《生物化学实验》PPT课件.ppt

生物化学实验 Biochemical Experiment,实验基本知识,容 量 瓶,液体的量取,液体的倾倒,滴管的使用,试纸的使用,一定质量分数的溶液的配制,滤纸的折叠,物质分离与提纯过滤,萃取与分液,实验内容安排,共36学时 1、绪论 生物化学实验规则及常用仪器使用入门（2学时） 2、实验一 纸层析分离鉴定氨基酸 （6学时） 3、实验二 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 （4学时） 4、实验三 蛋白质的颜色反应 （2学时） 5、实验四 蛋白质的沉淀、变性反应 （3学时） 6、实验五 凝胶过滤法除蛋白质中的离子 （4学时）,7、实验六 酵母RNA的提取和鉴定 (4学时) 8、实验七 血糖含量的测定 （4学时） 9、实验八 脂肪酸的-氧化 （5学时） 10、实验报告讲解及考核 （2学时）,1 实验目的 掌握蛋白质、酶、核酸、糖等重要物质的分离、纯化和测定技术的原理及方法； 掌握生物化学的基本知识、基本理论及基本实验技能； 培养分析和解决问题能力以及严谨细致的科学作风、创新能力等综合素质。,绪 论,2 通过生物化学实验应该做到,学习设计一个实验的基本思路，掌握各个实验的基本原理，学会严密地组织自己的实验，合理地安排实验步骤和时间。 训练实验的动手能力，学会熟练地使用各种生物化学实验仪器。 学会准确翔实地记录实验现象和数据的技能，提高实验报告的写作能力，能够整齐清洁地进行所有的实验。 掌握生物化学的各种基本实验方法和实验技术，尤其是各种电泳技术和层析枝术，为今后参加科研工作打下坚实的基础。,3.1 实验记录 实验前写好实验预习报告(钢笔和园珠笔)。 实验中应及时准确地记录(专用纸，事先在记录纸上设计好各种记录格式和表格）所观察到的现象和测量的数据。 实验记录要注意有效数字，如吸光度值应为“0.050”，而不能记成“0.05”。每个结果都要尽可能重复观测二次以上，即使观测的数据相同或偏差很大，也都应如实记录，不得涂改。 实验中要详细记录实验条件，如使用的仪器型号、编号、生产厂等；生物材料的来源、试剂的规格、试剂的浓度等。,3 实验记录与实验报告,3 实验记录与实验报告,3.2 实验报告 实验报告的格式应为： 实验目的； 实验原理； 仪器、材料和试剂； 实验步骤； 结果讨论（含数理据处）； 注意事项; (7) 思考题 注意：实验结果的讨论要充分，尽可能多查阅一些有关的文献和教科书，充分运用己学过的知识和生物化学原理，进行深入的探讨，勇于提出自己独到的分析和见解，并欢迎对实验提出改进意见。,4 实验成绩评分方法,实验预习情况（10%） 实验操作情况（20%） 实验报告情况（70%）,生物化学实验技术理论,层析技术,1903年，俄国科学家M.C.Jber首创了一种从绿叶中分离多种不同颜色色素成分的方法，命名为色谱法(Chromatography)，由于翻译和习惯的原因又常称为层析法。 80多年来，层析法不断发展，形式多种多样。50年代开始，相继出现了分配层析、离于交换层析、凝胶层析、亲和层析、吸附层析等。 几乎每一种层析法都已发展成为一门独立的生化高技术，在生化领域内得到了广泛的应用。,一、层析技术,一、层析技术,1、层析技术原理 2、层析技术分类 3、常用层析技术原理,1、层析技术原理,层析原理：是一种物理的分离方法，利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两相中，其中一相为固定相，另一相流过此相称作流动相，并使各组分以不同速度移动，从而达到分离的目的。 可分离物质：糖类、有机酸、氨基酸、核苷酸。,2、层析技术分类,3、常用的层析原理,（1）分配层析纸层析 原理：溶质在互不相溶的两相中溶解度不同，在终点时达到一种平衡，其比值为一个常数，即分配系数（）。 固定相内溶质的浓度 流动相内溶质的浓度 固定相：滤纸上吸附的水 流动相：有机溶剂（正丁醇）, =,纸层析,纸层析是最简单的液一液相分配层析。 滤纸是纸层析的支持物。当支持物被水饱和时，大部分水分子被滤纸的纤维素牢牢吸附，因此，纸及其饱和水为层析的固定相，与固定相不相混溶的有机溶剂为层析的流动相。 对某些特定化合物，在特定的展层系统，一定的温度条件下，Rf是个常数。,（2）离子交换层析,原理：将能与周围介质进行离子交换的不稳定离子固定于惰性基质上，从而分离介质中的组分。 常用的惰性基质：人工合成树脂（单体：苯乙烯、交联剂：二乙烯苯） 阳离子交换剂：磺酸甲基、羧甲基、磷酸基 阴离子交换剂：二乙基胺乙基、三乙基胺乙基 可交换离子：阳离子：Na+、H+ 阴离子：Cl-、OH-,示意图（交换树脂表面）,示意图（离子交换过程）,电离基团（磺酸根）,可交换离子（钠离子）,交换离子,不交换离子,示意图,水分子,（3）吸附层析,原理：当气体或液体中某组分的分子在运动中碰到一个固体表面时，分子会贴在固体表面上并停留一定时间然后才离开，此为吸附现象。 吸附现象形成的原因：吸附作用可能由几种作用力形成，包括被吸附物与吸附剂之间相反电荷基团与基团之间的静电引力(形成离子键)、氢键及范德华引力等。 在不同条件 下，占主要地位的作用力可能不同，也可能几种力同时起作用 吸附剂：氧化铝、活性炭、硅胶；纤维素、淀粉、聚酰胺；滑石、陶土、粘土。,吸附层析示意图,吸附剂,易吸附分子,不易吸附分子,（4）亲和层析,原理：利用分子间具有专一亲和力而设计的层析技术。 专一亲和力分子对：酶与底物、特异性抗原与抗体、DNA和RNA、激素和其受体 载体：使亲和物固相化的水不溶性化合物。如：纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、聚苯乙烯、乙烯、多孔玻璃。,（5）凝胶过滤,原理：被分离物质因分子大小不同，在凝胶中向下移动的速度不同。 物质进入凝胶柱之后有两种运动方式：垂直向下移动和无定向的扩散运动。大分子物质直径大无法进入凝胶颗粒内，只能分布于颗粒间隙中向下移动快，而小分子物质可扩散到凝胶颗粒内，因此向下移动慢。 凝胶物质：马铃薯淀粉凝胶、琼脂、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶。,电 泳 技 术,一.电泳的概念 二.电泳技术分类 三.电泳技术基本原理 四.几种常见电泳方法的比较 五.聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳原理,一.电泳的概念,带电质点在电场中移动的现象。,二.电泳技术分类,三.电泳技术基本原理,1.基本原理 不同的带电颗粒在同一电场中泳动速度，主要与其所带净电荷量，分子量及分子形状有关。 pH pI 分子带负电荷,在电场中向正极移动; pH pI分子带正电荷,在电场中向负极移动; 泳动度,2.影响电泳速度的因素,(1) 电场强度 泳动速度与电场强度成正比 常压电泳(100500V). 210V/cm，几小时或几天；蛋白质等大分子物质; 高压电泳(5001000V). 20200V/cm，几分钟；氨基酸、小肽、核苷酸等小分子物质; （2）溶液的pH值 pH距待分离物质的pI越远，泳动速度越大； （3）溶液离子强度 离子强度越小,电动势越大,泳动速度越快。 （4）电渗现象：在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。,四.几种常见电泳的比较,五.聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳原理,1.原理 具有电泳和分子筛的双重作用 2.聚丙烯酰胺凝胶的聚合 单体：丙稀酰胺（Acr） 交联剂：甲叉双丙稀酰胺交联剂(Bis) 催化剂 聚合形成的三维网状结构。,五.聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳原理,2.聚丙烯酰胺凝胶的聚合 催化剂 （1）过硫酸铵-TEMED系统 碱性条件下催化作用 温度与聚合快慢成正比 （2）核黄素-TEMED系统 光激发的催化反应 用量少，对分析样品无影响 聚合时间可自由控制,五.聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳原理,3.聚丙烯酰胺凝胶的孔径 凝胶越浓T，凝胶孔径，所受阻力，机械强度 丙稀酰胺浓度 分离物质分子量 4 大于100万 77.5 1100万 1530 小于1万 胶的孔径为蛋白质分子平均大小一半时效果好 凝胶强度的选择 先用7.5%的标准凝胶或4%-10%的凝胶梯度测试,五.聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳原理,4.缓冲系统的选择 pH、离子种类和离子强度 酸性蛋白质 高pH 碱性蛋白质 低pH 连续和不连续系统 电泳槽中的缓冲系统和pH 与凝胶相同 电泳槽中的缓冲系统和pH 与凝胶相同，分辨率高,5.盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳原理,（1）盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的四个不连续性 A.凝胶层的不连续性 浓缩胶T=2.8 C=20%；分离胶T=7 C=2.5% B.缓冲液成分的不连续性： 凝胶缓冲液Tris-HCl,含Cl，电极缓冲液Tris-Gly,Gly C.pH的不连续性： 浓缩胶pH6.7,分离胶pH8.9，电极缓冲液pH8.3 D.电位梯度的不连续性,5.盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳原理,（2）盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的三种效应 样品的浓缩效应 电荷效应 分子筛效应,A. 样品的浓缩效应,缓冲液成分及pH的不连续性 浓缩胶pH6.7 缓冲液 浓缩胶Tris-HCl, 电极缓冲液Tris-Gly 解离度 ：Cl 蛋 Gly mclclm蛋蛋m Gly Gly 凝胶中Cl为快离子， Gly为慢离子，蛋白质样品被夹在中间。,缓冲液成分及pH的不连续性导致蛋白质样品浓缩效应示意图,快离子 慢离子 蛋白质样品,E：每厘米的电压降 EI(电流强度)/(电导率) E与电泳速度成正比 电泳开始后，由于快离子泳动率最大，在快离子后面形成一个离子浓度低的低电导区，产生较高的电位梯度，使蛋白质和慢离子加速移动，蛋白质样品被进一步浓缩。,电位梯度的不连续性,E：每厘米的电压降 EI(电流强度)/(电导率) E与电泳速度成正比 电泳开始后，由于快离子泳动率最大，在快离子后面形成一个离子浓度低的低电导区，产生较高的电位梯度，使蛋白质和慢离子加速移动，蛋白质样品被进一步浓缩。,电位梯度的不连续性,A. 样品的浓缩效应,四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括： 缓冲液成分及pH的不连续性 电位梯度的不连续性,A. 样品的浓缩效应,四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括： 凝胶层的不连续性： 样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3) 蛋白质从“”极向“”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。,A. 样品的浓缩效应,四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括： 凝胶层的不连续性： 样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3) 蛋白质从“”极向“”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。,A. 样品的浓缩效应,四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括： 凝胶层的不连续性： 样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3) 蛋白质从“”极向“”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。,A. 样品的浓缩效应,四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括： 凝胶层的不连续性： 样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3) 蛋白质从“”极向“”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。,B.电荷效应,蛋白质样品进入分离胶后 pH增大(pH 8.9)，Gly解离度增大，不存在快、慢离子之分，蛋白质样品在均一电场强度和pH条件下泳动。 由于各种蛋白质pI不同，所载有效电荷不同，因此质点的 有效迁移率不同，形成不同区带。,C.分子筛效应,分离胶的孔径小，各分子由于大小和形状不同，所受阻力不同，表现出不同的 泳动速度，即分子筛作用。分子量小，形状为球形的泳动速度最快。,实验一 氨基酸的分离与鉴定 滤纸层析法,一、实验目的,1.通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法 2.掌握氨基酸纸上层层析法的操作技术（点样、平衡、展层、显色、鉴定） .,二、实验原理,1.是分配层析的一种。在纸上水被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相。当有机相沿纸流动经过层析点时，层析点上溶质就在水相和有机相之间进行分配，溶质中各组分的分配系数不同，移动速率也不同，因而可以彼此分开。 2.氨基酸与茚三酮的显色反应。 3.物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值来表示的。在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。 Rf,4. Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、PH层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。 5.上层层析、下层层析、单向层析、双向层析。,三、仪器、材料和试剂,实验仪器 1层析缸、培养皿、小烧杯、长颈漏斗 2毛细管、吹风机、电热鼓风干燥箱 3层析滤纸、手套 、透明胶带或针线 实验材料和试剂 1氨基酸溶液 分别配制0.5%的Lys、Alu、Ile、Met溶液及它们的混合液（各组份浓度均为0.5%）。 2显色剂 0.1%水合茚三酮丙酮溶液。 3扩展剂（展层剂） 酸溶剂系统：正丁醇:80%甲酸:水15:3:2（体积比），平衡溶剂与扩展剂相同。每组配制30ml 碱溶剂系统：正丁醇:12%氨水:95%乙醇13:3:3（体积比），平衡溶剂为12%氨水。,四、操作步骤与方法,1将盛有扩展剂10ml的小烧杯和培养皿置于密闭的层析缸中。 2戴手套取层析滤纸一张作标记。 3。点样：干后重复点一次，直径最大不超过3mm。缝成筒状，两边不能接触。点样面朝外，点样端朝下，盖上层析缸盖，平衡约2030分钟。 4.展层 用长颈漏斗，扩展剂的液面需低于点样线1cm。上沿约1厘米时，取出滤纸，用铅笔标出溶剂前沿界线，干燥。 5显色 用0.1%茚三酮丙酮溶液均匀浸透，烘箱（65）5分钟或用热风吹干。脯氨酸、羟脯氨酸产生黄色物质外，所有氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮产生兰紫色物质。,五、实验结果与讨论,六、注意事项,1切勿用手直接接触滤纸和显色剂。 2. 点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴。 3使用的溶剂系统需新鲜配制，并要摇匀。,七、思考题：,1做好本实验的关键是什么？ 2实验操作过程，为何不能用手接触滤纸？ 3影响Rf值的因素有哪些？,实验二 血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳,实验原理 实验材料与仪器 实验试剂 实验步骤,实验原理,醋酸纤维薄膜电泳(CAME)是以醋酸纤维薄膜(CAM)作支持物的一种 区带电泳技术。醋酸纤维素薄膜是纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸 酯。将它溶于有机溶剂（如：丙酮，氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂 抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状结构，渗 透性强，对分子移动阻力小，厚度为120m 。 本实验以醋酸纤维素薄膜为电泳支持物，分离人血清蛋白。血清蛋白中含有清蛋白、 1球蛋白、2球蛋白、球蛋白、球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、分子量、等电点及形状不同，在电场中的迁移速度不同。分子量小、等电点低的，在相同碱性PH缓冲体系中，带负电荷多的蛋白质颗粒在电场中迁移速度快。例如人血清蛋白在 PH8.6的缓冲体系中电泳，染色后可显示5条区带。清蛋白泳动最快，其 余依次是球蛋白 。,实验材料与仪器,（一）、材料：人血清 （二）、仪器 醋酸纤维薄膜(8X2mm)；点样器；染色皿，漂洗器， 镊子；玻璃板；常压电泳仪；直流电源整流器；水平电泳 槽；粗滤纸；直尺和铅笔,实验试剂,巴比妥缓冲液(pH8.6 I=0.06)；氨基黑10B染色液；漂洗液；95乙醇45ml、冰醋酸5ml；蒸馏水50ml；洗脱液 0.4molLNaOH；透明液；无水乙醇；冰醋酸7：3,实验步骤,1浸泡：用镊子取醋酸纤维薄膜放在缓冲液中浸泡20分 钟。 2点样：把膜条从缓冲液中取出，夹在两层粗滤纸内吸干 多余的液体，然后铺在玻璃板上(无光泽面朝 上)，将点样器在血清中沾一下（量薄薄一层为 好），再在膜条一端2-3厘米处轻轻水平地落下 并随时提起，这样即在膜条上点上了细条状的血 清样品。,3电泳：在电泳槽内加入缓冲液，使两个电极槽内的液面 等高，将膜条平悬于电泳槽支架的滤纸桥上。膜 条点样的一端放在负极上。通电，电流强度每条 膜1mA(注意强度),电泳时间约为50分钟。 4染色：电泳完毕后将膜条取下并放在染色液中浸泡5分 钟。 5漂洗：将膜条从染色液中取出后移置到漂洗液申漂洗数 次至无蛋白区底色脱净为止，可得到色带清晰的 电泳图谱。 6透明：将脱色后干燥的电泳图谱膜条放入透明液中浸泡 23分钟后取出平铺在玻璃板上,用一直径0.5cm 的玻璃棒将其间的气泡赶出,两者之间不能有泡。 干燥后此透明薄膜,区带着色清晰,可用于光吸收扫 描,长期保存不褪色。,思考题：,.为什么将薄膜的点样端放在滤纸桥的负极端？ .用乙酸纤维素薄膜作为电泳支持物有何优点？,实验三 蛋白质的性质实验 蛋白质及氨基酸的呈色反应,一、实验目的,（1）了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。 （2）学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。,二、实验原理,双缩脲反应 尿素加热至180左右，生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性环境中能与Cu2+结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。可用于蛋白质的定性或定量测定。 双缩脲反应不仅为含有两个以上肽键的物质所有。含有一个肽键和一个CSNH2，CH2NH2，CRHNH2，CH2NH2CHNH2CH2OH或CHOHCH2NH2等基团的物质也有此反应。NH3干扰此反应，因为NH3与Cu2+可生成暗蓝色的络离子Cu（NH3）42+。因此，一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。,茚三酮反应,除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。该反应十分灵敏，11 500 000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。 茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。 此反应的适宜pH为57，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。,黄色反应,含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成橙黄色的硝醌酸钠。 多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸才有黄色反应。,乙醛酸反应,在浓硫酸存在下，色氨酸与乙醛酸反应生成紫色物质，反应机理尚不清楚，可能是一分子乙醛酸与两分子色氨酸脱水缩合形成与靛蓝相似的物质。含有色氨酸的蛋白质也有此反应。,三、仪器、材料和试剂,实验仪器 试管；试管架；漏斗；铁架台；滴管；试剂瓶；水浴锅。 实验材料和试剂 尿素；10%氢氧化钠溶液；1%硫酸铜溶液；2%卵清蛋白溶液；0.5%甘氨酸溶液；0.1%茚三酮水溶液；大豆提取液；头发；指甲；0.5%苯酚溶液；浓硝酸；0.3%色氨酸溶液；0.3%酪氨酸溶液；冰醋酸、浓硫酸。,四、操作步骤与方法,取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷后，加10%氢氧化钠溶液约1ml，振荡混匀，再加1%硫酸铜溶液1滴，再振荡。观察出现的粉红颜色。要避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。向另一试管加卵清蛋白溶液约1ml和10%氢氧化钠溶液2ml，摇匀，再加1%硫酸铜溶液2滴，随加随摇。观察紫玫瑰色的出现。,双缩脲反应实验操作,茚三酮反应实验操作,取2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液1ml，再各加0.5ml0.1%茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热12分钟，观察颜色由粉色变紫红色再变蓝。 在一小块滤纸上滴一滴0.5%甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴一滴0.1%茚三酮乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。,黄色反应实验操作,向7个试管中分别按下表加入试剂，观察各管出现的现象，有的试管反应慢可略放置或用微火加热。待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入10%氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化。,乙醛酸反应实验操作,取3支试管。编号。分别按上表加入蛋白质溶液、色氨酸溶液和水，然后各加入冰醋酸2毫升，混匀后倾斜试管，沿管壁分别缓缓加入浓硫酸约1毫升，静置。观察各管液面间紫色环的出现。若不明显，可于水浴中微热。,五、思考题：,1.茚三酮反应的阳性结果是否经常是同一色调？并说明原因。 2.你能区分蛋白质茚三酮反应及其他氨基化合物茚三酮反应的结果吗？试解释之。 3.能否利用茚三酮反应可靠地鉴定蛋白质的存在？ 4.哪些芳香基因（蛋白质中的、非蛋白质中的）可以与浓硝酸作用呈现黄色反应的阳性结果？,实验四 蛋白质的变性、沉淀反应,一、实验目的,（1）加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。 （2）了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。 （3）了解蛋白质变性与沉淀的关系。,二、实验原理,在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。蛋白质的沉淀反应可分为两类。 （1）可逆的沉淀的反应 此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来的溶剂中，并保持其天然性质而不变性。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质。提纯蛋白质时，常利用此类反应。,（2）不可逆沉淀反应 此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。加热引起的蛋白质沉淀与凝固，蛋白质与重金属离子或某些有机酸的反应都属于此类。 蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷），并不析出。因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。,三、仪器、材料和试剂,实验材料和试剂 0.2%鸡蛋清溶液；pH4.7 醋酸-醋酸钠的缓冲溶液；3%硝酸银溶液；5%三氯乙酸溶液；95%乙醇；饱和硫酸铵溶液；硫酸铵结晶粉末；0.1 molL-1盐酸溶液；0.1 molL-1氢氧化钠溶液；0.05 molL-1碳酸钠溶液；0.1 molL-1醋酸溶液；甲基红溶液；2%氯化钡溶液；10%NaOH；饱和的NaCl；10%醋酸。,四、操作步骤与方法,1盐析：加5%卵清蛋白溶液5 ml于试管中，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球蛋白的沉淀。倒出少量混浊沉淀，加少量水，观察是否溶解，为什么？将管中内容物过滤，向滤液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止，此时析出的沉淀为清蛋白。 取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察沉淀的再溶解。 2重金属离子沉淀蛋白质：重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复合物。 取1支试管，加入蛋白质溶液2 ml，再加3%硝酸银溶液12滴，振荡试管，有沉淀产生。放置片刻，倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？为什么？ 3某些有机酸沉淀蛋白质：取1支试管，加入蛋白质溶液2 ml，再加1 ml5%三氯乙酸溶液，振荡试管，观察沉淀的生成。放置片刻，倾出上清液，向沉淀中加入少量水，观察沉淀是否溶解。,4加热沉淀蛋白质：取5支试管，编号。依下表顺序加入试剂： 将各管混匀，观察记录各管情况，然后，放沸水浴中加热10min，注意观察各管的沉淀情况，最后将第3、4、5号管分别用10%NaOH或10%醋酸中和，观察并解释实验结果。,5乙醇引起的变性与沉淀：取3支试管，编号。依下表顺序加入试剂： 振摇混匀后，观察各管有何变化。放置片刻，向各管内加水8 ml，然后在第2、3号管中各加一滴甲基红，再分别用0.1 molL-1醋酸溶液及0.05 molL-1碳酸钠溶液中和之。观察各管颜色的变化和沉淀的生成。每管再加0.1 molL-1盐酸溶液数滴，观察沉淀的再溶解。解释各管发生的全部现象。,五、思考题：,1. 鸡蛋清为何可做铅、汞中毒的解素剂？ 2氯化汞为何能做为杀菌剂？,实验五 凝胶过滤法使蛋白质脱盐,一、实验目的,学习凝胶过滤法分离纯化物质的原理与操作技术。,二、实验原理,凝胶过滤也称凝胶层析，其分离纯化物质的原理是，凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排阻在外部，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子质量被分开了。此法可用于测定蛋白质的分子质量、样品的浓缩和脱盐等方面。,目前常用的凝胶有葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶，其中最常用的是葡聚糖凝胶。葡聚糖凝胶的商品名称为Sephadex，它是葡萄糖通过-1，6-糖苷键形成的葡聚糖长链，与交联剂环氧氯丙烷以醚键相互交连而成的具有三维空间的多孔网状结构物，呈珠状颗粒。,三、仪器、材料和试剂,实验仪器 铁架台；层析柱；滴定管夹；刻度离心管；白瓷板；Sephadex G-25（粒度粗，50100目）；细乳胶管 ；螺旋夹 ；烧杯。 实验试剂 10% 磺柳酸；纳氏试剂（萘斯特试剂）；蛋白质(NH4)2SO4溶液；无离子水（洗脱液）,四、操作步骤与方法,1. 溶胀凝胶：用去离子水浸泡Sephadex G-25凝胶24h以上（中间换一次水）或用去离子水沸水浴溶胀2h左右。 2. 凝胶装柱：按实验教程要求安装层析装置，将溶胀好的SephadexG-25装入层析柱中。 3. 洗柱：接通洗脱液，按要求洗柱并调整好流速。 4. 加样洗脱：吸取1ml样品（蛋白质硫酸铵溶液），小心地加到床面上，拧松螺旋夹，待样品全部进入凝胶柱中，接通洗脱液，开始洗脱并收集洗脱液。 5. 收集检查：每管收集1ml洗脱液。取洗脱液2滴加入白瓷板穴中，加入纳氏试剂1滴，如有铵盐洗脱下来，则有黄红色沉淀。取洗脱液2滴置小试管中，加入磺柳酸1滴，如有蛋白质洗脱下来，则有白色混浊或沉淀出现。,五、思考题：,1. 利用凝胶层析分离混合物时，怎样才能得到较好的分离效果？ 2. 还有哪些方法可进行蛋白质脱盐？ 3. 蛋白质溶液中的盐分为何能通过凝胶过滤方法被脱除？ 4. 凝胶过滤法在蛋白质分析中还有何应用？,实验六 酵母RNA的分离及组分鉴定,一、实验目的,(1)学习稀碱法提取RNA的原理和操作方法。(2)了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法。,二、实验原理,酵母核酸中RNA含量较多。RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到RNA的粗制品。 核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。,三、仪器、材料和试剂,实验仪器 1乳钵 2150mL锥形瓶 3水浴 4量筒 5布氏漏斗及抽滤瓶 6吸管 7滴管 8试管及试管架 9烧杯 10离心机 11漏斗。 实验试剂 1氯化铁浓盐酸溶液 2苔黑酚乙醇溶液 3定磷试剂 （1）17硫酸溶液 将17 mL浓硫酸(比重184)缓缓加入到83mL水中。 （2）25钼酸铵溶液 将25g钼酸铵溶于100mL水中。 （3）10抗坏血酸溶液 10 g抗坏血酸溶于100 mL水中，贮棕色瓶保存。溶液呈淡黄色时可用，如呈深黄或棕色则失效，需纯化抗坏血酸。 临用时将上述3种溶液与水按如下比例混合。 17硫酸溶液:2.5钼酸铵溶液:10抗坏血酸溶液:水=1:1:1:2(VV)。 4酵母粉,四、操作步骤与方法,1.提取 将15 g酵母悬浮于90 mL 0.04 molL氢氧化钠溶液中，并在乳钵中研磨均匀。将悬浮液转移至150毫升锥形瓶中。在沸水浴上加热30分钟后，冷却。离心(3 000rmin)15分钟，将上清液缓缓倾人30 mL酸性乙醇溶液中。注意要一边搅拌一边缓缓倾人。待核糖核酸沉淀完全后，离心(3000rmin)3分钟。弃去清液。用95乙醇洗涤沉淀两次，乙醚 洗涤沉淀一次后，再用乙醚将沉淀转移至布氏漏斗中抽滤。沉淀可在空气中干燥。 取200mg提取的核酸，加入1.5 molL硫酸溶液10mL，在沸水浴中加热10分钟,2、制成水解液并进行组分的鉴定 （1）嘌呤碱 取水解液1 mL加入过量浓氨水，然后加入约1 mL 01 molL硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱的银化合物沉淀。 （2）核糖 取1支试管加人水解液1 mL、三氯化铁浓盐酸溶液2mL和苔黑酚乙醇溶液02 mL。放沸水浴中10分钟。注意溶液是否变成绿色，说明核糖的存在。 （3）磷酸 取1支试管，加入水解液1 mL和定磷试剂I mL。在水浴中加热，观察溶液是否变成蓝色，说明磷酸是否存在。,五、思考题：,1如何得到高产量RNA的粗制品? 2本实验RNA组分是什么?怎样验证的?,实验七 血糖含量的测定（Folin-Wu法）,一、实验目的,（1）理解血糖在生物体内的重要意义。 （2）掌握Folin-Wu法测定血糖含量的原理和方法。,二、实验原理,1.血糖指的是血液中哪一种糖？ 葡萄糖是血液主要的糖类，因此测血糖含量就是测血液中葡萄糖的含量。 2.用什么方法测定？ 测定血液中葡萄糖的含量，即测复杂组分中一种物质的量，根据生化实验基本技术的原理，可采用分光光度法（比色法）进行测定。 3.葡萄糖可以用比色法直接测定吗？ 不行，可以用间接的方法。血液中的葡萄糖与碱性硫酸铜溶液共热，铜离子即被血液中的葡萄糖还原成氧化亚铜，后者又可使钼酸试剂还原成低价的钼蓝（蓝色）。血糖的含量与产生的氧化亚铜成正比，氧化亚铜的量与形成的钼化合物的量成正比，可以用比色的方法进行测定。,三、仪器、材料和试剂,实验仪器 分光光度计、血糖管、奥氏吸管、水浴锅、表面皿（仪器的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审定）。 实验试剂 1、标准葡萄糖溶液 （1）1%（m/V）葡萄糖母液 称取葡萄糖1.0g，溶于蒸馏水中，然后用100ml容量瓶定容至刻度。 （2）标准葡萄糖溶液 用移液管吸取1%葡萄糖母液1.0ml，放入100ml容量瓶内，然后定容至刻度。,实验试剂,2、碱性硫酸铜溶液（A、B液） （1）A液：称取无水碳酸钠35.0g，酒石酸钠13.0g及碳酸氢钠11.0g，用蒸馏水溶解，然后用1000ml容量瓶定容至刻度。 （2）B液：称取硫酸铜5.0g，用蒸馏水溶解，然后用100ml容量瓶定容至刻度，加几滴浓硫酸作为保存剂。 碱性硫酸铜（现配现用） 取A液25ml,B液5ml，混合后，再用A液定容至50ml，摇匀。该混合液在4冰箱里可保存数日，如果暴露于阳光下，数小时即失效。,实验试剂与材料,3、酸性钼酸盐溶液 称取钼酸钠104.6g，置烧杯中用蒸馏水溶解，倒入500ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，然后移入另一较大的试剂瓶中，加溴水0.5ml，摇匀，静置数小时。置于1000ml容量瓶中，缓慢加入85%（V/V）H3PO4225ml，边加边摇匀。再加入25%（V/V）硫酸150ml，置暗处至次日，用空气将剩余的溴赶去，加入冰乙酸75ml，摇匀，加蒸馏水稀释至1000ml，贮存于棕色瓶中。 4、10（m/V）钨酸钠溶液 5、0.33mol/L硫酸溶液 6、动物血（家兔心脏取血）,四、操作步骤与方法,1.无蛋白血滤液的制备 先在烧杯中加0.8g左右的抗凝剂（草酸钾或草酸钠），从家兔心脏取血10ml放入烧杯，振荡摇匀。 用奥氏吸管吸取已加抗凝剂的全血1ml，缓缓放入20ml锥形瓶中，加水7ml，摇匀，血液变成红色透明时加10钨酸钠1ml，摇匀，再加 0.33mol/L 硫酸，随加随摇，加完放置515min，至沉淀由鲜红变为暗棕色，滤纸过滤。每毫升无蛋白血滤液相当于0.1ml全血。,2.血糖的测定 取具25ml刻度的血糖管3只，编号，用奥氏吸管吸取无蛋白血滤液2ml，放入第一只血糖管中，于第二只血糖管中加2ml标准葡萄糖溶液。第三只血糖管中加2ml蒸馏水。然后各加2ml新配置的碱性硫酸铜溶液，同时置沸水浴内煮6min，取出，在流水中迅速冷却，各加入4ml酸性钼酸盐溶液，1min后以蒸馏水稀释至25ml，混匀，倒入比色杯，用722型风光光度计于420440nm波长比色（先以空白管调节零点，然后测标准管和样品管）。,3.计算 按下式计算100ml全血中所含的血糖质量（mg）。 mA1C0A00.1100 式中：m：100ml血中所含的糖质量 C0：标准葡萄糖溶液浓度 A1：样品溶液吸光度 A0：标准溶液吸光度,五、注意事项,1.欲得准确结果，所取血液的量必须准确。如果由吸管中放出血液的速度太快，会有大量血液粘在吸管内壁，容量不准，所以一般放出1ml血液所用的时间不应少于1min。