盐负荷和醛固酮诱导乳鼠原代心肌细胞肥大的实验研究

-精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 1 盐负荷和醛固酮诱导乳鼠原代心肌 细胞肥大的实验研究 摘要 目的 探讨盐负荷和醛固 酮对乳鼠原代心肌细胞肥大的协同作用。 方法 原代培养乳鼠心肌细胞，随机分 为正常对照组、醛固酮 107 mol/L（Ald）组、等钠浓度 140 mmol/L（NS）组、高钠浓度 146 mmol/L（HS）组、等钠浓度 140 mmol/L+Ald 107 mol/L（NS+Ald）组、 高钠浓度 146 mmol/L+Ald 107 mol/L（HS+Ald）组；其中 NS+Ald 与 HS+Ald 组先不加 Ald，培养 48 h 后， 加入 Ald，所有处理组继续培养 24 h。 免疫荧光法测定心肌细胞横截面积差异， 细胞活性实验（CCK-8）检测其活性， -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 2 流式细胞仪检测细胞凋亡率，荧光定量 PCR 检测内皮素-1 （ET-1） 、一氧化氮 合酶（eNOS）mRNA 表达的差异。 结 果 NS+Ald 组及 HS+Ald 组心肌细胞横 截面积较 Ald 组、NS 组、 HS 组明显 增加（P 中国论文网 /6/view- 12954836.htm 关键词 盐负荷；醛固酮；心肌 细胞；基因表达；凋亡 中图分类号 R332 文献标识码 A 文章编号 1673-7210（2017） 10（a）-0013-04 Abstract Objective To investigate the synergistic effects of salt loading and aldosterone on hypertrophy of primary cardiomyocytes in neonatal rats. Methods Neonatal rat cardiomyocytes were culturedin the experiment， the cell was divided into normal control group， Aldosterone 10-7 mol/L （Ald） group， normal sodium concentration 140 mmol/L （NS） group， high sodium -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 3 concentration 146 mmol/L （HS ） group， 140 mmol/L+Ald 10-7 mol/L （NS+Ald） group， 146 mmol/L+Ald 10-7mol/L （HS+Ald） group. At first Ald was not added into （NS+Ald） group and （HS+Ald） group， after 48 h culture， Ald was added， then all treatment groups were continued to culture for 24 h. The difference of myocardial cross-sectional area was measured by immunofluorescence. The survival rate was detected by CCK-8. The apoptosis rate was detected by flow cytometry. ET-1 and eNOS mRNA expressions were assayed by qRT-PCR. Results The cross- sectional area of myocardial cells in NS+Ald group and HS+Ald group were significantly higher than Ald group， NS group， HS group. Compared with normal control group， the survival rate of cardiomyocytes decreased significantly （P 98%可行后续实验。 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 4 1.4 免疫荧光法测定盐负荷和醛 固酮对心肌细胞横截面积的影响 以 1105/mL 将心肌细胞接种于 6 孔板，3 个复孔/组，24 h 后 DMEM 培养液同步化细胞；实验分为正常对照 组、醛固酮 107 mol/L（Ald）组、等 钠浓度 140 mmol/L（NS）组、高钠浓 度 146 mmol/L（HS ）组、等钠浓度 140 mmol/L+Ald 107mol/L（NS+Ald）组、 高钠浓度 146 mmol/L+Ald 107 mol/L（HS+Ald）组；其中 NS+Ald 组 与 HS+Ald 组先不加 Ald，培养 48 h 后， 再加入 Ald，所有处理组继续培养 24 h。余操作同细胞鉴定，荧光显微镜观 察细胞形态。实验重复 3 次，ImageJ 1.46r 软件计算心肌细胞面积。 1.5 CCK-8 法实验检测心肌细胞 存活率 以 5104/mL 将心肌细胞接种于 96 孔板，分组同“1.4”，不同实验组同 步化细胞 72 h，设立不加细胞的调零孔， 按试剂盒说明书添加 CCK-8 溶液并检 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 5 测吸光度。6 个复孔/组，实验重复 3 次。 细胞存活率（%）=A （不同处理）- A（调零）/A （正常对照） -A（调零） 100%。 1.6 流式细胞仪检测心肌细胞凋 亡率 细胞分组同“1.4”，收集上清液。 测定及结果判断按 Annexin V-FITC 细 胞凋亡检测试剂盒说明书进行7。 1.7 qRT-PCR 检测不同处理组的 心肌细胞中内皮素 -1（ET-1 ） 、一氧化 氮合酶（eNOS）mRNA 表达的影响 细胞分组同“1.4”。提取总 RNA，电泳对所得 RNA 检测其完整性， OD260280 在 1.82.0 为符合浓度及 纯度。逆转录聚合酶链式反应，引物 由上海生工生物公司采用 Batch Primer 3 软件设计并合成，序列为（53）： ET-1 上游： CTGGACATCATCTGGGTCAA，下游： CTGTTCCCTTGGTCTGTGGT；eNOS -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 6 上游： TTCCGGCTGCCACCTGATCCTAA， 下游： AACATGTGTCCTTGCTCGAGGCA； GAPDH（内参基因）上游：GAAG？ 鄄 GGCTCATGACCACAGT，下游： GGATGCAGGGATGAT？鄄 GTTCT。cDNA 按逆转录试剂盒说明书 进行，反应条件：合成变性 94 3 min，扩增 94 30 s，退火 30 s（ET-1 55.0；eNOS 54.0；GAPDH 55.0） ， 延伸 7245 s，30 次循环，终末延伸 72 10 min。待测基因 mRNA 相对表 达量（2-CT ）=待测基因/GAPDH 比 值。IQ5 Real Time PCR 系统进行检测。 1.8 统计学方法 采用统计软件 SPSS 16.0 对数据 进行分析，正态分布的计量资料以均数 标准差（xs ）表示，多组间比较采用 方差分析，两两比较采用 LSD-t 检验及 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 7 Tukey 法。两组之间相关性采用 Pearson 相关分析。以 P 0.05） ； NS+Ald 组及 HS+Ald 组的心肌胞横截面积增加明 显（P 0.05） 。Pearson 相关分析显示， Ald 组/NS 组 /HS 组心肌细胞横截面积 分别与 NS+Ald 组、HS+Ald 组呈现明 显的正相关（0.689r0.852，P 0.05） ， NS+Ald 组（77.640.11）%和 HS+Ald 组（67.970.12）%心肌细胞存活率显 著降低（P 0.01） 。 2.3 不同细 胞条件培养液对心肌细胞凋亡的影响 正常对照组与 NS 组均现少量的 心肌细胞凋亡，与正常对照组比较， Ald 组、HS 组、NS+Ald 组及 HS+Ald 组的心肌细胞存在不同程度的凋亡（P 0.01） ，随着盐负荷增加，心肌细胞凋 亡率明显上升；且给予醛固酮刺激后， 心肌细胞凋亡率也显著上升。见图 2。 2.4 不同细胞条件培养液对心肌 细胞 ET-1、eNOSmRNA 表达的影响 qRT-PCR 表明：与正常对照组比 较，NS 组 ET-1 mRNA 表达差异不大， -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 8 Ald 组、HS 组、NS+Ald 组和 HS+Ald 组 ET-1 mRNA 表达水平有所增加，除 HS 组外，其余组 ET-1 mRNA 表达明显 增高（P 0.05） ，其中以 HS+Ald 组最 为显著（P 0.01） （图 3A） 。eNOS mRNA 表达呈现与 ET-1 mRNA 相反趋 势，与正常对照组比较，除 NS 组 eNOS mRNA 表达无显著性差异外， Ald 组、HS 组、NS+Ald 组和 HS+Ald 组 eNOS mRNA 表达均呈现下降趋势 （P 0.01 或 P 0.05） ，其中以 HS+Ald 组最为显著（P 0.01） （图 3B） 。 3 论 研究提示，心脏系醛固酮的一个 重要效应器官8-10，醛固酮可通过控 制离子平衡来增加心肌细胞中 Na+-K+- ATP 酶、Na+内流及 Na+-K+交换活性 11；其中，心肌细胞中 ET-1、eNOS 等重要因子可通过肾素-血管紧张素系 统调节心脏血液动力学导致血压的变化， 从而促进心肌肥大，引起心肌重构。动 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 9 物实验结果表明12 ，食盐量5 g/d 时， 醛固酮对心肌无任何损害作用，即食盐 或许作为重要因素参与醛固酮作用的心 肌细胞肥大，并起到协同作用。 心肌肥大是当心脏受到多种压力 刺激下，长期超负荷工作所导致的一种 慢性代偿性的病理改变13。实验结果 显示了氯化钠与醛固酮对心肌细胞肥大 的协同作用，分析原因为：心肌细胞内 Na+浓度增加，激活胞内 Na+/Ca2+交换 体14，反向转运引起胞内 Ca2+的超载、 进入心肌细胞与其受体相结合，造成心 肌结构重建、心肌细胞肥大。 心肌细胞凋亡是促使心肌细胞肥 大失代偿期转化为心力衰竭至关重要的 部分15。结果中， NS+Ald 组和 HS+Ald 组的心肌细胞存活率及凋亡率 变化最为显著，表明盐负荷和醛固酮的 协同作用，导致心肌细胞出现广泛钠潴 留、交感系统被激活、心肌细胞结构出 现变异、心肌重塑，形成一个恶性循环 16。 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 10 正常心肌细胞通过表达 eNOS 合 成一氧化氮，持续抑制 eNOS 活性等导 致 eNOS 缺失会引发实验鼠的心肌肥大 17-19。ET-1 是极具典型意义的血管活 性物质，可与其特异性的受体结合，参 与心肌肥大的病理过程20。本结果表 明，eNOS 的表达下调及 ET-1 表达上升 可能为诱导心肌细胞肥大的作用靶点，