《基因工程制药》PPT课件.ppt

第三节 基因工程制药生产的基本过程,一、工具酶的分离纯化 二、载体的分离纯化 三、外源DNA和目的基因的分离和获得 四、外源DNA与载体DNA的切割与连接 五、宿主细胞的选择和基因导入操作 六、基因工程菌的稳定性及生长代谢的特点 七、基因工程菌中试 八、基因工程菌的扩增和发酵生产 九、基因工程药物的分离和纯化技术 十、变性蛋白的复性 十一、基因工程药物的质量控制 十二、基因工程药物的制造实例,三、外源DNA和目的基因的分离和获得,（一）基本操作方法 （二）不同类别DNA的提取技术 （三）目的基因的制备,（一）基本操作方法,细胞内的DNA大多与RNA及蛋白质形成复合物，需要经过提取、分离、纯化，才能获得高纯度的DNA。 1、操作条件 2、提取方法 3、分离方法 4、纯化方法,1、操作条件,（1）含盐的中性缓冲液-以防在除去蛋白质的时候，使核酸产生不可逆转的变性。 （2）低温条件-防止DNA在振荡、机械操作过程中的降解、断裂。 （3）使用核酸酶抑制剂（柠檬酸、砷酸盐、EDTA）-以防止DNA被酶解。,2、提取方法,（1）机械法-破坏细胞，释放出DNA。 （2）酶消化法-破坏细胞，释放出DNA。 （3）用酶使蛋白质变性-除去蛋白质之后，就剩下DNA。 （4）用酚、去垢剂使蛋白质变性-除去蛋白质，剩下DNA。,3、分离方法,是指从大分子的混合物中分离出DNA。具体方法有： （1）DEAE纤维素柱层析法。 （2）羟基磷灰石柱层析法。,4、纯化方法,分子筛层析法。 凝胶电泳法。 乙醇、三氯醋酸、聚乙二醇沉淀法。,（二）不同类别DNA的提取技术,1、质粒DNA的提取 2、细菌染色体DNA的提取 3、真核生物DNA的提取 4、病毒DNA的提取,1、质粒DNA的提取,细菌培养 质粒扩增 菌落收集 溶菌技术 分离技术-采用热或者碱使DNA变性，然后再进行冷却或者恢复到中性PH值，由于质粒DNA易于复性，而染色体DNA则不易复性、会沉淀下来 提纯技术-采用溴乙锭密度梯度离心、二碘丙锭的氯化铯密度梯度离心，质粒DNA插入染料区带较多、而染色体DNA插入染料区带则较少。从而可以分离。,2、细菌染色体DNA的提取,采用冻融、溶菌酶、EDTA处理、去垢剂处理使得细胞裂解。 裂解液用胰RNase和蛋白酶处理，使RNA和蛋白质降解。 残留蛋白质用酚溶液、或者用（酚：氯仿=1：1）溶液进行抽取和离心，使提大部分蛋白质因为变性而沉淀于有机相与水相之间。 含DNA的水相用乙醇沉淀，以获得丝状的DNA沉淀物， 沉淀物用缓冲液透析，除掉去垢剂和有机溶剂。 最后采用氯化铯（CsCl2）进行密度梯度离心法分离。,3、真核生物DNA的提取,（1）提取方法 同2 （2）注意事项 对于纯度要求较高的DNA，必须采用氯化铯（CsCl2）密度梯度离心法进行分离。 操作时要防止丢失线粒体DNA、和卫星DNA等密度异常成份。 要防止低分子量的DNA的污染。,4、病毒DNA的提取,用少量噬菌体感染宿主，然后用大量的培养基进行感染细菌的培养，最后全部细菌都会被噬菌体感染。此法适应于制备大多数噬菌体。,（三）目的基因的制备,目的基因：,准备要分离、改造、扩增或表达的基因。,需要克隆的DNA片段,编码某种蛋白质,研究某基因结构和功能的关系,研究某基因与疾病的关系,1、物理分离法 2、化学合成法 3、逆转录法 4、RT-PCR技术法 5、筛选新基因的其它新方法,1、物理分离法,（1）分离方法 （2）物理分离法实例,（1）分离方法,直接用酶切割、或者机械破碎分离法。DNA经过直接用酶切割、或者机械破碎之后，可产生编码不同基因的DNA片段，由于不同基因中的G-C碱基对含量、与A-T碱基对含量有差异，结果就导致它们之间的密度不同，因此通过分离技术+观察技术+鉴定技术结合，就能将其分离。 分离技术-平衡等密度离心法、凝胶电泳法、溴乙锭染色法。 观察技术-荧光显微镜观察。 鉴定技术-核酸杂交法、瑟萨恩印迹转移技术。,物理学密度梯度离心法,不同DNA片段，其密度不同，借此进行密度梯度离心，实现分离。,凝胶电泳分离技术,通过凝胶电泳，分段收集大小不同的DNA片段， 然后用快速转化法来检验其目的蛋白质，进行基因定位。实现分离。,（2）物理分离法实例,海胆组蛋白基因 苏芸金杆菌晶体蛋白基因 多角病毒的多角体蛋白基因 -半乳糖苷酶蛋白基因,2、化学合成法,（1）化学合成法的概念 （2）化学合成法的优缺点 （3）化学合成法的实例,（1）化学合成法的概念和分类,概念-以5或3-脱氧核苷酸、5-磷酰基寡核苷酸片段为原料，用化学方法，将其逐个缩合成基因的方法，称为化学合成法。 1976年H.G. Khorana提出了用化学方法合成基因的设想，并于1979年在science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文。 要求： 1、已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。 2、分子量较小的目的基因的制备,磷酸化,退火,DNA多聚酶Klenow 片段,限制性内切酶,分子克隆,基因的化学-酶促合成图解,（2）化学合成法的优缺点,化学合成法的优点-随意性强，可通过人工设计，进行合成、组装非天然基因，为实施蛋白质工程提供了强有力的手段，较小分子蛋白质或多肽编码的基因， 15-30bp效果最好，1天完成。现在可达到一次合成寡核苷酸片段长达50-60bp 化学合成法的缺点： （1）反应专一性不强、副反应多; （2）合成片段越长、分离纯化越困难、产率越低; （3）无法合成太长的基因，不能大于60bp; （4）人工合成基因时，遗传密码子的简并给选定密码子带来很大困难，人工合成时，遗传密码的简并性可导致中性突变; （5）合成费用较高。,（3）化学合成法的实例,讫今为止，通过化学合成方法已经了近百种产物的基因。主要有以下种类： 细菌酪氨酸t-RNA 人生长激素 干扰素 干扰素 血管紧张素 人胰岛素 人生长激素抑制释放因子 溶菌酶 组织血纤维蛋白溶酶原激活剂,3、逆转录法,（1）逆转录法的理由 （2）逆转录法的理论依据 （3）逆转录所产生的DNA的特性 （4）逆转录法的具体步骤 （5）逆转录法的实例,（1）逆转录法的理由,真核生物的基因不能直接分离，原因： （A）单一拷贝的基因只占到真核生物基因组的十万千万分之一，数量十分微小，这就导致直接从真核生物染色体上制备目的基因的极为困难。 （B）真核基因内一般都有内含子，会阻止基因的不正常表达。 （C）将真核基因导入到原核细胞之中，由于原核细胞中缺乏mRNA转录后的加工系统，因此，从真核基因转录出的mRNA无法提到加工处理，也就不能成为成熟的mRNA。,（2）逆转录法的理论依据,逆转录法就是从mRNAcDNADNAmRNAProtein的方法。 （A）提取真核细胞的mRNA。 （B）以mRNA为模板，在逆转录酶有作用下，反转录合成cDNA第一链。 （C）再以cDNA为模板，在DNA聚合酶的作用下，合成DNA互补双链。,（3）逆转录所产生的DNA的特性,（A）只反映mRNA经过加工之后的基因编码序列，而不象真核生物的原始DNA那样具有复杂的信息承载。 （B）不含内含子，可以在任何场合进行表达。,（4）逆转录法的具体步骤,A、mRNA的纯化 B、cDNA第一链的合成 C、cDNA第二链的合成 D、cDNA的克隆和重组 E、将重组体导入宿主细胞 F、cDNA文库的鉴定 G、目的cDNA克隆的分离和鉴定 H、cDNA目的基因的阳性克隆的鉴定和验证技术,A、mRNA的纯化,mRNA的3端常常含polyA，它能够吸附在寡聚脱氧胸腺苷酸Oligo dT-纤维素上，借此可以将mRNA与其它RNA进行分离。 当RNA提取液流经寡聚脱氧胸腺苷酸Oligo dT-纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异性地吸附在柱上，其它RNA成份则被冲刷走掉，最后，用低盐溶液或者蒸馏水冲刷纤维素柱，mRNA就被洗脱下来。 经过2-3次寡聚脱氧胸腺苷酸Oligo dT-纤维素柱之后，就可得到较高纯度的mRNA。,mRNA的分离,Oligo-dT纤维素柱,Oligo-dT磁珠法,B、cDNA第一链的合成,由于mRNA的3端常含polyA，所以可用寡聚脱氧胸腺苷酸Oligo dT做引物，在逆转录酶催化下，合成cDNA。 为测算cDNA的合成效率，可在合成体系中加入放射性标记的dNTP，如-32P-dATP、-32P-dCTP，这样就可通过放射自显影技术，来计算dNTP的渗入量。,C、cDNA第二链的合成,先用碱水解的方法，或用RNaseH酶解的方法，除去cDNA-mRNA杂交链中的mRNA链。 然后，再以cDNA第一链为模板，在DNA聚合酶的作用下，合成DNA互补双链。,mRNA,mRNA-cDNA Hybrid,nick,逆转录酶,RNase H,DNA聚合酶 T4连接酶,T4 DNA聚合酶处理形成平头末端,Nick Translation,cDNA的合成方法,D、cDNA的克隆和重组,（D1）、用于cDNA的克隆的载体 （D2）、cDNA的片段与载体的连接,（D1）、用于cDNA的克隆的载体,当cDNA的插入片段小于10Kb时，应选用质粒载体。 当cDNA的插入片段大于10Kb时，应选用噬菌体载体。 表达型-是指重组后插入的cDNA能够经过转录、翻译，最终合成蛋白质。 非表达型-是指重组后插入的cDNA不能经过转录、转译，合成蛋白质。 质粒 噬菌体 表达型 PUC gt11 非表达型 pBR322 gt10,（D2）、cDNA的片段与载体的连接,（1）借助同型多聚体尾巴的连接方法-用3-末端脱氧核苷酸转移酶催化，在cDNA的3末端加上polyG（或者polyT）的尾巴、而在载体的末端加上polyC（或者 polyA）的尾巴，就能够实现cDNA的片段与载体DNA的连接。 （2）加人工接头的连接法-所谓加人工接头的连接法，是指用采用T4DNA连接酶，在cDNA的末端加上人工接头，然后再使用特定的限制酶来切出粘性末端，从而实现与载体DNA的连接。,E、将重组体导入宿主细胞,噬菌体感染大肠杆菌形成噬菌斑。以便于使得质粒转化到大肠杆菌内。,F、cDNA文库的鉴定,表型鉴定法： （1）抗性基因失活法 （2）菌落颜色 （3）噬菌斑颜色改变 分子鉴定法： （1）凝胶电泳 （2）分子杂交 （3）DNA序列测定,G、目的cDNA克隆的分离和鉴定,（1）核酸探针杂交法-根据目的蛋白质纯品的氨基酸序列分析结果，人工合成相应的单链寡核苷酸作为探针，从cDNA文库分离特异的cDNA克隆。,（2）特异亲合鉴定法-对于那些表达水平低,不能纯化得到足量蛋白质的进行序列测定,利用一种能与靶蛋白特异结合的配体,从已构建的表达型重组文库中筛选该蛋白的基因。 已知的可在体内与靶蛋白相互作用的蛋白/小分子化合物 抗靶蛋白抗原决定簇的IgG 可被靶蛋白识别的小段DNA序列,（5）逆转录法的实例,通过逆转录法，已经合成了下列基因克隆株： （1）人生长激素 （2）-人干扰素 （3）-人干扰素 （4）人尿激酶。,4、RT-PCR技术法,1985，PCR发明以后，RT-PCR得到了广泛的应用。 特点： mRNA反转录合成cDNA第一链后，不用再合成cDNA第二链 只是在特异性引物作用下，扩增近g级的特异cDNA产物 通过RT-PCR成功克隆的基因： IL-2,3,6,9、G-CSF、TNF、IFN-等,是一种在体外利用酶促反应大量获得特异序列的基因组DNA或cDNA的专门技术，又称为无细胞的分子克隆。,聚合酶链反应（PCR）,模板DNA 引物 4种dNTP Taq DNA聚合酶 含Mg2+的缓冲液。,PCR的反应体系,（1）变性，加热至95 ，使模板DNA解开成单链； （2）退火，温度降至适宜，使引物与模板互补结合； （3）延伸，温度升至72 ，DNA聚合酶以4种dNTP为底物，在引物的3-OH上，合成与模板互补的DNA新链。,PCR的基本反应步骤及原理,PCR反应条件,变性 95C,延伸 72C,退火 Tm-5C,5,Primer 1,5,Primer 2,5,5,Template DNA,PCR基本工作原理,5、筛选新基因的其它新方法,岛屿获救PCR法,CpG岛富有G-C(60% )，有高含量的CpG二核苷酸。 CpG 岛含有罕见的Eag I、Sac I、BssHI酶切位点，每个酶在CpG岛的酶切频率为1-2次/岛。 CpG岛是很多基因5端的标志。 对GenBank数据库375个基因的统计，几乎所有的看家基因与40%的组织特异性基因与CpG 岛相关联。 Alu重复较均一的散布在基因组，约每3kb出现1次。 由CpG 岛延伸至相邻的Alu重复的探针应能用来分离与CpG 岛相关联的基因。,选泡状接头及泡状引物是为了保证PCR反应的选择性。泡状引物的序列与泡状接头里非互补区的一条链的序列相同。由于泡状引物不能与泡状接头里对应的链互补，只有Alu引物能够启动PCR反应进行第一个扩增循环，其后两个引物均能参与扩增。这样，不含Alu重复的DNA 片段将不能被扩增。,用罕见的限制酶切酵母人工染色体DNA，酶切片断连上泡状接头，用泡状引物和Alu特异引物PCR扩增。 所扩片断经琼脂糖凝胶电泳分离，找出特异片段来筛选cDNA文库。,酶切片断连上泡状接头,用泡状引物和Alu特异引物PCR扩增,罕见的限制酶切,凝胶分离特异片段筛选cDNA文库,获得特异片段,此法会漏掉不含CpG岛的基因。 如果Alu重复与CpG 岛相距太远而无法PCR扩增，相应的基因也会漏掉。 此法对分离基因5端十分有利，而基因5端常是最难克隆的。,粘粒DNA库经限制酶酶切(也可不用酶切，用超声处理并补平)并连上接头，然后用5生物素标记的引物(与接头1个臂的序列相同)做PCR扩增。,cDNA文库插入片断也用载体引物行PCR，然后与生物素标记的基因组片段杂交。,基因组DNA-cDNA复合物用链霉抗生物素蛋白覆盖的磁珠捕捉。除掉未结合的非特异性cDNA。捕捉到的cDNA洗脱后用载体引物行PCR扩增。,表达序列的磁珠捕捉法是具有代表性，利用磁场力对cDNA文库中目的基因进行富集的一种方法。,编码序列富集法,鸟枪法,先将供体细胞的染色体DNA，经过酶处理、或者物理学方法切割成基因水平的很多片段。 将每一片段和载体进行重组。 转化到受体菌中进行基因增殖。 采用适当的筛选方法，从众多的菌落中选出带有目的基因的菌株。 从选择出的菌株中回收重组DNA,鸟枪法的优缺点,鸟枪法的优点-采用鸟枪射击去命中“预定目标”的原理，该方法能够绕过直接分离目的基因的难关。 鸟枪法的难点-必须有一种有效的目的基因检测方法，常用mRNA作为探针，进行原位杂交法检验。,功能克隆法,可采用基因敲除技术、RNAi技术、酵母双杂交技术及流式细胞术，从基因水平、表达调控水平、蛋白质水平和细胞水平获得基因功能信息。,差异显示技术,利用mRNA差异显示技术、减数PCR技术、差减杂交技术寻找新基因。如通过比较正常组织和肿瘤组织某些基因和蛋白质的差异表达，寻找在肿瘤细胞中的高表达基因或沉默基因，从而推测可能是癌基因或抑癌基因。,差异展示PCR法（DD-PCR),原理：将具有两组细胞在某一条件下可表达的mRNA 群体通过逆转录方法变成相应的cDNA 群体，以此为模板，利用一对特殊引物，在一定条件下进行PCR扩增，得到与mRNA相对应的DNA。通过变性聚丙烯酰胺电泳，检测差异条带。,构建cDNA文库,依据表达序列标签EST，设计引物用PCR技术扩增基因组中特异片段。,四、外源DNA与载体DNA的切割与连接,DNA连接-目的基因DNA片段与载体DNA，在DNA连接酶作用下，通过形成磷酸二酯键，最终构成重组DNA分子的过程，称为DNA的连接。 粘接法-具有互补粘性末端的目的基因，与载体DNA，在DNA连接酶的作用下，通过形成共价键结合，称为粘结法。具体有插入灭活法、定向克隆法、载体脱磷克隆法、同聚接尾法、双接头法、合成连接一步法。 平接法-具有3-羟基、和5-磷酰基的平齐末端的DNA之间，在T4-DNA连接酶的作用下，通过形成共价键结合，称为平结法。 下面具体讲解6种方法。,（一）、插入灭活法,1、定义与方法 2、例子 3、优缺点,1、定义与方法,定义-将外源性基因插入到载体的选择性基因区域（标记区域）、并使这一选择性标记区域失活的连接法，称为插入灭活法。 方法-将外源性DNA与质粒用同一限制酶消化，并且限制酶的切割位点是在标记基因区域，当目的基因插入标记区域时，就使得标记基因失去表达作用。,2、例子,插入失活蓝白斑筛选技术,根据插入失活原理，筛选重组子。由于外源基因的插入，导致LacZ失去活性，菌落显白色，而未插入重组子的菌落显蓝色。,3、优缺点,优点-比较简单，容易操作。 缺点-杂合重组率低，在重组的产物中除了产生同时嵌合体重组DNA之外，还混有 （1）pBR322环合DNA、 （2）目的基因环合DNA、 （3）pBR322线性DNA、 （4）目的基因线性DNA。,（二）、定向克隆法,1、定义与方法 2、连接方式 3、优缺点,1、定义与方法,（1）定义-利用特异性的单一切点的限制酶，将目的基因按正确方向插入到载体DNA的方法，称为定向克隆法。 （2）操作依据-质粒载体一般都有多个限制酶的单一切点。 （3）方法-将外源DNA、pBR322同时用Hihd-III、BamH-I进行切割，那末，外源性目的基因、pBR322载体就会同时产生出Hihd-III粘性末端、BamH-I粘性末端。在进行退火时，外源性目的基因和载体之间就会按照粘性末端互补的原则进行连接。,(1)同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接,2、连接方式,3、优缺点,优点-在连接过程中，只要外源性目的基因、载体之间粘性末端不互补，就不会产生自身环化现象。 缺点： （1）若外源性基因不能以正确的方向插入到载体之中，则重组DNA在宿主中就不能表达。 （2）反应过程中仍然会产生自身线性聚合体。,（三）、载体脱磷克隆法,1、定义-载体DNA经过限制酶切割之后，再使用碱性磷酸酯酶水解，除去5-磷酰基，然后再与目的基因连接的方法，称为载体脱磷克隆法。 2、优点： （1）载体脱磷克隆法避免了载体DNA的自身环化现象， （2）也降低了载体DNA的线性聚合现象。 （3）能够提高杂合重组率，也能够提高转化效率。 3、缺点-无法避免目的基因的自身环化+目的基因的线性聚合现象。,（四）、同聚接尾法,1、定义 2、方法 3、优缺点,1、定义,在载体DNA、目的基因DNA的两端分别接上能够进行互相配对的同一碱基聚合单链，然后进行重组的方法，称为同聚接尾法,载体DNA,目的基因,限制酶或机械剪切,限制酶,5 3,3 5,5 3,3 5,5 3 A(A)nA,A(A)nA 3 5,-核酸外切酶,-核酸外切酶,末端转移酶 + dATP,末端转移酶 + dTTP,2、方法,（1）将载体DNA、目的基因DNA分别用限制酶切割。 （2）在小牛胸腺末端脱氧核苷酸转移酶的作用下，在载体两端3-OH上引入20-30个dG（或者引入50-150个dA）、在目的基因两端3-OH上引入20-30个dC（或者引入50-150个dT）。 （3）将混合物进行退火操作。 （4）用DNA聚合酶-I补足裂口处缺失的核苷酸。 （5）最后，在DNA连接酶的作用下，就可以形成环状重组DNA,3、优缺点,优点： （1）对载体、外源性DNA的切割部位无特殊限制。 （2）具有任何末端的载体、外源性DNA均可以通过此法进行重组。 （3）载体、外源性DNA均不产生自身环合现象+线性聚合现象。 （4）方法简单，应用范围广。 缺点-必须保证接尾后的基因片段中间不能存在裂口，否则，重组后的DNA将没有感染能力。,（五）、双接头法,1、定义 2、优缺点,人工接头及其应用,CCGAATTCG GGCTTAAGC,5- 3-,Eco R,1、定义,在目的基因两端分别接上不同的 linker，然后将其与载体同时用二种不同的限制酶进行切割，再将切割产物进行连接的方法。称为双接头法。 linker-用化学方法合成的、具有某些限制酶专一识别位点的、由8-12个脱氧核苷酸残基组成的单链。 linker的特性-其自身就可以形成互补双链。,2、优缺点,优点-适用于所有