类酶是 PCR 酶与 DNA 结合蛋白的基因融合的产 物，融合的 PCR 酶可以是纯一酶，亦可以是嵌合酶。这类 PCR 酶的最大特点 是- 快！ 超快！同时还提高了保真性。这类酶有 fPab、fPfu、fKod、fK21 、fPaq 等高保真酶，也有 frTaq、fcrTaq、fsdTaq、fcdTaq 等 Taq 系列快酶和超快酶。 三、PCR 酶带给克隆载体的困惑 很多国内 PCR 酶生产厂家（包括中外合资的试剂厂家）使用了混合酶，但 并不注明，害怕失去竞争优势。但这些酶造成了实验者克隆试剂应用上的困惑。 混合酶中含高保真酶，其 PCR 产物两端的形状分为 3 类： 1） DNA 链的两端均为平末端； 2） DNA 链的两端均为 A 突出； 3） DNA 链的一端是平末端，另一端是 A 突出。 以上 3 种产物的含量比例随保真酶与 Taq 酶的比例变化而变化。但是，你 会发现这类 PCR 产物无论对 T-载体还是 B-载体都是部分匹配的，直接 PCR 产 物克隆，连接效率会打折扣。 厂家如果不公开他的 PCR 酶特性，或者怕说明有 A 突出（好像有 A 突出 就是保真性不高） ，生物科学家们如何判断呢？一般来说，纯高保真酶通常扩长 是 4 6kb，扩速是 1-2 分钟/kb; 纯 Taq 酶是扩长 45kb, 扩速也是每 kb 12 分钟。如果不是融合酶或嵌合酶，要想扩长达到 810kb 或10kb, 延 伸速度在扩增 2kb 以上 DNA 片段时，1 分钟/kb, 它很可能就是混合 PCR 酶。 混合 PCR 酶产物直接克隆时，效率低于纯酶、融合酶和嵌合酶，这类酶的 PCR 产物在经过纯化后，抹平两端或加 A 后再与 B-载体或 T-载体连接，效果 显著。 四、PCR 产物胶回收后或离心柱纯化浓缩后，为什么克隆连接效率明显下降？ 这个问题其实很简单，问题出在试剂与离心柱上。溶胶液(或 DNA 结合促进液) 中含有“离液盐“，如盐酸胍、异硫氰酸胍、碘化钠、高氯酸钠等是强力蛋白 质变性剂，膜上会有微量残留；大部分离心柱底部的压膜环较厚（如 QIAGEN） ，角砖头离心机条件下，微型离心柱底部侧方会有 23 微升的液体 残留，造成离液盐残留，直接抑制连接酶和拓扑异构酶活性，使得克隆连接效 率降低。 处理这个问题的一般方法是：离心柱洗脱下来的 DNA 产物再经过酚氯仿抽提 1 次，然后加乙酸钠和乙醇沉淀，