《纳米生物技术》PPT课件.ppt

湘雅医院肝胆肠外科研究中心 磁纳米粒阿霉素磁纳米粒阿霉素 治疗肝癌研究治疗肝癌研究 纳米科技被视为21世纪关键的高新技 术之一，其中纳米生物技术是目前国际 生物技术领域的前沿和热点问题，在医 药领域有着广泛的应用和明确的产业化 前景，特别是纳米药物载体将在疾病的 诊断、治疗和卫生保健方面发挥重要作 用。 纳米科技是现代科学和先进工程技术结合的产物纳米科技是现代科学和先进工程技术结合的产物 纳米医学是纳米科技的一个新分支纳米医学是纳米科技的一个新分支 纳米科技得到成功的应用，最引人注目的是纳米药物纳米科技得到成功的应用，最引人注目的是纳米药物 载体。载体。 可以解决口服易水解药物的给药途径，使原本只能可以解决口服易水解药物的给药途径，使原本只能 注射的药物可以直接口服而不破坏疗效注射的药物可以直接口服而不破坏疗效 可以延长药物的体内半衰期，解决因药物半衰期短可以延长药物的体内半衰期，解决因药物半衰期短 而需每天重复给药多次的麻烦而需每天重复给药多次的麻烦 减少药物不良反应减少药物不良反应 可将一些特殊药物输送到机体天然的生物屏障部位可将一些特殊药物输送到机体天然的生物屏障部位 传统给药方式传统给药方式 多次给药，浓度水平不稳定 药物缓控释药物缓控释 一次给药维持稳定药物水平 药物 游离药物半衰期短 靶向后增加到达病灶部位药物比例 控释 靶向 纳米药物制剂 纳米药物载体的基本类型纳米药物载体的基本类型 (1) (1) 纳米磁性颗粒纳米磁性颗粒 顺磁性或超顺磁性的纳米铁氧体颗粒具有磁靶向性顺磁性或超顺磁性的纳米铁氧体颗粒具有磁靶向性 使用交变磁场温度上升至使用交变磁场温度上升至 40454045杀灭癌细胞杀灭癌细胞 载体与药物载体与药物- -基因片段定向进入靶细胞之后，表层的载基因片段定向进入靶细胞之后，表层的载 体被生物降解，芯部药物释放出来发挥疗效体被生物降解，芯部药物释放出来发挥疗效 超过超过 60%60%的药物或基因片段采用可降解性高分子生物的药物或基因片段采用可降解性高分子生物 材料作载体材料作载体 聚丙交脂（聚丙交脂（PLAPLA）、）、聚已交脂（聚已交脂（PGAPGA）、）、聚已内脂（聚已内脂（ PCLPCL）、）、PMMAPMMA、聚苯乙烯（聚苯乙烯（PSPS）、）、纤维素、纤纤维素、纤 维素维素- -聚乙烯、聚羟基丙酸脂、明胶聚乙烯、聚羟基丙酸脂、明胶 结合含有结合含有 RGD RGD 定向识别器，靶向性与目标细胞表面的定向识别器，靶向性与目标细胞表面的 整合子结合后将药物送进肿瘤细胞，达到杀死肿瘤细整合子结合后将药物送进肿瘤细胞，达到杀死肿瘤细 胞或使肿瘤细胞发生基因转染的目的胞或使肿瘤细胞发生基因转染的目的 R G DR G D三肽序列是细胞外基质及体内多种粘附蛋白分子三肽序列是细胞外基质及体内多种粘附蛋白分子 所共有的细胞粘附和分子识别位点所共有的细胞粘附和分子识别位点. . R G DR G D三肽及其衍生物在抑制癌细胞的转移三肽及其衍生物在抑制癌细胞的转移 、抗血栓、抗血栓 、治疗急性肾衰、治疗急性肾衰 、抗炎、抗炎 、治疗骨质疏松、治疗骨质疏松 及皮肤再生及皮肤再生 纳米脂质体药物载体纳米脂质体药物载体 由磷脂双分子怪包覆水相囊泡构成，生物相容性好由磷脂双分子怪包覆水相囊泡构成，生物相容性好 一个脂质体中可以同时包载亲水和疏水性药物一个脂质体中可以同时包载亲水和疏水性药物 磷脂本身是细胞膜成分磷脂本身是细胞膜成分 注入体内无毒，生物利用度高，不引起免疫反应注入体内无毒，生物利用度高，不引起免疫反应 对脂质体表面进行修饰，譬如将对特定细胞具有选择性对脂质体表面进行修饰，譬如将对特定细胞具有选择性 或亲和性的各种配体组装于脂质体表面，可达到寻靶向或亲和性的各种配体组装于脂质体表面，可达到寻靶向 作用作用 (4)(4)纳米智能药物载体纳米智能药物载体 通过对纳米药物载体的结构设计、合成，制备出具有通过对纳米药物载体的结构设计、合成，制备出具有 智能释药能力智能释药能力 AA纳米识别基因载体纳米识别基因载体 这类药物载体本身带有肿瘤细胞识别的基因，在这类药物载体本身带有肿瘤细胞识别的基因，在 药物进入人体后，识别基因自动寻找肿瘤细胞，药物进入人体后，识别基因自动寻找肿瘤细胞， 进行释药进行释药 B B 纳米识别蛋白载体纳米识别蛋白载体 当带有识别蛋白纳米药物载体进入人体后，识别当带有识别蛋白纳米药物载体进入人体后，识别 蛋白自动寻找目标进行定位蛋白自动寻找目标进行定位 C C 纳米高分子控释载体纳米高分子控释载体 在材料的选择和药物载体的制备过程中，就已设计好在材料的选择和药物载体的制备过程中，就已设计好 给药的半衰期和适应给药的环境因素对载体的影响，给药的半衰期和适应给药的环境因素对载体的影响， 使之控制给药浓度和给药时间使之控制给药浓度和给药时间 二硬脂酰卵磷脂（ DSPE ） 靶向肿瘤血管配体：APRPG 缓控释智能开关： pH敏感性碘胺二甲氧嘧啶(SD) 细胞膜穿透肽Tat 抗肿瘤药物 抗肿瘤药物磷脂复合物纳米粒 1. 磷脂的改性及功能化 2. 靶向基团的引入 1. 3. 抗肿瘤药物磷脂 复合物纳米粒的制备 纳米基因载体 肿瘤的基因治疗：缺乏靶向性强、转染效率高的基因载体 ，临床效果不是很理想 纳米基因载体：缓释药物、靶向输送、保护核苷酸、毒性 小 脂质体基因载体 树状多聚体的基因载体 表面正电荷与核苷酸发生静电作用，形成纳米载体与质粒DNA的复合物。通过其 表面阳离子与细胞膜上的糖蛋白及磷脂相互作用进入细胞质，实现基因治疗。 纳米阳离子脂质体 纳米基因载体 1: 纳米脂质体基因载体 Andrew R. Reynolds, S. Trends Mol Med. 9 (2003 ): 2-4 以av3 整合蛋白为靶向的基因纳米材料 (a): av 3-NP/RAF(-)表达的ATPu-RAF与 av3整合蛋白结合;(b):内皮细胞凋亡(c): 肿瘤细胞饥饿死亡. 纳米脂质体基因载体 美国密西根州大学James等研制的对聚酰胺-胺型 (PAMAM)树突状聚合物。装 载了DNA的树突状聚合体注入组织，内吞作用的方式进入细胞，DNA分子释放出来 ，实现基因的整合。 Eichman JD, James R.Baker. et al. Pharm Sci Techonol Today. 3 (2000): 232-245 纳米基因载体 2:树突状物的多聚体 PAMAM 磁介导热疗 将纳米尺度的磁性颗粒定位于肿瘤组织，然后施加一外 部交变磁场，使材料因产生磁滞、驰豫或感应涡流而被加热 ，这些热量再传递到材料周边的肿瘤组织中，使肿瘤组织温 度超过42，导致细胞的凋亡及坏死，从而实现对肿瘤的治 疗。 Morozp, Jones SK, Gray BN. Int J Hyperthermia, 18(2002): 42674284 磁介导热疗 1：磁性阳离子脂质体 Akira Ito, Masashige Shinkai, Hiroyuki Honda, et al. J.Biosci Bioeng.100,1 (2005): 111 阳离子脂质体 中性脂质体 磁介导热疗 2：抗体结合的磁性脂质体 Akira Ito, Masashige Shinkai, Hiroyuki Honda, et al. J.Biosci Bioeng. 100,1 (2005): 111 四、利用纳米技术进行肿瘤治疗 三三. .纳米药物载体的特征纳米药物载体的特征 1 1 靶向性靶向性 (1)(1)被动靶向被动靶向 载药纳米粒大多经脉管给药，以达到靶向释药的目的载药纳米粒大多经脉管给药，以达到靶向释药的目的 。纳米粒可从血流中迅速清除并被。纳米粒可从血流中迅速清除并被 RES RES 摄取。摄取。RES RES 为网状内皮系统（单核为网状内皮系统（单核- -巨噬细胞系统）的简称，主巨噬细胞系统）的简称，主 要分布于肝，其次是脾、骨髓等。巨噬细胞的吞噬作要分布于肝，其次是脾、骨髓等。巨噬细胞的吞噬作 用，对于与用，对于与 RES RES 有关的疾病是有益的，可藉此达到有关的疾病是有益的，可藉此达到 靶向给药的目的靶向给药的目的 肿瘤组织生理特性EPR效应(enhanced permeability and retention effect)大多数实体瘤的病 理生理特征与正常组织器官相比有显著不同。表现为 肿瘤血管生长迅速，外膜细胞缺乏，基底膜变形，淋 巴管道回流系统缺损，大量血管渗透性调节剂(缓激肽 、血管内皮生长因子，一氧化氮、前列腺素和基质金 属蛋白酶等)的生成。这些生理性变化有利于迅速增长 的肿瘤组织获取大量营养物质和氧气。同时这也导致 了肿瘤血管渗透性的增加，进而产生了EPR效应。 它是指大分子药物、药物载体如脂质体等可 以穿透肿瘤缺损的血管内皮细胞进入肿瘤组 织，并由于清除障碍而高浓度长时间蓄积在 肿瘤组织中，有的可长达100h。研究发现 相对低分子质量的物质不能长时间蓄积在肿 瘤组织中，因为它们可以以扩散的方式返回 到循环体系中。一般认为大于501000的分 子或与其相当的粒子有明显的EPR效应。 (2)(2)主动靶向主动靶向 纳米粒载体主动靶向可分为物理化学靶向和生物靶向纳米粒载体主动靶向可分为物理化学靶向和生物靶向 两个层次两个层次 AA物理化学导向：物理化学导向： 物理化学导向是利用药物载体的物理化学导向是利用药物载体的 pH pH 敏、热敏、磁性敏、热敏、磁性 等特点在外部环境的作用下（如外加磁场）发生变化等特点在外部环境的作用下（如外加磁场）发生变化 实现对病灶实行靶向给药。实现对病灶实行靶向给药。 利用药物载体的磁性特点，在外加磁场的作用下，磁性纳 米载体将富集在病变部位，进行靶向给药。 纳米载药微粒：物理化学导向 B B生物导向：生物导向： 生物导向利用细胞膜表面抗原、受体或特定基因片生物导向利用细胞膜表面抗原、受体或特定基因片 段的专一性作用，将抗体、配体结合在载体上，通段的专一性作用，将抗体、配体结合在载体上，通 过抗原过抗原- -抗体、受体抗体、受体- -配体的特异性结合，使药物能配体的特异性结合，使药物能 够准确送到肿瘤细胞中，实现恶性肿瘤的主动靶向够准确送到肿瘤细胞中，实现恶性肿瘤的主动靶向 治疗。如：采用异型双功能交联剂将人肝癌单抗治疗。如：采用异型双功能交联剂将人肝癌单抗 18 18 与载米托蒽醌的白蛋白纳米粒化学偶联，构与载米托蒽醌的白蛋白纳米粒化学偶联，构 建人肝癌特异的免疫纳米粒；建人肝癌特异的免疫纳米粒； 纳米载药微粒 尺度：直径10500 nm的固态胶体粒子 构造：药物通过溶解、包裹作用位于粒子内部, 或通过吸附、耦合作 用位于粒子表面 特点：长循环、缓释、靶向 纳米微粒 长循环 靶向、缓释 物理化学导向 生物导向 荧光修饰的抗体进行识别和定位 利用抗体、细胞膜表面受体的专一性作用，将配位子结合在载体上，与目 标表面的抗原性识别器发生特异性结合，使药物能准确地作用于目的细胞。 纳米载药微粒：生物导向 X X He, X Lin, K Wang, W Tan. J Nanosci Nanotechol.1( 2004): 235-254 与抗体结合的纳米材料与肿瘤抗原的特异性结合 抗癌药物装载 纳米药物载体 靶向分子偶联 （分子靶向） 控制释放结构 EPR效应（被动靶向）磁靶向（物理靶向）复合靶向复合靶向 AA98抗体靶向与治疗 抗体 肿瘤 抑瘤率 AA98 hepatocarcinoma 70.5 % Leiomyosarcoma 49.8% Pancreatic cancer 48.7% 131I-AA98 Pancreatic cancer 86.2% 自主创新的抗肿瘤血管抗体AA98 磁性空心球包裹IL-12连接抗体BVE-1（nano-IL12-MCAB)靶向肿瘤区血管 vnano-IL12-MCAB血管断血、断营养肿瘤细胞坏死 2 2 可控释放性可控释放性 控释药控释药(CRDDS)(CRDDS)是控制释放给药系统是控制释放给药系统 (Controlled (Controlled release drug delivery release drug delivery system,CRDDS)system,CRDDS)的简称。的简称。CRDDS CRDDS 是通过物理、化学是通过物理、化学 等方法改变制剂结构，使药物在预定时间内，自动等方法改变制剂结构，使药物在预定时间内，自动 按某一速度从剂型中恒速释放于作用器官或特定靶按某一速度从剂型中恒速释放于作用器官或特定靶 组织，并使药物浓度较长时间维持在有效浓度内的组织，并使药物浓度较长时间维持在有效浓度内的 一类制剂。一类制剂。 溶涨扩散程度与速度取决于PEG在材 料中所占的比例，含量越高，药物从 PEG-PLGA纳米粒扩散越快 于PBS液中2天后PEG-PLGA纳米粒 PEG-PLGA微球 在血浆中孵育7天 PEG-PLGA在体内在体液的作用 下产生降解释放出药物 PEG-PLGA纳米粒 3 3 生物相容性和生物可降解性生物相容性和生物可降解性 所谓生物相容性是指材料对机体无毒性，不激活凝血系所谓生物相容性是指材料对机体无毒性，不激活凝血系 统，不引起血液或机体、组织炎症反应，不吸附、损伤统，不引起血液或机体、组织炎症反应，不吸附、损伤 、激活白细胞、血小板和补体系统，即要求与机体组织、激活白细胞、血小板和补体系统，即要求与机体组织 血液系统无反应性。血液系统无反应性。 生物降解性是药物载体的重要特征之一，通过降解，载生物降解性是药物载体的重要特征之一，通过降解，载 体与药物定向进入靶细胞之后，表层的载体被生物降解体与药物定向进入靶细胞之后，表层的载体被生物降解 掉（包覆形），芯部的药物释放出来发挥疗效，避免了掉（包覆形），芯部的药物释放出来发挥疗效，避免了 药物在其他组织中释放药物在其他组织中释放 长循环纳米粒（也称为隐形纳米粒） 人体内起防御功能的网状内皮吞噬系统对外来异物的识 别能力很强 巨噬细胞消除外来粒子的一个重要机制是通过识别结合 于微粒上的免疫球蛋白（IgG）和Fc段和补体来吞噬抗 体结合的微粒 血浆中的多种成分如血浆蛋白等可以吸附到纳米粒表面 ，这就是调理过程 而巨噬细胞上存在这些血浆成分的受体 药物在血中循环时间短，到达不了靶器官，不能产生长 效缓释作用 极性微粒不易被吞噬，Zeta 电位越高吞噬越少。表面 双亲性或亲水性的微粒在血中循环时间长。采用亲水 性材料对纳米粒进行表面修饰，可提高其表面亲水性 、增大空间位阻及调整Zeta 电位，延长纳米粒在体内 的循环时间。 长循环纳米粒的的表面修饰有共价偶联和表面吸附和生 物模拟。 共价偶联 将PEG等亲水性聚合物通过酯键共价连接到 纳米粒载体上，可得到较稳定的包衣层 表面吸附 通过物理吸附的原理，将某些表面活性剂吸附 到纳米粒的表面也可达到长循环的目的 本法主要采用非离子型聚氧乙烯类表面活性剂，最常用 的是泊洛沙姆及其乙二胺衍生物 机制：不带电荷，亲水性的表面包衣层具有立体排阻作 用，有效阻断了巨噬细胞对纳米粒的吞噬作用亲水性包 衣能有效减少纳米粒对血中成分的吸附以减少粘附，降 低血浆蛋白的调理作用。 生物模拟 由于补体系统在RES吞噬异物时发挥重要作 用,因此通过模拟细胞和病原体来减少或抑制补体系统 的活性,可以避免吞噬。将神经节苷脂(GM1)加入到脂 质体的膜中,它就具有了长循环特性。肝素能在不同阶 段抑制补体系统的活性,将它共价连接到聚甲基丙烯酸 甲酯(PMMA)纳米粒上,发现其半衰期为5,在血中可 停留长达72,而PMMA纳米粒的半衰期只有3min。 血浆补体在高温下失活,可将纳米粒用血浆包衣后,在静 注前,56处理30min,可延长微粒的血中循环时间。 多肽糖和环糊精表面修饰 表面包裹多聚糖类物质的 纳米粒也能免于被MPS摄取。PLA和聚赖氨酸接枝多 聚糖纳米粒已发展成为高效DNA的载药体系。这些纳 米粒不会自动团聚,并对血清蛋白无选择性吸附。 原发性肝细胞癌是世界上最常见的恶性肿瘤 之一，一旦发现已属中晚期，难以治愈，转移 性肝癌的治疗效果更差。 目前大部分肝癌主 要依靠非手术治疗，全身化疗和肝动脉连续灌 注化疗并没有取得令人满意的疗效，其主要原 因是这些治疗方法缺乏高度的选择性，不能有 效杀死癌细胞和消除化疗药物对健康细胞的毒 性。 将具有磁性定位阿霉素磁纳米粒用于治疗肝癌 ，在肿瘤部位加磁场，将携带有抗癌的磁性载 体通过血管注入体内后，在磁场的作用下，在 肿瘤部位富集，并释放出携带的药物。同时， 纳米粒因其体积极小，易进入细胞；100 nm左 右的纳米粒本身对癌细胞有特异的破坏作用。 因此，阿霉素磁纳米粒，可显著提高治疗肝癌 疗效。减轻毒副反应。 先进性与创新性 具有高效靶向性，可提高药物疗效，减少正常 组织的药物暴露，降低毒副作用的发生。 可调整载体材料种类或配比，控制药物的释放 速度，制备出缓释性的载药纳米粒。 载药纳米粒可以改变膜运转机制，增加药物对 生物膜的通透性，有利于细胞内药效发挥。 磁性纳米颗粒的制备 磁性材料的制备 磁性纳米颗粒的制备 纳米粒的透射电镜照片（10000倍） 磁性物质（Fe3O4）均匀分布于纳米粒中 纳米粒的扫描电镜照片 纳米粒的倒置显微镜照片（200倍） 可见纳米粒均匀分布于磁场中 纳米粒的倒置显微镜照片（200倍） 纳米粒在磁场的作用下聚集于磁铁的一侧 纳米粒的倒置显微镜照片（200倍） 当磁铁与纳米粒的距离增大时，纳米粒所受的磁力减小，纳米 粒的运动速度减慢，纳米粒因磁化而相互吸引，沿磁力线的方 向形成串珠状聚集 纳米粒的倒置显微镜照片（200倍） 纳米粒在运动过程中照相所形成的轨迹 l不同温度制备的纳米粒洗涤后进入溶液的游离阿霉素百分率 加热温度游离阿霉素百分率(%) 75 13.7 100 10.2 125 5.0 150 2.6 磁性纳米在正常肝脏中的靶向性 在磁场的存在下,磁区肝组织抗癌药物浓度为 正常肝组织的2.6倍 80%以上的纳米粒聚集于肝脏 未加磁场正常肝组织（HE染色，200倍） 见较大的血管中未发现纳米粒的存在 加磁场正常肝组织（HE染色，200倍） 见小动脉及肝窦中大量的纳米粒聚积 大鼠肝癌模型制作 购置种鼠 制备实体瘤 肝癌模型 肿瘤在肝脏中受植情况（HE染色200倍） Walker-256肝癌细胞在移植后7天在肝脏组织中 生长良好 磁性纳米药物载体在肝癌模型中的 靶向性 无磁场，肿瘤区抗癌药物浓度为正常肝组织的 2.8倍 在磁场的存在下,肿瘤区抗癌药物浓度为正常 肝组织的8.7倍 80%以上的纳米粒聚集于肝脏 未加磁场的肿瘤组织（HE染色，200倍） 肿瘤中可见少量散在的纳米粒存在 加磁场的肿瘤组织（HE染色，200倍） 肿瘤的小血管中可见大量纳米粒聚积 加磁场的肿瘤组织（HE染色，200倍） 肿瘤的小动脉中可见大量纳米粒聚积 加磁场的肿瘤组织（HE染色，200倍） 肿瘤周围小动脉中可见大量纳米粒聚积 磁性纳米粒对移植性肝癌的疗效 生存率 1.0 0.6 0.2 0 10 20 30 40 50 60 生存天数 生 存 率 曲 线 NS治疗组 阿霉素治疗组 磁性微球治疗组 磁性微球外加磁场治疗组 纳米粒不加磁场治疗组的肿瘤组织（HE200） 注药后36小时见肿瘤组织片状坏死，瘤周可见淋 巴细胞浸润 纳米粒加磁场治疗组的肿瘤组织（HE200） 注药后36小时见肿瘤组织除边缘少许细胞存活，其 余部位肿瘤组织全部坏死 纳米粒加磁场治疗组的肿瘤组织（HE200） 注药后60天见肿瘤组织被纤维组织和无结构的组织所代 替，找不到癌细胞的存在 磁