ω3脂肪酸预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤保护机制的研究

同 等学 力人员 硕士学位论文 论文题目 -3 脂肪酸预处理对大鼠肝脏缺血再灌注 损伤保护机制的研究 研究生姓名 明葛东 指导教师姓名 孙庆林 专 业 名 称 儿科学 研 究 方 向 小儿普外科 论文提交日期 2013 年 3 月 -3 脂肪酸预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤保护机制的研究 中文摘要 I -3 脂肪酸预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤保护机制的研究 中文摘要 目的： 应用大鼠肝缺血再灌注模型，探讨 -3 脂肪酸预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤保护机制。 方法： 将 60 只大鼠随机分为假手术组（ S 组 )、肝缺血再灌注损伤模型组 (hepatic ischemia reperfusion injury, HIRI)及肝脏缺血再灌注前 -3 多不饱和脂肪酸 (omega-3 polyunsaturated fatty acids, -3 PUFAs)预处理组（ 组 ），建立大鼠缺血再灌注损伤模型，分别予以缺血 60 分钟，恢复血流后再灌注 l 小时和 6 小时后取材。 各组分别于再灌注末抽取静脉血、处死大鼠，收集肝组织。观察血清中谷丙转氨酶 (alanine aminotansferase, ALT)、谷草转氨酶 (aspartate aminotansferase, AST)含 量； HE 染色观察肝组织病理学改变；酶联免疫吸附法 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)测定大鼠血清丙二醛 (malondialdehyde, MDA)、超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase, SOD)含量；免疫组化方法检测肝组织中 核转录因子（ nuclear transcription factor, NF-B） 的表达 水平。 结果： 与 S 组比较， HIRI 组和 组血清 ALT、 AST 水平、血清 MDA 含量及NF-B表达均显著升高，而血清 SOD 活性明显 下降 (P0.05)，肝组织病理学损伤明显；与 HIRI 组比较， 组血清 ALT、 AST 的活性、血清 MDA 含量及 NF-B表达均显著降低，而血清 SOD 活性则明显升高 (P0.05)，肝组织病理学损伤较轻。 结论： -3 PUFAs 预处理 对大鼠肝脏缺血再灌注损伤具有一定的保护作用，其机制可能通过减少氧自由基的产生及减轻脂质过氧化反应，进而抑制 NF-B 的活化来实现。 关键词： 肝；缺血再灌注损伤；缺血预处理； NF-B； -3 PUFAs； 作 者 ：明葛东 指导老师 ：孙庆林 教授 Abstract The protective effect of omega-3 fatty acids preconditioning on hepatic ischemia-reperfusion injury in rats II The protective effect of omega-3 fatty acids preconditioning on hepatic ischemia-reperfusion injury in rats Abstract Objective: To investigate the effect and mechanism of the omega-3 fatty acids preconditioning on hepatic ischemia-reperfusion injury in rats. Methods: Sixty healthy SD rats were randomly divided into 3 groups. Each group was divided into 20 subgroups based on the time of reperfusion(1h, 6h).The model of hepatic ischemia-reperfusion injury was established the level of ALT,AST and the liver histological changes were examined after HE staining. Serum concentrations of MDA levels and SOD were detected by enzymelinked imm unosorbentassay(ELISA).The expression of NF-B in the nucleus was evaluated by the method of Western blotting. Results: The serum levels of ALT,AST and MDA,the expression of NF-B and the damage of liver tissue in model and test groups were significantly higher and the serum levels of SOD was significantly lower than in S group (P0.05). Omega-3 fatty acids preconditioning significantly ameliorated the deleterious effects of I/R and I/R-induced liver tissue damage. Conclusion: Omega-3 fatty acids preconditioning, has a protection against hepatic ischemia-reperfusion injury in rats. The mechanism of protection may be associated with its scavenging of radical, inhibition of lipid peroxidation decrease of suppression of NF-B activation. Key words: liver； ischemia-reperfusion injury； ischemic preconditioning； NF-B； omega-3 fatty acids； Written by: Ming Gedong Supervised by: Sun Qinglin 目 录 引 言 . 1 材料与方法 . 3 结 果 . 10 讨 论 . 13 结 论 . 17 附 图 . 18 参考文献 . 30 综 述 . 33 英文缩略词表 . 40 致 谢 . 42 -3 脂肪酸预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤保护机制的研究 引 言 1 引 言 缺血再灌注损伤 (ischemia reperfusion injury, IRI)是在缺血的基础上恢复血流后，加重组织器官损伤的现象，是外科常见 的一种损伤。 这种现象首先由 Sewell于 1955年通过 结扎狗冠状动脉 发现，并在之后的大量动物实验中普遍得到证实。 IRI在严重的感染、创伤、休克、心肺功能不全、肝移植等病理生理过程中起着越来越重要的作用。目前，肝移植 (1iver transplantation, LT)已成为全球公认的治疗终末期肝病唯一有效的手段 1。肝 脏 缺血再灌注损伤 )好发于休克及多种肝脏外科手术中，是 严重 影响肝移植、肝脏叶段切除术后肝功能的一个多因素过程 2。在肝脏缺血再灌注损伤中，炎症介质通过中性粒细胞对肝脏起到破坏作用 3-4， 从而 对 肝功能造成非常严重的损伤。核因子 NF-B在肝脏缺血再灌注损伤的发展 过程 中，对一些促炎症因子基因的表达起着 非常 重要的调节作用 5， NF-B的过度表达，会诱发全身炎症反应综合征 （ superoxide dismuase, SIRS） ，甚至导致多脏器器官功能衰竭 （ multiple organ organ failure, MODS） ，是当今临床中肝脏移植术后早期失败的主要原因之一。为了防止和减轻肝脏移植中缺血再灌注损伤提供理论依据，近年来对肝脏缺血再灌注损伤 的 研究已经成为了一个全球 共同 关注的热点课题。 肝 脏缺血再灌注损伤的确切机制目前仍不清楚，已有的研究提示可能与氧自由基的大量生成、钙 离子 超载、肝脏微循环受损以及高能磷酸化合物的合成减少有关，其中氧自由基在肝脏缺血再灌注损伤过程中起 着 非常重要的作用 ，但迄今为止尚无共识。而近些年在细胞层面、基因层面和分子层面上提出的一些新理论，使其机制的研究得到了进一步的完善和准确。现在许多科研机构针对可能的机制进行了 大量 研究，也提出了许多 行之 有效的防治 措施 ：有缺血预处理法、药物预处理法、祖国传统医药疗法及一些基因、细胞层次上的疗法，也都取得了很好的效果。其中， 药物 预处理 法根 据该种疾病的病理生理学特征，从各个不同的角度提出治疗方法，因此药物疗法是最全面、最多元化的一种疗法。针对机制中的氧自由基损伤学说，寻找一种较为安全 而 高效的药物降低肝脏在缺血再灌注损伤中的损害程度，从而具有较高的意义，如何减轻肝脏的缺血再灌注损伤是目前研究的热点之一。 -3多不饱和脂肪酸作为一种肠外营养制剂，富含主要药理成份为二十碳五烯酸 (eicosapentaenoicacid, EPA)和二十二碳六烯酸 (docosahexaenoicacid, DHA)。这一新型引 言 -3 脂肪酸预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤保护机制的研究 2 脂肪乳剂由于具有抑制炎症和调节免疫的作 用 6-8，因而备受关注。其 既 可作为抗氧化剂，置换细胞膜磷脂中的花生四烯酸，抑制环氧酶和脂氧合酶；也可通过改变细胞膜磷脂的脂肪酸成分来影响细胞膜的流动性和膜上相关信号分子、酶及受体的功能，从而改变信号传导过程， 调节 炎症反应。 目前已有大量动物实验研究表明 -3 PUFAs具有： (1)抑制过度炎症反应、调控炎症反应的作用： -3 PUFAs (主要活性成分 EPA和 DHA)与能置换细胞膜磷脂中的花生四烯酸，竞争 相同的环氧化酶和脂质过氧化酶来 减 少 源于花生四烯酸的炎性介质 释放 ，从而抑制过度炎症反应的发生和发展 9； (2)免疫调节作用 ： -3 PUFAs还可通过改变细胞膜磷脂的构成，影响细胞的流动性和细胞膜上相关信号分子、酶、受体的功能，从而改变信号转导，影响细胞因子的表达、抑制促炎介质的形成，以 达 到免疫调节的作用 10-12； (3)对肝 脏、 肾 脏 等重要器官都具有一定的保护作用。 但其具体机制仍不清楚， 另有 大量 临床实践 证明， -3 PUFAs在脓毒症、全身炎症反应综合征、严重创伤、外科大手术后等重症患者的治疗上 亦 都取得了 显著 的疗效。 目前国内外关于报道 -3 PUFAs 在 肠、心脏、肾脏等器官缺血再灌注损伤 方面 保护机制 研 究 的 文献不少，但对 肝脏缺血再灌注损伤的 报道比较少。为客观评价 -3 PUFAs 对 肝脏缺血再灌注损伤 的 保护作用，为采用 -3 PUFAs 防治 肝脏缺血再灌注损伤 提供科学依据， 本文按 Kolhi13方法，用成年 SD 大鼠建立肝脏缺血再灌注模型，研究正常组 、 HIRI 组 及 -3 PUFAs 预处理组各组大鼠 血清中谷丙转氨酶 、 谷草转氨酶含量 、血清 丙二醛 、 超氧化物歧化酶含量、 NF-B 的表达情况及肝脏组织病理学改变情况，研究 -3 PUFAs 对 HIRI 的可能保护机制，从而为将来的临床工作中应用 -3 PUFAs 对肝脏缺血再 灌注损伤的保护提供实验依据。 -3 脂肪酸预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤保护机制的研究 材料与方法 3 材料与方法 一、主要试剂与仪器 （一）实验试剂 1、 -3 脂肪酸购自华瑞制药有限公司 ， 国药准字 J20100092。 2、总 SOD 活性检测试剂盒（ NBT 法）购自碧云天 公司。 3、脂质氧化 MDA 检测试剂盒购自碧云天 公司。 4、 血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶试剂盒由苏州大学附属儿童医院检验科提供。 5、核转录因子（ NF-B）盒购自福州迈新生物技术公司。 6、 10%福尔马林由上海化学试剂采购供应站提供，批号 32061。 7、丙酮、生理盐水、磷酸盐缓冲液、异丙醇、无水乙醇、苏木素液 、盐酸乙醇分化液等由苏州大学儿科研究所提供。 8、 PBS 液苏州大学附属儿童医院检验科提供。 9、一抗、二抗购自 Abcam 公司。 （二）实验仪器 1、流式细胞仪（美国贝克曼 -库尔公司 EPICS XL） 。 2、 722 光栅分光光度计（上海第三分析仪器制造厂） 。 3、荧光显微镜 LEICA（德国） 。 4、温控高速离心机 D-37520 Osterode(德国 )。 5、电光分析天平 TG328A（上海天平仪器厂） 。 6、电热恒温水温箱 HH.W21.Cu600（上海医疗仪器七厂） 。 7、超低温（ -80 ）冰箱（海尔公 司） 。 8、电子秤（瑞士 Mm7LER 公司） 。 9、 PHILIPS CM-120 透射电镜（德国） 。 10、超薄切片机 LEICA,型号 RM2235（德国） 。 11、切片漂烘温控仪 Op-B1(中国 )。 12、 AU400 全自动生化分析仪：日本 Olymmpus 公司。 材料与 方法 -3 脂肪酸预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤保护机制的研究 4 13、移液器： Gilson 公司， 10 l,20l,10l,1ml 规格 。 14、脱水机 LEICA,型号 TP1020（德国） 。 15、包埋机 BMJ-III（常州中威电子仪器厂） 。 二、实验对象 健康、雄性 Sprague-Dawley(SD)大鼠 60只，体重 200-250克， 由苏州大学实验动物中心提供 。许可证 SCXK(苏 )2007-2013。 三、实验设计 （一）动物模型的建立 参照 Kolhi13法建立大鼠肝脏局部缺血再灌注 损伤 模型，用无创小血管夹阻断通往中肝叶及左肝叶血流、肝管蒂，造成 70%肝脏缺血，但不阻断右肝叶血流， 60 分钟后去除血管夹复流，关腹。（见下图）。 假手术组：同上方法，麻醉、开腹后仅游离肝门血管、胆管蒂，不做任何处理后关腹。 （二）分组 ： 随机分为三组 将 60 只大鼠随机分为假手术组（ sham operation)、肝缺血再灌注损 伤模型组 (HIRI组 )及肝脏缺血再灌注前 -3 脂肪酸 预处理组（ 组 ），每组 20 只。 1、假手术（ sham, S）组：术中只牵拉分离肝十二指肠韧带，不阻断肝脏血流，分别 于 1 小时、 6 小时 每个时间点随机抽取 10 只 后 取材 同时 断 颈 处死大鼠 。 2、 HIRI 组：肝脏 缺血前 10 分钟 经下腔静脉注入 生理盐水 4ml/kg，用无创小血管夹阻断通往中肝叶及左肝叶血流、肝管蒂，造成 70%肝脏缺血，缺血 60 分钟，恢 -3 脂肪酸预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤保护机制的研究 材料与方法 5 复血流后， 分别 于 1 小时、 6 小时 每个时间点随机抽取 10 只 后取材 同时 断 颈 处死大鼠 。 3、 组： 肝脏 缺血前 10 分钟 经下腔静脉注入 生 理盐水 2ml/kg+-3 PUFAs 2ml/kg，其余操作同 HIRI 组。 四、实验方法 1、标本的提取：所有 大鼠 实验前 均 禁食 12 小时 ，自由饮水，称重，腹腔内注射3%戊巴比妥钠 30mg/kg，起效后迅速固定，常规备皮、消毒、铺单后上腹部正中切口进腹，显露肝脏，分离肝十二指肠韧带，假手术组术中只牵拉分离肝十二指肠韧带，不阻断肝脏血流， HIRI 组