聚合酶链式反应及其在分子诊断中的应用.doc

薂薆罿聿蒈薆肁芅莄薅螁肈芀薄袃芃蕿薃羅肆蒅蚂肇节莁蚁螇肄芇蚁衿芀芃蚀肂膃薁虿螁莈蒇蚈袄膁莃蚇羆莆艿蚆肈腿薈螅螈羂蒄螅袀膈莀螄肃羀莆螃螂芆节螂袅聿薀螁羇芄蒆螀聿肇莂蝿蝿节芈衿袁肅薇袈羃芁蒃袇膆肃葿袆袅荿莅蒂羈膂芁蒂肀莇薀蒁螀膀蒆蒀袂莆莂蕿羄膈芈薈肇羁薆薇螆膇薂薆罿聿蒈薆肁芅莄薅螁肈芀薄袃芃蕿薃羅肆蒅蚂肇节莁蚁螇肄芇蚁衿芀芃蚀肂膃薁虿螁莈蒇蚈袄膁莃蚇羆莆艿蚆肈腿薈螅螈羂蒄螅袀膈莀螄肃羀莆螃螂芆节螂袅聿薀螁羇芄蒆螀聿肇莂蝿蝿节芈衿袁肅薇袈羃芁蒃袇膆肃葿袆袅荿莅蒂羈膂芁蒂肀莇薀蒁螀膀蒆蒀袂莆莂蕿羄膈芈薈肇羁薆薇螆膇薂薆罿聿蒈薆肁芅莄薅螁肈芀薄袃芃蕿薃羅肆蒅蚂肇节莁蚁螇肄芇蚁衿芀芃蚀肂膃薁虿螁莈蒇蚈袄膁莃蚇羆莆艿蚆肈腿薈螅螈羂蒄螅袀膈莀螄肃羀莆螃螂芆节螂袅聿薀螁羇芄蒆螀聿肇莂蝿蝿节芈衿袁肅薇袈羃芁蒃袇膆肃葿袆袅荿莅蒂羈膂芁蒂肀莇薀蒁螀膀蒆蒀袂莆莂蕿羄膈芈薈肇羁薆薇螆膇薂薆罿聿蒈薆肁芅莄薅螁肈芀薄袃芃蕿薃羅肆蒅蚂肇节莁蚁螇肄芇蚁衿芀芃蚀肂膃薁虿螁莈蒇蚈袄膁莃蚇羆莆艿蚆肈腿薈螅螈羂蒄螅袀膈莀螄肃羀莆 聚合酶链式反应及其在分子诊断中的应用聚合酶链式反应于1983年由美国Cetus公司的K.Mullis建立，并和定点突变的发明者M.Smith一起荣获1993年度诺贝尔化学奖，为生命科学领域的研究开创了崭新时代。一、PCR反应原理和反应过程DNA的体外复制包括3个步骤： CC 95 变性（denaturation）:94 CC70 退火（annealing）:40 C 延伸（extension）:72 3个步骤作为PCR的一个循环，每当完成一个循环，一个分子的模板被复制为二个，产物量以指数形式增长。二、PCR的反应体系和反应条件（一）PCR反应体系参与PCR反应的主要成份:模板、引物、dNTP、Taq DNA聚合酶和缓冲液等。1、 模板 包括基因组DNA、RNA、质粒DNA、线粒体DNA等 模板DNA需较高的浓度 RNA作为模板时，须先将RNA逆转录为cDNA，再以 cDNA作为扩增的模板 模板量：1000ng、500ng、100ng、50ng2、引物（Primers) 引物决定PCR扩增产物的特异性和长度，是化学合成的寡核苷酸片段。 化学合成的寡核苷酸 能与模板特异地结合 引物决定产物的特异性和长度 引物设计时必须遵循一些原则 设计引物的原则： 二条引物分别位于被扩增片段的两端，与模板正负链序列互补 长度为18 25个核苷酸 二条引物之间避免形成引物二聚体 引物的碱基组成应平衡 引物退火温度计算：Tm=2（A+T）+（C+G） 引物的5端可被修饰（引入酶切位点、引入突变位点、生物素等标记）What parameters affect the Tm?(Tm is defined as the temp at which half the molecules are single-stranded)3、脱氧核苷三磷酸（dNTP） 是dATP、dCTP、dGTP和dTTP4种脱氧核苷三磷酸的混合物反应体系中各种核苷酸的浓度必须一致浓度过高虽能加快反应速度，但非特异性扩增也随之增加dNTP浓度：20 mol/L,浓度升高增加非特异性扩增m 2004、DNA聚合酶 从一种生活在热泉（8090）中的水栖噬热菌Thermus aquaticus, Taq）中提取，有很高的耐热稳定性Taq 酶的作用: 模板指导下，以dNTP为原料，在引物3-OH末端加上脱氧单核苷酸，形成3, 5 -磷酸二酯键，使DNA链沿53方向延伸，催化DNA合成。 最适酶量：1-2.5U （酶量过多，导致非特异性扩增） Taq DNA聚合酶复制的保真性： Taq DNA聚合酶无3 5外切酶活性，因而无校正功能，在复制新链的过程中会发生碱基错配。 Taq DNA聚合酶在每次循环中产生的移码突变率为1/30000，碱基替换率为1/8000，故扩增的片段越长，错配的机率越高。 耐热的 DNA多聚酶： Pwo DNA polymerase、Tth DNA polymerase、Pfu DNA polymerase具有较高的热稳定性，较高的保真性，降低碱基错配率2 10倍。5、镁离子浓度 镁离子浓度是一个至为关键的因素，对于反应 系统本身、稳定核苷酸和提高Taq 酶的活性有直接影响 虽然Taq 酶的活性只与游离的Mg2+浓度有关， 但PCR反应体系中dNTP、引物、模板DNA及 鳌合剂的存在均可与Mg2+结合而降低游离 Mg2+的浓度从而影响酶的活性。 当dNTP浓度为200 mol/L时，MgCl2的浓度为1.5mmol/L较宜。m6、其它反应因素 pH：调节至酶反应所需的最适pH（ pH =7.2左右） 盐：合适的盐浓度有利于稳定杂交体，有利于引物与模板杂交基质：BSA、gelatin 、Tween20、DTT等（牛血清白蛋白或明胶等基质可以保护Taq 酶的活性）（二）PCR的反应条件 反应温度（变性、退火、延伸） 反应时间（变性、退火、延伸） 循环次数（PCR效率及产物量）1、温度 变性温度：94 97 退火温度：低于引物Tm 5 左右 温度过高：降低扩增效率 温度过低：增加非特异性扩增 延伸温度：72 ，此时Taq酶具有较高的 酶促活性2、时间 第一次变性应给予足够时间（5 7分钟）每一个步骤所需时间取决于扩增片段的长度，一般为30秒 1分钟，时间过长易导致非特异性扩增3、循环次数 重复次数一般设为2535个循环 扩增反应的平台效应： 理论上，PCR反应产物呈指数性增长，但这种增长形式在扩增25-25个循环以后便放慢直至停止，达到反应平台，此时扩增产物量不再随循环次数的增加而呈指数增长 平台出现得迟早与模板的初始量有关，模板初始量越多，平台出现得越早。 平台效应产生的因素： 引物二聚体的产生、反应产物、各组分的消耗和变性、引物和已扩增的DNA片段间的竞争等三、PCR技术的质量控制（一）实验室的规范化设置实验室的规范化设置： 试剂贮存和准备区 标本制备区 扩增反应区 产物分析区 PCR技术的质量保证： 基因扩增检验的全过程的质量保证 室内质量控制和室间质量评价 PCR实验系统中的污染源及防污染措施 防污染体系： 正确设置实验室、严格规范实验操作、完整有效的去污染措施、人员培训、试剂质量反应体系中以dUTP取代dTTP，再加入尿嘧啶糖苷酶（UNG）即可破坏以往的扩增产物（二）PCR技术的质量保证 分析前因素：标本采集、运送、稳定化处理、贮存 分析中因素：核酸提取、逆转录、扩增反应、设置 对照系统（包括阴性对照、阳性对照、内对照等） 分析后因素：报告形式、反馈的信息等第二节 以PCR为基础的相关技术以PCR为基础的相关技术 逆转录PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR) 定量PCR (quantitative PCR ) 多重PCR (multiplex PCR) 免疫PCR 差异显示PCR (differential display PCR, DD-PCR) PCR诱导定点突变 原位PCR (in situ PCR) 一、逆转录PCR（RT-PCR） 以细胞内总RNA或mRNA为材料进行体外扩增的技术。 主要用于克隆 cDNA、合成cDNA探针，检测RNA病毒、分析基因表达等逆转录生成cDNA方式： 以随机进行的PCR扩增所需的下游引物作为逆转录反应的引物以oligo(dT)作为引物， mRNA3末端polyA尾与之互补以人工合成的随机序列六核苷酸混合物作为引物，进行扩增二、定量PCR 对DNA或RNA样本的靶序列进行定量分析。 主要用于基因表达的分析、病原体核酸的检测等 在定量PCR反应体系中，除了常规PCR反应所需的材料和试剂外，还必须引入内参照系统。 -肌球蛋白基因b内参照系统一般选用与待测序列结构无关的基因常用的内参照基因是（PCR的参照系统）相对定量PCR设计相对定量PCR实验方案时须注意： 预先确定最佳模板量和PCR循环数，使所 采用的各反应参数在扩增指数范围内，避 免平台效应。 “管家基因”与靶基因同管扩增，扩增产物 的长度应有所不同，以保证电泳能将两者 分离开。 荧光定量PCR（fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR），又称实时PCR，是目前较精确的进行定量检测PCR的方法 FQ-PCR通过荧光信号对PCR过程中产物量进行实时监测，精确计算出PCR的初始模板量Reverse transcription followed by Polymerase Chain Reaction Considered to be the most sensitive method for the detection and quantification of gene expression levels. Used as a follow-up when a particular gene is suggested in micro-array studies. Potential problems with sensitivity, specificity and reproducibility.荧光信号的检测方法： 1、DNA结合染料技术 2、水解探针技术（TaqMan probe）技术 3、杂交探针技术 CEA 基因在消化系统上皮腺癌， 尤其是直结肠癌和胃癌中高表达， 因此在肿瘤细胞内可检测到其转 录本，而在正常成人体内极少表 达。 在肿瘤发生血道转移时，外周血 中有少量肿瘤细胞残留。用灵敏、 特异的技术检测到这些肿瘤细胞 中CEA基因的转录本，是发现肿 瘤早期转移的关键。三、多重PCR 在同一反应体系中加入多对引物，同时扩增一份DNA样本中多个不同序列的靶片段。四、免疫PCR 将PCR产物用ELISA方法加以检测的技术。在对目的基因扩增时，dNTP中同时混有用生物素标记的Bio-16-dUTP，使扩增产物带有生物素标记。若该产物能与突变点特异的寡核苷酸探针（3端地高辛11-DIG-ddUTP标记）杂交，则该产物便带有地高辛标记信号，可利用与抗地高辛抗体共价结合的酶标检测系统进行显色反应，从而判断突变的存在。（一）寡核苷酸探针检测系统（二）RNA探针-抗体捕获系统五、差异显示PCR（differential display PCR,DD-PCR） 一种以逆转录PCR为基础的研究基因表达差异的技术。 DD-PCR主要用于肿瘤和多种疾病的分子遗传学研究，是目前筛选基因表达差异最有效的方法。六、PCR诱导定点突变 （一）引入点突变 （二）引入大片段缺失第三节PCR产物的检测 PCR-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP） 等位基因特异性寡核苷酸 （allele specific oligonucleotide, ASO） 单链构象多态性（single strand conformation polymorphism, SSCP） 变性梯度凝胶电泳（DGGE） 融点曲线分析（melting curve analysis） PCR产物的序列分析 一、PCR-RFLP 利用正常序列或突变序列是否处于限制性内切酶的酶切位点而设计。若点突变处于某一限制性内切酶的酶切位点内，可在突变点两侧设计引物，使PCR产物含有该突变序列。用相应的内切酶对正常产物和突变产物进行水解并作电泳分离，可根据水解片段的大小和电泳位置区分二者。Results of Southern BlotPCR-SSCP单链DNA分子具有特定的二级空间构象，取决于该分子本身的碱基组成。突变DNA的PCR产物经变性后产生与正常DNA空间构象不同的两条单链在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中时，不同构象的单链片段具有不同的电泳迁移率，从而能区别正常与突变的DNA 不同顺序 不同构象 不同电泳行为熔点曲线分析(melting curve analysis） DNA片段中突变碱基与正常碱基不能配对而形成异源双链，所产生的Tm较完全配对的同源双链的Tm低，在仪器上显示出不同的曲线从而将突变序列检测出来。所需仪器如高效液相色谱仪(DHPLC)、WAVE DNA片段分析系统、LightCycler等。PCR产物的序列分析（DNA sequencing） 主要见于分子克隆时对于目的基因扩 增片段的序列鉴定以及对致病基因检测时 分析扩增片段中点突变的位置和性质。 可将产物纯化后作为模板直接测序， 也可将PCR产物克隆入载体后再测序，后 者测序的效果更好 ，常用T-A克隆。Sanger测序技术：以待测序列的单链DNA作为模板，加入一个引物和dNTP作为底物，并加入一定比例的2，3-ddNTP，在DNA聚合酶的作用过程中，正常dNTP的掺入使链延伸，若ddNTP的掺入则使链终止，这样就可以得到一系列长度不同的以四种ddNTP结尾的DNA片段，经电泳后可直接读出碱基序列。第四节 PCR技术在分子诊断中的应用PCR技术在分子诊断中的应用 感染性疾病中病原微生物核酸的检测 单基因遗传性疾病的基因诊断 多基因病相关基因的检测 肿瘤相关基因的检测 移植配型和法医学上的应用一、感染性疾病的分子诊断 定性或定量检测致病微生物的核酸， 已经用于病毒、细菌和寄生虫感染 的诊断。 动态、定量地检测病原体核酸能对 疗效判断和病情预后提供客观的依 据。SARS相关冠状病毒的分子诊断 2003年4月，香港研究者Peiris等报 告了50 例SARS病人的临床表现和 病毒学研究结果证明，新冠状病毒 可能是SARS的致病原因。（Lancet, 2003, 361: 9365) 其它实验室陆续得出相同结论。 2003年4月，德国汉堡Bernhard- Nocht热带医学研究所学者 Drosten 等用随机扩增技术，获得长度为 300 bp的核苷酸序列。 根据这段序列，建立了检测新冠状 病毒的常规和实时定量PCR技术。（ on April 10, 2003）引物和探针 BNIoutS2-BNIoutAs BNI-1片段，189 bp BNIinS-BNIinAs BNI-1片段的内套片段，108bp BNITMSARS1BNITMSARAs2 BNITMSARP(荧光素标记的探针） 产物长度：77 bp 检测标本 痰液、咽拭子、鼻拭子、支气管肺 泡灌洗液 、血浆、粪便。 检测方法 1. 逆转录-巢式PCR 2. 逆转录-实时PCR结 果 病人和接触者（具临床症状）的痰 液中用外套引物检测到了病毒。 病人的其它标本用套式PCR检测到 病毒。 有报道显示，在可能SARS病人 中， 病毒的检出率为100%。 在疑似SARS病人中的检出率为 23%。 所有健康接触者中未检测到病毒。 检测病毒的3种方 法（血清学检测、 病毒分离、PCR技术）中，PCR技 术的检出率最高。讨 论 疾病的早期即可获得阳性结果（早于血 清转换期）。 特异性较高（SARS患者中的阳性率约为 80%，对照中的阴性率约98%100%）。 现有的方法敏感性较差，阴性结果不能 排除病毒感染。讨 论 痰液中病毒RNA浓度极高，说明病毒从呼吸道 排放是主要传播途径。 血清中检测到极低浓度的病毒RNA，提示病毒 复制不仅发生于呼吸道。 病人恢复晚期的粪便中存在病毒RNA，说明粪 便可能也是一种传播途径。 鼻、咽拭子中含有的病毒RNA显著少于痰液， 提示不适合作为标本（有可能漏检）。SARS相关冠状病毒分子诊断中必须注意的问题 必须在规范的基因扩增实验室中进行。 应采取必要的质控规程，包括阳性对照 和阴性对照。 阳性结果时必须对原始样本重复检验或 者扩增基因的另一个片段或在另一个实 验室对同一样本进行检测。 二、单基因疾病的诊断 单基因遗传病是由于某一基因结 构的变化或由其而引起的基因表达异 常所导致的疾病，因此用分子生物学 技术检测致病基因的遗传缺陷是诊断 这些疾病最根本的手段。1. 血友病的分子诊断 X染色体连锁隐性遗传 F基因和F基因发生突变 血浆凝 血因子和的合成量和（或）质的异常 患者反复自发性出血2. DMD的分子诊断 X染色体连锁隐性遗传性肌肉疾病，发病 率为1/3 500个男孩 DMD基因位于Xp21.2-21.3，全长2 500Kb DMD基因的突变导致dystrophin缺陷 检测DMD基因的技术： Southern印迹、多重PCRDMD的基因检测 迪谢内肌营养不良(DMD) 是一种高发病 率、高致残、高致死的X染色体连锁的遗 传性疾病，在3500个活产男婴中即有一 个患者。 致病基因DMD的全长为250kb，有79个外 显子。 DMD 的最主要遗传缺陷是外显子缺失， 约占60%70%。DMD基因外显子缺失的检测LGMD2B的基因定位 和遗传缺陷的研究 肢带型肌营养不良(limb-girdle muscular dystrophy, LGMD）是一组累及肩胛、骨盆带 和四肢近端肌肉的遗传性疾病。 LGMD1：显性遗传（1A、1B、1C） LGMD2：隐性遗传（2A2H） 不同类型的LGMD不仅在遗传学上具高度异质 性（不同致病基因，不同基因突变），临床表 现亦十分不一致，临床诊断和分类十分困难。 ENMC的诊断标准 LGMD的诊断必须符合以下2个标准之一：1. 致病基因与已知的某一LGMD基因位点 连锁2. 检测到致病基因编码产物的缺陷家系资料致病基因的定位 用迄今已报道的 LGMD2A2H 8个基因 所在位点附近共14个STR标记对家系成 员DNA样本进行连锁分析，以期找出与 该家系连锁的致病基因。致病基因定位结果 连锁分析显示此家系在D2S377位点的Lod Score值为1.85，在D2S286 位点的Lod score 值 为0.51，其他各位点的值均为负数。统计结果 支持D2S337位点和 D2S286 位点与 LGMD2B 致病基因连锁。其他各位点与致病基因不连 锁。 Lod score值1：支持连锁 Lod score值3：强烈支持连锁致病基因编码产物检测结果 先证者LGMD2B基因的编码蛋白dysferlin 条带密度与正常对照相比有明显下降，其余各蛋白条带与正常对照相比无明显改变。DYSF基因突变的检测 在DYSF基因的突变热点区筛查，以期 找出导致 dysferlin缺陷的基因突变。 逆转录PCR 产物克隆至载体后作序列分析DYSF基因检测结果 cDNA第6425/6426位(52号外显子)缺失 1个G碱基 (6425/6426 del G)。 第2019位密码子agg agc，下游读码 发生移码突变，使第2035位密码子 atg tga (53号外显子，M 2035 X)。 终止密码的提前产生是 dysferlin缺陷的 原因。 是尚未报道的一个新突变，也是中国第 一例DYSF基因突变。 根据患者病史、体征和分子诊断实验结 果，这是一个由于 DYSF 基因突变造成 相应编码产物缺陷而导致的疾病。三、多基因病的分子诊断 多基因病具一定的遗传因素，家庭 发病率高于人群发病率，但是疾病 的产生都以一定的环境条件为诱因， 遗传因素在其中所起作用程度各异。 多基因病中的遗传因素是若干个 易感基因微小作用的累加，某一 易感基因结构的变化不足以导致 疾病的产生。 人类基因组多态性是多基因病基因 诊断的基础，易感基因多态性的检 测能帮助我们理解多基因病发生的 机制，有助于对疾病的诊断和分类。基因多态性与盐敏感性高血压-内收素 a 血管紧张素转换酶上皮钠通道 血管紧张素原心钠素 2肾上腺素能受体b SA G蛋白亚单位3ACE基因多态性与高血压靶器官损伤疾病 研究报告数 I D D D冠心病 30 + 11 % + 32 %心肌梗死 15 + 12 % + 39 %脑卒中 5 + 22 % + 94 %高血压肾病 19 + 10 % + 53 %糖尿病肾病 11 + 40 % + 56 % * 与II型相比，DD型和ID型发生上述疾病的危险性增高程度 (145个ACE基因I/D多态性研究49959例的荟萃分析）基因多态性与高血压靶器官损伤脑卒中 载脂蛋白E -纤维蛋白原b 血管紧张素原 血管紧张素II的1型受体 内皮型一氧化氮合酶 心钠素冠心病 副氧酶 凝血因子V 凝血因子VII 载脂蛋白B基因多态性检测与个体化治疗 人类基因组计划已经完成，功能基因组 计划正在实施。 有朝一日，临床医师能根据病人易感基 因的多态性设计有效的、个体化的治疗 方案，以达到最佳的治疗效果。 TOHP试验中AGT基因研究目的：观察AGT基因分型与限钠盐摄入及减轻体重后的 血压变化和高血压发病率间的关系对象：1509例基因分析：AGT基因G-A多态性结果： 三年后高血压发生率（%） 对照组 限盐组 减轻体重组 AA型 45 28 25 GG型 32 41 32 Hunt SC,et al: Hypertension, 1998;32:393-401基因多态性分析 指导抗高血压药物的选择 药物种类 基因 利尿剂 -内收素a ACE抑制剂 ACE、AT1-受体阻滞剂 b aG蛋白（Gs四、肿瘤相关基因的检测 肿瘤是由于遗传物质（肿瘤相关基因） 发生突变而导致的疾病。肿瘤相关基 因的突变只是增加了个体对肿瘤的易 感性而并不一定马上产生肿瘤，肿瘤 的发生是一个多因素、多步骤的过程。 生物芯片技术在今后的肿瘤发病机制研究和肿瘤的诊断等方面将发挥越来越显著的作用五、PCR在移植配型上的应用 为了避免器官移植后出现免疫排斥反应，在器官或骨髓移植前要进行组织分型。 经典的HLA分型是通过血清学或混合淋巴细胞培养方法分析。 二十世纪80年代后期，分子生物学技术被引入HLA领域，人们在PCR基础上发展了各种DNA分型技术检测I类和II类抗原位点的等位基因 。 Hybridization of sequence-specific oligonucleotide probes (SSOP) to polymerase chain reaction (PCR)amplified DNA has proved to be a powerful method for identifying polymorphism of both class I and class II loci. Typing with panels of SSOP can reveal specific alleles indistinguishable by serological typing. At least 11 unique DR4 alleles have been identified by SSOP