老年人急性白血病MLL基因与免疫表达异常及预后的临床意义.doc

老年人急性白血病MLL基因与免疫表达异常及预后的临床意义作者：赵峻峰 王立新 张秀珑 蔡艳霞 房胜春【摘要】 目的 检测老年人急性白血病患者混合系白血病(MLL)基因表达水平，并对部分患者转录本进行动态检测，以观察治疗后基因表达量的变化，并检测其免疫表达异常率和比较治疗效果及与巢式PCR结果进行敏感度比较。方法 利用荧光实时定量PCR(RQPCR)技术检测MLL融合基因，观察白血病MLL基因的表达水平，分析MLL基因重排的发生频率和免疫表型异常的病例，进行化疗。对照MLL基因异常及免疫表达异常的临床意义。结果 41例老年白血病中7例检测到MLL基因，发生率为17.07%，其中MLLAF6 4例(24.5%);其中4例缓解，其MLL基因中位数均低于平均值。免疫表达异常在MLL基因中的检出率较无MLL重排发生频率高，为28.8%，发生率较无MLL基因重排高，且临床缓解率低。基因重排及异常表达与缓解率有关。结论 RQPCR监测融合基因表达可以有效观察治疗效果，敏感性高，MLL基因重排与白血病分子机制有关。其次免疫表达异常的患者MLL基因重排检出率相对较高，其临床缓解及疗效差，可能提示预后不良。 【关键词】 急性白血病;MLL基因;免疫表达异常老年人急性白血病是老年人常见的因造血干/祖细胞于分化过程的不同阶段发生分化阻滞、凋亡障碍和恶性增殖而引起的一组异质性造血系统恶性肿瘤，其往往病情危重，由于年龄因素化学治疗是常见或唯一的治疗方式。混合系白血病(MLL)基因，又称为髓系/淋巴系白血病基因，是一种转录调控因子，参与组成复杂的转录调控蛋白复合物。原发性急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓细胞性白血病(AML)和继发性白血病都可以出现MLL基因异常，具有MLL基因异常的白血病称为MLL相关白血病。MLL基因重排的致白血病机制目前尚不完全清楚，白血病细胞免疫表型测定是近些年诊断白血病的检查，不同类型白血病细胞其免疫标记物不同，当出现异常表达时，治疗的有效率可能存在差异。本文拟检测老年人急性白血病MLL基因重排的白血病细胞系以探索MLL基因与白血病免疫表达异常及疗效的相互关系，以揭示白血病中复杂而多变的致白血病分子机制，并确定其治疗意义。1 对象与方法1.1 对象 2005年9月至2010年4月我院血液科确诊初发或复发老年急性白血病41例，其中男19例，女22例，年龄6389(中位数74)岁;ALL 6例，AML 35例;初发37例，复发4例。用多重巢式PCR检测白血病相关融合基因及实时定量PCR(RQPCR)分析MLL基因重排的发生频率，检测白血病细胞的免疫表型，总结其免疫异常表达。所有病例均经临床、形态学、免疫学、组织化学染色、细胞遗传学确诊。1.2 方法1.2.1 标本采集 对41例老年人白血病的骨髓标本的MLL基因表达水平进行了检测，其中原始细胞百分比大于70%的29例，小于70%的12例;将患者分为MLL基因组及无MLL基因组。同时流式细胞仪检测白血病细胞的免疫表型。进一步分析MLL基因重排的类型、免疫表达异常及疗效的关系，并进行化疗。化疗方案为AML为HAA(阿克拉霉素20 mg/d 、14 d，阿糖胞苷0.2/d、17 d，高三尖杉酯碱5 mg/d、17 d)或DEA(阿糖胞苷0.2/d、17 d，柔红霉素4060 mg/d、13 d，依托泊苷0.1/d、17 d);ALL采用VAP(长春新碱2 mg、d1，泼尼松4060 mg/d、17 d，阿糖胞苷0.2/d、17 d，)、VDP(长春新碱2 mg、d1，柔红霉素4060 mg/d、13 d，泼尼松4060 mg/d、17 d，)等经典治疗方案，比较其缓解率。1.2.2 MLL基因表达水平的检测 制备质粒检测质粒及测序：采用常规TA载体克隆方案，将上述方法所得的融合基因克隆片段装入T载体中，并转染大肠杆菌菌株，经LB平板筛选，含氨苄西林80 U/ ml培养基培养后抽提、纯化重组质粒-20备用。对质粒行PCR反应，行电泳(同上)及测序确证质粒含有目的片段。质粒标准品的定量与稀释：运用紫外分光光度仪(UV2100型)对抽提的质粒进行定量测定，并根据公式计算其拷贝数以注射用蒸馏水连续10倍稀释定量的质粒，选择浓度范围为103108拷贝/l。1.2.3 MLL融合基因表达水平检测 骨髓经淋巴细胞分离液分离得到单个核细胞，采用RNA 纯化试剂盒(Gentra公司)提取总RNA，经紫外分光光度计测定A260 nm/A280 nm值。用Primer3 引物设计软件设计MLL、MLLAF9和GAPDH引物，所用cDNA序列为MLL(NM_005933)、AF9(NM_004529.1)和GAPDH(BC025925)。根据用SyBrGreen进行RTPCR的要求，为取得较高的扩增效率，PCR产物片段大小选择在200 bp左右，并选用相同的退火温度，保证这些PCR反应能在同一条件下进行。RTPCR前，均进行常规PCR，确定PCR反应条件，并纯化PCR产物进行测序，验证PCR扩增的特异性。1.2.4 流式细胞仪检测免疫表达 测定异常表达发生频率，FACS Calidur流式细胞仪：BD公司。标本为骨髓或外周血，所用单抗包括髓系CyMPO、CD13、CD33、CD14、CD15,T淋巴细胞系CD3、CD2、CD7、CD5，B淋巴细胞CD19、CD20、CD10、CD79A、CyCD22，CD34，结果判断阳性细胞>20%为阳性。具体方法参照文献1。1.3 统计学处理 应用SPSS11.5统计软件包，由于缓解期患者的原始细胞比例明显降低，未经分选的骨髓单个核细胞很难反映白血病细胞的特征，因此只选用原始细胞比例大于75%的初发或复发患者资料进行非参数的秩和检验(StudentNewmanKeuls检验)，并进行两两间秩和检验。2 结 果2.1 不同FAB分型的白血病MLL基因异常的发生频率 在非选择性取样的41例老年性急性白血病患者中，MLL重排的发生频率为17.07%，主要见于M4和M5型。AML中FAB分型情况与MLL基因重排的发生频率见表1，共检测到MLL重排7例，其中35例AML中有6例重排，发生频率为17.14%;6例ALL有1例重排，发生频率为16.67%,1例混合型白血病测到MLL基因;表明MLL基因重排可发生于AML、ALL。发现MLL重排见于M4、M5，发生频率分别为18.18%、37.5%，而M1、M2和M3均未检出MLL重排。见表1。表1 不同FAB分型的白血病MLL基因异常的发生频率2.2 各组病例MLL基因异常的类型 41例老年白血病中7例检测到MLL基因，发生率为17.07%，其中MLLAF6 4例(24.5%)。这组病例中MLL基因重排比例高。其中4例完全缓解，其MLL基因中位数均低于平均值，5例治疗无效，2例2疗程化疗后未缓解自动出院;缓解率36.45%。16例M5未检测到MLL基因，其中9例完全缓解，2例部分缓解，3例无效，1例死亡，缓解率73.3%。缓解率有明显差异(P<0.05)。将缓解后病例再次进行MLL融合基因表达水平检测，发现仅检测到2例仍有MLL异常(重排组)，为MLLAF6融合基因。见表2。表2 各组病例MLL基因异常的类型2.3 初发白血病组MLL表达水平 初发白血病组MLL表达水平222.14(50.391 374.75)106,n=41与缓解期组159.19(6.37166.08)106,n=4进行秩和检验(P=0.004)，有显著增高趋势。2.4 流式细胞仪检测免疫表达测定异常表达发生频率 41例老年性急性白血病患者中，免疫表达异常发生频率为19.51%，主要见于混合型、M2、M4和M5型。AML中FAB分型情况与免疫表达测定、MLL基因重排的发生频率见表3。共检测到免疫表达异常8例，其中有2例伴MLL重排，发生频率为4.87%，均未缓解;6例ALL有1例免疫异常表达，此例未测到MLL基因，发生频率为16.67%，1例混合型白血病测到免疫异常表达及MLL基因;MLL基因表达中免疫表达异常发生率25%，发生率较高;表明二者提示预后差。表3 老年人急性白血病MLL基因2.5 RQPCR测定的重复性和稳定性分析 根据待测基因的丰度，选择不同浓度10倍梯度稀释的质粒标准品进行RQPCR测定，用已知拷贝数和测定的CT值，绘制标准曲线。GAPDH所用标准品浓度为用104108拷贝/l，而MLL用102107拷贝/l。在所选范围内，质粒准品的CT值与起始模板量的对数呈很好的线性相关， PCR扩增的线性关系保持良好。GAPDH标准曲线的斜率接近-3.28，表明扩增效率高，而MLL基因标准曲线的斜率在-3.17左右，扩增效率稍低。实验中，GAPDH、MLL标准曲线的重复性好，保证了不同批次间的标本定量值有良好的重复性，相应的斜率、截距和相关系数见表4。表4 GAPDH、MLL标准曲线的重复性3 讨 论免疫表达是目前免疫分型常用的诊断方法，通过对白血病细胞大量表面抗原的测定，确定其细胞分型，确定化疗方案，判断预后。MLL相关白血病通常进展迅速，近些年研究认为，MLL相关白血病在形态学，基因表达谱研究也揭示MLL相关白血病是一种独立的白血病亚群2。MLL相关白血病是指具有MLL基因异常的白血病，这些异常最常见的是平衡易位，引起编码MLL基因氨基端部分的基因组序列与另一个配体基因的羧基端融合，当这些外显子转录、剪切和翻译后，产生一个读码框正确的具有癌基因活性的融合蛋白;其次是MLL与自身融合形成部分串联重复，即MLL PTD，通常出现于没有染色体易位的正常核型或11号染色体三体白血病患者;有些病例还可见到MLL基因的扩增2，3。在婴儿、儿童和成人的ALL和AML以及拓扑异构酶抑制剂治疗引起的继发性白血病中，都可以出现MLL基因异常，一般认为在AML中MLL融合基因的发生频率为5%10%，而ALL中也约为8%10%。其中在小于1岁的婴儿白血病中，70%80%有MLL融合基因，另外在继发性白血病中MLL重排的发生率也很高，大约占50%，尤其是继发于拓扑异构酶抑制剂的白血病4。AML病例大约还有10%具有MLL PTD，而没有明显重排的MLL基因扩增发生率低5。我们用多重巢式PCR能同时检测的MLL重排类型包括MLLAFX、AF1、AF4、AF6、AF9、AF10、ELL、ENL以及PTD。在41例老年性白血病中，发生频率为17.07%，较文献报道6高，可能与病例选择有关。MLL相关白血病通常病程进展迅速，预后较没有重排的患者差。不同类型的白血病代表造血细胞分化某一阶段后发生了白血病，但是MLL基因在不同类型白血病中表达情况的相关研究很少，迄今还没有定量检测的报道，也没有在不同白血病中MLL表达水平有无差异的报道。究其原因可能是由于MLL基因在多种组织表达7，8，而且在各型白血病中均有表达，表达水平差异不大，常规PCR难以发现这种差异，只有RQPCR的方法才有可能发现。李志刚等9在49例儿童AML中检出11例MLL重排，其中3例MLLAF9阳性。流式细胞仪检测免疫表达是目前免疫分型常用的诊断方法，通过对白血病细胞测定其细胞分型，确定化疗方案，判断预后。常用的标记物有所用单抗包括髓系CyMPO、CD13、CD33、CD14、CD15,T淋巴细胞系CD3、CD2、CD7、CD5，B淋巴细胞CD19、CD20、CD10、CD79A、CyCD22，CD34。目前针对免疫表达异常预示白血病预后各实验室报道有差异1。综上，我们发现老年人急性白血病MLL基因重排发生率较高，可能与白血病发生有关。免疫表达异常在MLL基因中的检出率较无MLL重排发生频率较高，且临床缓解率低，疗效差。二者可能提示预后不良。【参考文献】 1 Reading CL,Estey EH,Huh YO,et al.Expression of unusual immunophenotype combinations in acute myelogenous leukemiaJ.Blood,1993;81:308390.2 Ayton PM，Cleary ML.Molecular mechanisms of leukemogenesis mediated by MLL fusion proteinsJ.Oncogene，2001;(20)：5695707.3 Hess JL.MLL：a histone methyltransferase disrupted in leukemiaJ. Trends Molecular Med，2004;(10)：5007.4 Felix CA.Leukemias related to treatment with DNA topoisomerase inhibitorsJ.Med Pediatr Oncol，2001;36:52535.5 Daser A，Rabbitts TH.The versatile mixed lineage leukaemia gene MLL and its many associations in leukaemogenesisJ.Seminars Cancer Biol，2005;15:17588.6 Schoch C，Schnittger S，Klaus M,et al.AML with 11q23/MLL abnormalit