不同产地桔梗的聚丙烯酰胺凝胶电泳指纹图谱鉴别研究

不同产地桔梗的聚丙烯酰胺凝胶电泳指纹图谱鉴别研究 石俊英， 巩丽丽， 张会敏 摘要： 目的 建立不同产地桔梗药材的聚丙烯酰胺凝胶电泳( PAGE)指纹图谱鉴 别方法。方法 蛋白质( Pro) 、过氧化物酶同工酶( POD) 、酯酶同工酶( EST) PAGE 指纹图谱分析。结果 不同产地桔梗的Pro- PAGE图谱差异极小； POD- PAGE 与EST-PAGE 图谱在谱带分布及数量上均具有显著性差异， 分别具有 各自的鉴别谱带。结论 POD-PAGE 与EST-PAGE指纹图谱可作为鉴别不同产 地桔梗的有效方法。 关键词： 桔梗； 蛋白质-聚丙烯酰胺凝胶电泳； 过氧化物酶同工酶-聚丙烯 酰胺凝胶电泳； 酯酶同工酶-聚丙烯酰胺凝胶电泳； 指纹图谱 中药桔梗为桔梗科植物桔梗Platycodon grandif lorum ( Jacq) A.DC . 的干燥 根 1 ， 具有宣肺、利咽、祛痰、排脓的功效。桔梗是山东的地产药材， 种植 历史悠久， 以其产量大、质量好而闻名全国。1991年国际种子检验协会将蛋白 质电泳方法正式定为标准的品种鉴定方法， 表明了蛋白质电泳方法在干燥种子 鉴定和纯度检测中的地位 2 。蛋白质是植物基因表达的产物， 不同的品种、 杂交种具有不同的谱带模式， 因而可以将品种区分开来。我们将蛋白质电泳技 术应用于中药鉴定， 并做了大量的实验研究 3-7 。为了规范桔梗的栽培技术， 优化道地药材的品种， 进行了不同产地桔梗的可溶性蛋白( Pro)、过氧化物酶 ( POD )和酯酶同工酶( EST)的聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE指纹图谱分析， 旨在 为桔梗的种质资源鉴定和开发提供科学依据。 1 仪器、试剂与材料 11 仪器 DYY -稳流稳压电泳仪( 北京六一仪器厂 ) ； DYY-28型电泳仪槽( 北京 六一仪器厂)； EDAS-290凝胶成像紫外分析仪(北京市新技术应用研究所) ； LGR16-W 高速冷冻离心机 (北京医用离心机厂) ； FA1104 型电子天平( 上海 天平仪器厂) ； 旋片真空泵( 1 400 rm in -1 ) (浙江黄岩求精真空泵厂)。 12 试剂 三羟甲基氨基甲烷、丙烯酰胺、过硫酸铵、N,N -亚甲基双丙烯酰胺、甘氨 酸、考马斯亮蓝R 250、醋酸联苯胺、监牢兰、四甲基乙二胺、溴酚蓝等所用试 剂均为分析纯。 1.3 实验材料 实验样品的产地、采收时间、生长年限等参见表1。经山东中医药大学药学 院石俊英教授鉴定为桔梗Platycodon grand if lorum ( Jacq. )A.DC. 。 2 方法与结果 21 Pro-PAGE 图谱分析 211 电泳实验 样品制备、凝胶制备、电泳操作、染色与保存参照文献 5进 行。其中1年生的6个桔梗样品为A 组， 2年生的5 个桔梗样品为B 组， 分别点 于两块电泳凝胶板上。POD-PAGE， EST-PAGE 电泳实验样品分组与此相同。 212 Pro-PAGE图谱处理 将脱去底色的样品凝胶板通过凝胶成像紫外分析 仪( e lectrophoresis documentat ion and ana lysis system ) 扫描成PAGE 指纹图谱 并进行聚类分析， 得PAGE 电泳指纹图谱。各组Pro-PAGE 电泳图谱见图1。 22 POD-PAGE 图谱分析 221 电泳实验 样品制备、凝胶的制备、电泳操作、染色与保存参照文献 5 进行。 222 POD-PAGE图谱处理 操作同“2.2.1”。各组POD-PAGE 图谱见图2。 23 EST-PAGE 图谱分析 231 电泳实验 样品制备、凝胶的制备、电泳操作、染色与保存参照文献 5 进行。 232 EST-PAGE图谱处理 操作同“2.1.2”。各组 EST-PAGE图谱见图3。 3 讨 论 31 由图1 3中的可以看出不同产地桔梗的蛋白质PAGE指纹图谱差异极小， 相同蛋白质条带对应的泳动率差异非常小， 均在系统误差允许范围之内。蛋 白质是植物基因表达的产物， 不同的品种、杂交种具有不同的蛋白质谱带模式， 因而可以确定8个不同产地桔梗样品为同一品种。另外， 凝胶板A ，B 为不同 生长年限桔梗的Pro-PAGE 图谱， 但是Pro-PAGE 指纹图谱一致， 进一步证 明遗传物质蛋白质的谱带模式的稳定性。由图1 3中的可以看出11个样品的 相似度在95.24% 100%之间， 如果不存在系统误差， 那么样品之间的相似度 会更接近100%。由此可见， Pro-PAGE 指纹图谱不能鉴别同一品种的桔梗药 材。 32 同工酶是基因的直接产物， 能较准确地反应基因的存在状况和表达规律。 A， B 两组POD-PAGE ，EST-PAGE指纹图谱中各个产地的桔梗药材所含过氧 化物酶、酯酶均有所不同， 即可以通过建立不同产地POD-PAGE， EST- PAGE 的指纹图谱来鉴别不同产地桔梗药材。 33 蛋白质、酶类都是植物遗传物质的直接表达产物。用Pro-PAGE 电泳指纹 图谱可以有效的鉴别植物的品种， 为中药的品种鉴别， 尤其是变种之间的鉴 别提供一种可靠、科学的鉴别方法。此外， POD-PAGE， EST-PAGE 指纹图 谱又可以用来鉴别不同产地的药材。PAGE 方法具有快速准确、操作简便、稳 定性和重现性好等优点， 且实验成本较低， 适合大范围的推广应用。 REFERENCES 1 Ch.P ( 2005 ) Vol (中国药典2005 年版一部) S .2005：196. 2 WU M S， WANG S C， DA I JR.App licat ion of f ingerprin t ing techn ique in cu ltivar id ent if icat ion and pu rity test J .J Agric Biotechnol(农业生物技术学 报) ， 1998， 6( 1 )： 51-56. 3 SH I JY， YU Y L， LU Y.A pp licat ion of m olecular b iological tech ique in app ais ing variet ies of L onicear ja rp onica J . J Shandong Univ of TCM (山东中 医药大学学报) ， 2001， 25 ( 2 ) ： 137-138. 4 SH I J Y， LU Y， LI B W. S tud ies on ident ification of variet ies of Rad ix Glehn iae by gel eletrophores is f ingerp rint J .J Chin Pharm (中国药学杂志) ， 2003，38( 3) ： 171-173. 5 SH I JY， LU Y， XU L C， et a l. Study on the eiectrophoresis fingerprin ts of th ree groups of trad itionalCh inese drugs J .J ChinMed Ma ter (中药材) ， 2002， 25( 12 )： 864-868. 6 LU Y， SH I J Y. S tud ies on ident ification of five prunus by geleletrophores is f ingerp rint J .Shandong Med Ind J (山东医药工业 ) ， 2