荧光定量PCR的原理及应用.ppt

,大型仪器管理中心 黄雪玲 2010-9-27,实时荧光定量PCR 原理及其应用,荧光定量PCR仪的应用,基础研究中基因表达丰度的测定； 差异基因的表达检测，基因型分析； 临床医疗领域病原体的检测和基因诊断：包括特定基因的检测、细菌和病毒等病原体的检测； 环境监测，包括水质、空气的污染检验； 检验检疫工作：食品卫生检验，转基因作物的检验； 法医的遗传学鉴定；,PCR的反应过程,Cycle,Fluorescence,实时荧光定量PCR,实时荧光定量PCR （ Real-time Q-PCR ）技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积，实时监测整个PCR进程，最后通过参照标准曲线对反应体系中未知模板进行定量分析的方法。,实时荧光定量PCR中的三个概念,增长曲线 (primary curve) 荧光阈值（threshold) CT 值(Cycle Threshold),增长曲线 反映荧光强度与循环数的对应关系,Cycle,Fluorescence,域值：PCR扩增信号进入相对稳定对数增长期时的荧光值。,荧光域值（Threshold）的设定,Ct值 Ct值:C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。,Ct值与起始模板的关系 每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。起始拷贝数越多， CT值越小；模板DNA的起始拷贝数越少，CT值越大。 一般正常的CT值范围在15-35之间，过大和过小都将影响实验数据的精度。,荧光定量PCR标记方法 内掺式染料 SYBR Green I 序列特异性探针 Taqman Molecular Beacons Dual Probes(FRET) 引物特异性探针 Amplifluor (Intergen),SYBR-Green I,SYBR-Green I,SYBR Green I,优点： 使用方便，可以应用于不同的模板 灵敏，便宜 缺点： 与非特异性产物结合，但可以通过熔解曲线进行辨别,熔解温度(Tm值),Tm值：50%DNA变成单链时的温度，此温度与双链DNA的长度、GC含量有关，可部分代表序列的特异性。,Melt Curve Analysis,双标记探针（Taqman Probe）,优点： 对目标序列有很高的特异性，在病原微生物特异性检测上有独特优势 设计简单，准确性好 缺点： 只适合于一种特异目标的检测，相对价格略高,双标记探针（Taqman Probe）,荧光定量PCR实验技术路线,查询目的基因序列 选择合适的荧光标记方法 选染料法则购买SyBr Green I或相应试剂盒；探针法则设计并合成荧光探针 设计特异引物或探针,引物设计的一般原则： 产物长度在80-300bp之间 产物GC含量在50-60%之间 引物的GC含量在50-60%之间，熔解温度在55-65之间 应避免引物中有连续的G或C，但推荐在引物的末端含有G或C Primer 5.0 /Scitools/Applications/PrimerQuest/Default.aspx?SequenceWarning=True,荧光定量PCR实验技术路线,实验时先对普通PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，在条带特异的情况下才能采用染料法进行荧光定量PCR实验 注意 模板浓度：在普通PCR基础上可以稀释10100倍 引物浓度：0.4 0.9 M （一般略低于PCR引物量） 荧光物质浓度：按说明书操作，根据实验结果优化 加样准确性：避免微小加样,荧光定量PCR实验技术路线,模板 Plasmid DNA 目的片段在Plasmid DNA 中很易被扩增，可以适当稀释 Total DNA 目的片段在Total DNA中丰度相对较低，因此Total DNA量要略高于Plasmid DNA cDNA 以cDNA为模板时一般将反转录产物原液稀释1050倍后作模板,荧光定量PCR实验技术路线,荧光定量PCR反应灵敏，微小差异都能被反映，实验中要避免核酸污染，尤其是避免PCR产物污染。 试剂反复冻融对实验也有影响，各组分采用少量分装保存 低浓度模板反复冻融容易降解，少量分装保存,定量方法,绝对定量 相对定量,标准曲线 由系列稀释的已知浓度的样品做标准曲线 计算待测样品的浓度,log N0 =- Ct logE +logN,绝对定量未知浓度的样品与标准曲线相比较,绝对定量,标准品：含有目的片段的浓度已知的核酸 绘制标准曲线时，一般选取4-5个点（多于5个更好），被选点的模板浓度范围要包括待测样本浓度,相对定量在一定样本中靶基因相对于另一参照样本的量的变化,只需要了解相对于参照样本目的基因的表达量的变化量，而不需要确切的知道基因的表达量具体是多少，采用相对定量即可。 比较的依据是实验时不同样本的总核酸模板一致 用表达量基本恒定的看家基因作为内参照来体现上样模板的量,比较CT法（ CT ） 前提：每个循环增加一倍的产物数量，靶基因和看家基因的扩增效率基本一致 双标准曲线法 利用两组标准曲线分别得到目的基因及持家基因的表达量 样本目的基因表达量=,相对定量方法,目的基因标准曲线测得值 持家基因标准曲线测得值,目标基因与持家基因扩增效率差别举例,对于每一个稀释梯度，都用 GAPDH 和 c-myc 引物进行扩增。计算出 c-myc 和 GAPDH 的平均CT值以及CT值，通过 cDNA 浓度梯度的 log 值对CT值作图，如果所得直线斜率绝对值接近于 0 ，说明目标基因和内标基因的扩增效率相同，就可以通过 C T 方法进行相对定量。,Kenneth J. Livak and Thomas D. Schmittgen,METHODS 25, 402408 (2001),相对定量方法二双标准曲线法,当两个扩增反应效率不同或者不方便证明的时候，则需要通过双标准曲线的方法来进行相对定量；或者也可以重新设计