BMPsⅡ型突变受体真核表达载体的构建与鉴定.doc

BMPs型突变受体真核表达载体的构建与鉴定【关键词】BMPs型突变受体关键词:BMPs型突变受体；真核表达载体0引言骨形成蛋白（BMPs）不仅在骨，软骨及与骨骼有关的结缔组织的形成上有重要作用，而且起着十分重要的调控作用1.与其他TGF-超家族成员一样，BMPs在细胞表面与BMP的，型受体相互作用，型受体可以和过量的配体结合，而型受体与配体的结合则是特异性的2.tBRK3k为BMPs型突变受体，其可以阻断BMP的信号转导，这样，BMP就无法发挥其骨诱导及在胚胎发育，器官形成及细胞分化中的作用.因此，为研究BMPs信号转导在组织发育和细胞分化中的作用，我们构建了BMPs型突变受体的真核表达载体，为此方面研究的开展奠定了基础.1材料和方法1.1材料pSP64TL-tBRK3k质粒为含有BMPs型突变受体cDNA的克隆质粒，由日本的Nohno教授（Kawasaki医学院分子生物所）提供.真核表达载体pCDNA3（neo）购自本校生物化学教研室.限制性内切酶及T4DNA连接酶均购自华美公司.DNA回收纯化试剂盒购自原平公司.1.2酶切鉴定及回收3将pSP64TL-tBRK3k和pCDNA3（neo）用Hind和Xba双酶切，经0.8%琼脂糖凝胶电泳分别得到0.6，2.9和5.4kb的片段，用试剂盒回收纯化0.6kb和5.4kb的片段.1.3连接、转化和克隆筛选3取上述tBRK3k片段5L和pCDNA3（neo）片段各2L，加入T4DNA连接酶、缓冲液和无菌水各1L，16连接过夜.制备大肠杆菌DH5的感受态并转化.挑取单个菌落，液体LB培养基37振摇过夜，小提质粒，酶切鉴定筛选出阳性克隆，命名为pC-4.2结果2.1pSP64TL-tBRK3k和pCDNA3的酶切鉴定pSP64TL-tBRK3k质粒经双酶切后，得到2.9kb和0.6kb两个片段；pCDNA3（neo）经双酶切后，得到一个5.4kb的片段，符合二者的物理图谱（图1）.图1略2.2pC-4的酶切鉴定pC-4经Hind和Xba双酶切后，得到0.6kb和5.4kb两个片段，证明tBRK3k基因已成功连入到pCDNA（neo）中（图1）.3讨论TGF-超家族的成员都结合二种特异受体发挥作用，分别叫做型受体（约5055KD）和型受体（约7080KD）4.和其他TGF-超家族成员一样，BMPs在细胞表面与，型受体相互作用.型受体可以和过量的配体结合，而型受体与配体的结合则是特异性的.因此，为研究BMPs信号转导在机体发育中的作用，我们将突变型BMPs型受体（tBRK3k）定向克隆到pCDNA3（neo）表达载体中（图2）.图2略pCDNA3（neo）可用于在哺乳动物细胞系表达外源基因，全长5.4kb.其表达系统构件包括:CMV启动子，SV40复制起始点，SV40polyA，SV405端和3端剪切序列等，多聚接头有11个可供利用的单一酶切位点.pC-4真核细胞表达载体可用于研究BMPs信号对间充质细胞分化的调控，对于研究和阐明BMPs在机体发育中的作用有重要意义.参考文献:1WozneyJM，RosenV.Bonemorphogeneticproteinandmorpho-geneticgenefamilyinboneformationandrepairJ.ClinOr-thop，1998；346:26-37.2EstevezM，AttisanoL，WranaJLetal.Thedaf-4geneencodsabonemorphogeneticproteinreceptorcontrollingc.elegansdauerlarvadevelopmentJ.Nature，1993；365:644-649.3J.萨姆布鲁克，EF.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯.分子克隆实验指南M.第2版.北京:科学技术出版社，1992:34-56.4HeldinCH，MiyazonoK，TenDijkeP.T