从一级序列预测蛋白质分子的三级结构并进一步预测其功能

从一级序列预测蛋白质分子的三级结构并 进一步预测其功能，是极富挑战性的工作。 研究蛋白质折叠，尤其是折叠早期过程， 即新生肽段的折叠过程是全面的最终阐明 中心法则的一个根本问题，在这一领域中， 近年来的新发现对新生肽段能够自发进行 折叠的传统概念做了根本的修正。这其中， X 射线晶体衍射和各种波谱技术以及电子 显微镜技术等发挥了极其重要的作用。第 十三届国际生物物理大会上，Nobel 奖获得 者 Ernst 在报告中强调指出，NMR 用于研 究蛋白质的一个主要优点在于它能极为详 细的研究蛋白质分子的动力学，即动态的 结构或结构的运动与蛋白质分子功能的关 系。目前的 NMR 技术已经能够在秒到皮秒 的时间域上观察蛋白质结构的运动过程， 其中包括主链和侧链的运动，以及在各种 不同的温度和压力下蛋白质的折叠和去折 叠过程。蛋白质大分子的结构分析也不仅 仅只是解出某个具体的结构，而是更加关 注结构的涨落和运动。例如，运输小分子 的酶和蛋白质通常存在着两种构象，结合 配体的和未结合配体的。一种构象内的结 构涨落是构象转变所必需的前奏，因此需 要把光谱学，波谱学和 X 射线结构分析结 合起来研究结构涨落的平衡，构象改变和 改变过程中形成的多种中间态，又如，为 了了解蛋白质是如何折叠的，就必须知道 折叠时几个基本过程的时间尺度和机制， 包括二级结构（螺旋和折叠）的形成，卷 曲，长程相互作用以及未折叠肽段的全面 崩溃。多种技术用于研究次过程，如快速 核磁共振，快速光谱技术（荧光，远紫外 和近紫外圆二色） 。 一、新生肽段折叠研究中的新观点 长期以来关于蛋白质折叠，形成了自 组装（self-assembly）的主导学说，因此， 在研究新生肽段的折叠时，就很自然的把 在体外蛋白质折叠研究中得到的规律推广 到体内，用变性蛋白的复性作为新生肽段 折叠的模型，并认为细胞中新合成的多肽 链，不需要别的分子的帮助，不需要额外 能量的补充，就应该能够自发的折叠而形 成它的功能状态。 1988 年，邹承鲁明确指出，新生肽段 的折叠在合成早期业已开始，而不是合成 完后才开始进行，随着肽段的延伸同时折 叠，又不断进行构象的调整，先形成的结 构会作用于后合成的肽段的折叠，而后合 成的结构又会影响前面已形成的结构的调 整。因此，在肽段延伸过程中形成的结构 往往不一定是最终功能蛋白中的结构。这 样，三维结构的形成是一个同时进行着的， 协调的动态过程。九十年代一类具有新的 生物功能的蛋白，分子伴侣（Molecular chaperone）的发现，以及在更广泛意义上 说的帮助蛋白质折叠的辅助蛋白(Accessory protein) 的提出，说明细胞内新生肽段的折 叠一般意义上说是需要帮助的，而不是自 发进行的。 二，分子伴侣的作用机制 分子伴侣的作用机制实际上就是它如 何与靶蛋白识别，结合，又解离的机制。 有的分子伴侣 具高度专一性，如一些分子 内分子伴侣，还有细菌 Pseudomonas cepacia 的酯酶，有它自己的“私有分子伴 侣” 。它是由基因 limA 编码的，与酯酶的 基因 LipA 只隔 3 个碱基，可能是进化过程 中发生的基因分裂造成的。而一般的分子 伴侣识别特异性不高，它是怎样识别需要 它帮助的对象的呢？现在只能说分子伴侣 识别非天然构象，而不去理会天然的构象。 由于在天然分子中，疏水残基多半位于分 子的内部而形成疏水核，去折叠后就可能 暴露出来，或者在新生肽段的折叠过程中， 会暂时形成在天然构象中本应该存在于分 子内部的疏水表面，因此认为分子伴侣最 有可能是与疏水表面相结合，如硫氰酸酶 （Rhodanese）分子 -helix 的疏水侧面。 但是只有 -sheet 结构的蛋白质才可为分 子伴侣识别。 最近关于识别机制有较大的进展。Bip 是内质网管腔内的分子伴侣，用一种 affinity panning 的方法检查 Bip 与有随机序 列的十二肽结合的特异性，结果发现，Hy- (W/X)-Hy-X-Hy-X-Hy motif 与 Bip j 结合最 强，Hy 最多的是 Trp、Leu、Phe，即较大 的疏水残基。一般来说，2-4 个疏水残基就 足够进行结合。还有一种较普遍的说法是 分子伴侣识别所谓熔球体结构 （moltenglobule） 。另一方面，分子伴侣本 身与肽结合部位的结构分析最近也有些进 展。譬如，PapD 的晶体结构表明，多肽结 合在它的 -sheet 区。GroEL 中，约 40kD 的 153-531 结构域是核苷酸的结合区。 分子伴侣作用的第二步是与靶蛋白形 成复合物。非常盛行的一种模型认为分子 伴侣常常以多聚体形式而形成中心空洞的 结构，用电子显微镜已经观察到由二圈层 圆面包圈形组成的十四体 GroEL 分子和一 个一层圆面包圈的七体 GroES 分子协同作 用形成中空的非对称笼状结构（cage model） ，推测靶蛋白可以在与周围环境隔 离的中间空腔内不受干扰的进一步折叠。 但是不久前一个日本实验室发现 GroEL 的 一个亚基，甚至其 N 端去除 78 个氨基酸残 基的 50kD 片段，已经不能再组装成十四体 结构，都有确定的分子伴侣功能。由此， 我想:也许环状分子伴侣并非每个部位都是 有效的结合部位，也就是说，该二层圆面 包圈组成的十四体 GroEL 分子只有一个或 若干个部位能够与疏水残基或所谓的熔球 体结构结合，而其余部位起识别作用，就 像一个探测器一样，整个十四体 GroEL 分 子以圈层或笼状结构”包裹”在多肽链的 主链上，以旋进方式再多肽链的链体上运 动，一旦环状多聚体的某一识别部位发现 疏水结构或所谓的熔球体结构等新生肽链 折叠过程中暂时暴露的错误结构，经信号 转导，多聚体的结合部位便与之结合，生 成复合物，抑制不正确的折叠。以上完全 是我个人的猜想，是基于上述两个试验现 象的矛盾而试图作一番解释。至于为什么 假设以旋进方式在多肽链上运动，我并没 有相应的根据，只是觉得这应该是一个动 态过程，因此作了一番狂妄的假想,另外， 我觉得也许可以用 X 射线衍射来探测一下 分子伴侣 GroEL 和 GroES 组成的笼状结构， 看看它的 abc 是否足以容纳多肽链的 某一段，或者它的内部和外部的疏水性质 和其他一些物化性质如何，也许可以找到 支持或驳斥上述假设的证据。 以上谈的都是蛋白质的分子伴侣。不 久前又出现了一个新名词“DNA chaperones”，DNA 分子伴侣，这种分子伴 侣是与 DNA 相结合并帮助 DNA 折叠的。 在这种复合物中，DNA 分子包围在蛋白质 分子的表面，既是高度有序的，又是在一 定程度上结构已有所改变的。DNA 与蛋白 的这种相互作用对 DNA 的转录，复制以及 重组都十分重要;或如在核小体中，对 DNA 的包装是必须的。DNA 在溶液中的结构有 相当的刚性，必须克服一个能障才能转变 成它的蛋白复合物中的结构，分子伴侣的 作用就是帮助 DNA 分子进行折叠和扭曲， 从而把 DNA 稳定在一个适合于和蛋白结构 的特定构型中。这种结合是协同的，可逆 的在形成复合物之后便解离下来。因此， 不论是 DNA 分子伴侣还是蛋白分子伴侣， 都与 DNA 和蛋白的相互作用有关，与基因 调控有关，看来，分子伴侣确实与最终阐 明中心法则当前主要问题有密切关系。 论文百事通 三、蛋白质分子的折叠和分子伴侣的作用 蛋白质分子的三维结构，除了共价的 肽键和二硫键，还靠大量极其复杂的弱次 级键共同作用。因此新生肽段在一边合成 一边折叠过程中有可能暂时形成在最终成 熟蛋白中不存在不该有的结构，他们常常 是一些疏水表面，它们之间很可能发生本 不应该有的错误的相互作用而形成的非功 能的分子，甚至造成分子的聚集和沉淀。 按照自组装学说，每一步折叠都是正确的， 充分的，必要的。实际上折叠过程是一个 正确途径和错误途径相互竞争的过程，为 了提高蛋白质生物合成的效率的，应该有 帮助正确途径的竞争机制，分子伴侣就是 这样通过进化应运而生的。它们的功能是 识别新生肽段折叠过程中暂时暴露的错误 结构的，与之结合，生成复和物，从而防 止这些表面之间过早的相互作用，阻止不 正确的非功能的折叠途径，抑制不可逆聚 合物产生，这样必然促进折叠向正确方向 进行。 （从哲学的观点说，似乎很容易驳斥 自组装学说，它违背了矛盾的普遍性原理， 试想，如果蛋白质的每一步折叠均是正确 的，充分的，必要的，岂不是在无任何矛 盾的前提下，完成了复杂的最稳定构象的 形成，即完成了由量变到质变的伟大飞跃， 从无活性的肽链变成有活性的功能蛋白， 这显然是违背哲学基本原理的。换一个角 度想，生物进化的过程本来就充满着不定 向的变异，这些变异中有适应环境的，也 有不适应环境的， “物竞天择” ，自然的选 择淘汰了那些不适应的，保留了那些适应 的。蛋白质分子的折叠不也与此类似吗？ 我想，蛋白质的一级结构只是肽链折叠并 形成功能蛋白的特定三维结构的内因，实 际上，多肽链在形成活性蛋白的每一步， 都有潜在的可能形成“不正确”的折叠， 如果没有象分子伴侣或其它帮助蛋白等外 部因素的作用，多肽链也永远不能折叠成 为活性蛋百。 ） 四、分子伴侣的结构 目前唯一解出晶体结构的分子伴侣是 E.coli 的 PapD，帮助鞭毛蛋白折叠的分子 伴侣。还有 HSP70 的 N 端结构域，即 ATP 结合域也以有晶体结构。用电子显微镜已 经清楚的看到了 GroEL 的十四聚体和 GroEL 的七聚体的四级结构， 象两个圆形 中空的面包圈叠在一起，用 NMR 以及各种 溶液构象变化是研究分子伴侣作用机制的 有效手段。 五、分子伴侣和酶的区别 与分子伴侣不同，以确定为帮助蛋白 质折叠的酶目前只有两个，一个是蛋白质 二硫键异构酶(protein disulfide isomerase，PDI); 另一个是肽基脯氨酸顺反 异构酶(peptidyl prolyl cis-trans isomerase，PPI)。以 PDI 为例，众所周知， 蛋白质分子中的二硫键与新生肽段的折叠 密切相关，对维系蛋白质分子的结构稳定 性和功能发挥也有重要作用。PDI 定位在内 质网管腔内，含量丰富，催化蛋白质分子 内巯基与二硫键之间的交换反应。同时， 它是目前发现的最为突出的多功能蛋白， 除了二硫键的异构酶的基本功能外，它还 是脯氨酸-4-羟化酶的 亚基 ;又是微粒体 内甘油三酯转移蛋白复合物的小亚基，还 是一种糖基化位点结合蛋白(gkycisylation site binding protein)等。其中，最引人注目 的还是它有与多肽结合的能力，可以结合 具有不同序列，长度和电荷分布的肽，特 异性较低，主要是与肽的主链相作用，但 对巯基尚有一些偏爱。按照分子伴侣的定 义，一般认为 PDI 和分子伴侣是两类不同 的帮助蛋白，但是我国上海生物物理研究 所最近提出不同的看法，认为蛋白质二硫 键异构酶也具有分子伴侣的功能。 蛋白质分子中天然二硫键的形成要求 这些在肽链上往往处于不相邻位置的巯基， 首先通过肽链一定程度的折叠，才能相互 接近到可以正确形成二硫键的位置。肽链 的自身折叠是一个慢过程，而蛋白质二硫 键异构酶催化蛋白质天然二硫键的形成却 是一个快过程。另一方面，蛋白质二硫键 异构酶具有低特异性的与各种不同肽链相 结合的能力，在内质网中以极高的浓度存 在，又是是一个钙结合蛋白，是一个能被 磷酸化的蛋白，这些都已经符合了分子伴 侣的条件。因此他们推测蛋白质二硫键异 构酶很可能首先通过它与伸展的，或部分 折叠的肽段的结合，阻止错误的折叠途径， 促进正确的中间物生成，帮助肽链折叠是 相应的巯基配对，从而是正确的二硫键得 以形成;然后催化巯基的氧化或二硫键的异 构而形成天然二硫键。他们认为蛋白质二 硫键异构酶的酶活性与它的分子伴侣功能 不是相互排斥，而是密切相关，协调统一 的。分子伴侣与帮助新生肽链折叠的酶之 间，大概不应该，也不能够划一条绝对的 分界线。我想:酶的最主要特性就是催化生 化反应，分子伴侣的主要作用是与新生肽 段的错误构象结合，从而阻止肽链不正确 的非功能的折叠途径，促使其向正确的折 叠方向反应，这难道不可以理解成间接的 催化肽链的折叠吗?从表观上看，抑制不正 确的折叠途径等于加快了正确反应的速度。 所以，我本人也很赞成他们的观点。最近 的试验已经为这一假说提供了很好的证据。 PDI 明显抑制变性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶 在复性