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ω3脂肪酸预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤保护机制的研究ω3脂肪酸预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤保护机制的研究 -- 260 元

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同等学力人员硕士学位论文论文题目ω3脂肪酸预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤保护机制的研究研究生姓名明葛东指导教师姓名孙庆林专业名称儿科学研究方向小儿普外科论文提交日期2013年3月ω3脂肪酸预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤保护机制的研究中文摘要Iω3脂肪酸预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤保护机制的研究中文摘要目的应用大鼠肝缺血再灌注模型,探讨ω3脂肪酸预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤保护机制。方法将60只大鼠随机分为假手术组(S组、肝缺血再灌注损伤模型组hepaticischemiareperfusioninjury,HIRI及肝脏缺血再灌注前ω3多不饱和脂肪酸omega3polyunsaturatedfattyacids,ω3PUFAs预处理组(ω组),建立大鼠缺血再灌注损伤模型,分别予以缺血60分钟,恢复血流后再灌注l小时和6小时后取材。各组分别于再灌注末抽取静脉血、处死大鼠,收集肝组织。观察血清中谷丙转氨酶alanineaminotansferase,ALT、谷草转氨酶aspartateaminotansferase,AST含量HE染色观察肝组织病理学改变酶联免疫吸附法enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA测定大鼠血清丙二醛malondialdehyde,MDA、超氧化物歧化酶superoxidedismutase,SOD含量免疫组化方法检测肝组织中核转录因子(nucleartranscriptionfactor,NFκB)的表达水平。结果与S组比较,HIRI组和ω组血清ALT、AST水平、血清MDA含量及NFκB表达均显著升高,而血清SOD活性明显下降P0.05,肝组织病理学损伤明显与HIRI组比较,ω组血清ALT、AST的活性、血清MDA含量及NFκB表达均显著降低,而血清SOD活性则明显升高P0.05,肝组织病理学损伤较轻。结论ω3PUFAs预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤具有一定的保护作用,其机制可能通过减少氧自由基的产生及减轻脂质过氧化反应,进而抑制NFκB的活化来实现。关键词肝缺血再灌注损伤缺血预处理NFκBω3PUFAs作者明葛东指导老师孙庆林教授AbstractTheprotectiveeffectofomega3fattyacidspreconditioningonhepaticischemiareperfusioninjuryinratsIITheprotectiveeffectofomega3fattyacidspreconditioningonhepaticischemiareperfusioninjuryinratsAbstractObjectiveToinvestigatetheeffectandmechanismoftheomega3fattyacidspreconditioningonhepaticischemiareperfusioninjuryinrats.MethodsSixtyhealthySDratswererandomlydividedinto3groups.Eachgroupwasdividedinto20subgroupsbasedonthetimeofreperfusion1h,6h.ThemodelofhepaticischemiareperfusioninjurywasestablishedthelevelofALT,ASTandtheliverhistologicalchangeswereexaminedafterHEstaining.SerumconcentrationsofMDAlevelsandSODweredetectedbyenzymelinkedimmunosorbentassayELISA.TheexpressionofNFκBinthenucleuswasevaluatedbythemethodofWesternblotting.ResultsTheserumlevelsofALT,ASTandMDA,theexpressionofNFκBandthedamageoflivertissueinmodelandtestgroupsweresignificantlyhigherandtheserumlevelsofSODwassignificantlylowerthaninSgroupP0.05.Omega3fattyacidspreconditioningsignificantlyamelioratedthedeleteriouseffectsofI/RandI/Rinducedlivertissuedamage.ConclusionOmega3fattyacidspreconditioning,hasaprotectionagainsthepaticischemiareperfusioninjuryinrats.Themechanismofprotectionmaybeassociatedwithitsscavengingofradical,inhibitionoflipidperoxidationdecreaseofsuppressionofNFκBactivation.KeywordsliverischemiareperfusioninjuryischemicpreconditioningNFκBomega3fattyacidsWrittenbyMingGedongSupervisedbySunQinglin目录引言..............................................................................................................................1材料与方法......................................................................................................................3结果............................................................................................................................10讨论............................................................................................................................13结论............................................................................................................................17附图............................................................................................................................18参考文献........................................................................................................................30综述............................................................................................................................33英文缩略词表................................................................................................................40致谢............................................................................................................................42ω3脂肪酸预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤保护机制的研究引言1引言缺血再灌注损伤ischemiareperfusioninjury,IRI是在缺血的基础上恢复血流后,加重组织器官损伤的现象,是外科常见的一种损伤。这种现象首先由Sewell于1955年通过结扎狗冠状动脉发现,并在之后的大量动物实验中普遍得到证实。IRI在严重的感染、创伤、休克、心肺功能不全、肝移植等病理生理过程中起着越来越重要的作用。目前,肝移植1ivertransplantation,LT已成为全球公认的治疗终末期肝病唯一有效的手段1。肝脏缺血再灌注损伤好发于休克及多种肝脏外科手术中,是严重影响肝移植、肝脏叶段切除术后肝功能的一个多因素过程2。在肝脏缺血再灌注损伤中,炎症介质通过中性粒细胞对肝脏起到破坏作用34,从而对肝功能造成非常严重的损伤。核因子NFκB在肝脏缺血再灌注损伤的发展过程中,对一些促炎症因子基因的表达起着非常重要的调节作用5,NFκB的过度表达,会诱发全身炎症反应综合征(superoxidedismuase,SIRS),甚至导致多脏器器官功能衰竭(multipleorganorganfailure,MODS),是当今临床中肝脏移植术后早期失败的主要原因之一。为了防止和减轻肝脏移植中缺血再灌注损伤提供理论依据,近年来对肝脏缺血再灌注损伤的研究已经成为了一个全球共同关注的热点课题。肝脏缺血再灌注损伤的确切机制目前仍不清楚,已有的研究提示可能与氧自由基的大量生成、钙离子超载、肝脏微循环受损以及高能磷酸化合物的合成减少有关,其中氧自由基在肝脏缺血再灌注损伤过程中起着非常重要的作用,但迄今为止尚无共识。而近些年在细胞层面、基因层面和分子层面上提出的一些新理论,使其机制的研究得到了进一步的完善和准确。现在许多科研机构针对可能的机制进行了大量研究,也提出了许多行之有效的防治措施有缺血预处理法、药物预处理法、祖国传统医药疗法及一些基因、细胞层次上的疗法,也都取得了很好的效果。其中,药物预处理法根据该种疾病的病理生理学特征,从各个不同的角度提出治疗方法,因此药物疗法是最全面、最多元化的一种疗法。针对机制中的氧自由基损伤学说,寻找一种较为安全而高效的药物降低肝脏在缺血再灌注损伤中的损害程度,从而具有较高的意义,如何减轻肝脏的缺血再灌注损伤是目前研究的热点之一。ω3多不饱和脂肪酸作为一种肠外营养制剂,富含主要药理成份为二十碳五烯酸eicosapentaenoicacid,EPA和二十二碳六烯酸docosahexaenoicacid,DHA。这一新型引言ω3脂肪酸预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤保护机制的研究2脂肪乳剂由于具有抑制炎症和调节免疫的作用68,因而备受关注。其既可作为抗氧化剂,置换细胞膜磷脂中的花生四烯酸,抑制环氧酶和脂氧合酶也可通过改变细胞膜磷脂的脂肪酸成分来影响细胞膜的流动性和膜上相关信号分子、酶及受体的功能,从而改变信号传导过程,调节炎症反应。目前已有大量动物实验研究表明ω3PUFAs具有1抑制过度炎症反应、调控炎症反应的作用ω3PUFAs主要活性成分EPA和DHA与能置换细胞膜磷脂中的花生四烯酸,竞争相同的环氧化酶和脂质过氧化酶来减少源于花生四烯酸的炎性介质释放,从而抑制过度炎症反应的发生和发展92免疫调节作用ω3PUFAs还可通过改变细胞膜磷脂的构成,影响细胞的流动性和细胞膜上相关信号分子、酶、受体的功能,从而改变信号转导,影响细胞因子的表达、抑制促炎介质的形成,以达到免疫调节的作用10123对肝脏、肾脏等重要器官都具有一定的保护作用。但其具体机制仍不清楚,另有大量临床实践证明,ω3PUFAs在脓毒症、全身炎症反应综合征、严重创伤、外科大手术后等重症患者的治疗上亦都取得了显著的疗效。目前国内外关于报道ω3PUFAs在肠、心脏、肾脏等器官缺血再灌注损伤方面保护机制研究的文献不少,但对肝脏缺血再灌注损伤的报道比较少。为客观评价ω3PUFAs对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用,为采用ω3PUFAs防治肝脏缺血再灌注损伤提供科学依据,本文按Kolhi13方法,用成年SD大鼠建立肝脏缺血再灌注模型,研究正常组、HIRI组及ω3PUFAs预处理组各组大鼠血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶含量、血清丙二醛、超氧化物歧化酶含量、NFκB的表达情况及肝脏组织病理学改变情况,研究ω3PUFAs对HIRI的可能保护机制,从而为将来的临床工作中应用ω3PUFAs对肝脏缺血再灌注损伤的保护提供实验依据。ω3脂肪酸预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤保护机制的研究材料与方法3材料与方法一、主要试剂与仪器(一)实验试剂1、ω3脂肪酸购自华瑞制药有限公司,国药准字J20100092。2、总SOD活性检测试剂盒(NBT法)购自碧云天公司。3、脂质氧化MDA检测试剂盒购自碧云天公司。4、血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶试剂盒由苏州大学附属儿童医院检验科提供。5、核转录因子(NFκB)盒购自福州迈新生物技术公司。6、10福尔马林由上海化学试剂采购供应站提供,批号32061。7、丙酮、生理盐水、磷酸盐缓冲液、异丙醇、无水乙醇、苏木素液、盐酸乙醇分化液等由苏州大学儿科研究所提供。8、PBS液苏州大学附属儿童医院检验科提供。9、一抗、二抗购自Abcam公司。(二)实验仪器1、流式细胞仪(美国贝克曼库尔公司EPICSXL)。2、722光栅分光光度计(上海第三分析仪器制造厂)。3、荧光显微镜LEICA(德国)。4、温控高速离心机D37520Osterode德国。5、电光分析天平TG328A(上海天平仪器厂)。6、电热恒温水温箱HH.W21.Cu600(上海医疗仪器七厂)。7、超低温(80℃)冰箱(海尔公司)。8、电子秤(瑞士Mm7LER公司)。9、PHILIPSCM120透射电镜(德国)。10、超薄切片机LEICA,型号RM2235(德国)。11、切片漂烘温控仪OpB1中国。12、AU400全自动生化分析仪日本Olymmpus公司。材料与方法ω3脂肪酸预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤保护机制的研究413、移液器Gilson公司,10μl,20μl,10μl,1ml规格。14、脱水机LEICA,型号TP1020(德国)。15、包埋机BMJIII(常州中威电子仪器厂)。二、实验对象健康、雄性SpragueDawleySD大鼠60只,体重200250克,由苏州大学实验动物中心提供。许可证SCXK苏20072013。三、实验设计(一)动物模型的建立参照Kolhi13法建立大鼠肝脏局部缺血再灌注损伤模型,用无创小血管夹阻断通往中肝叶及左肝叶血流、肝管蒂,造成70肝脏缺血,但不阻断右肝叶血流,60分钟后去除血管夹复流,关腹。(见下图)。假手术组同上方法,麻醉、开腹后仅游离肝门血管、胆管蒂,不做任何处理后关腹。(二)分组随机分为三组将60只大鼠随机分为假手术组(shamoperation、肝缺血再灌注损伤模型组HIRI组及肝脏缺血再灌注前ω3脂肪酸预处理组(ω组),每组20只。1、假手术(sham,S)组术中只牵拉分离肝十二指肠韧带,不阻断肝脏血流,分别于1小时、6小时每个时间点随机抽取10只后取材同时断颈处死大鼠。2、HIRI组肝脏缺血前10分钟经下腔静脉注入生理盐水4ml/kg,用无创小血管夹阻断通往中肝叶及左肝叶血流、肝管蒂,造成70肝脏缺血,缺血60分钟,恢ω3脂肪酸预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤保护机制的研究材料与方法5复血流后,分别于1小时、6小时每个时间点随机抽取10只后取材同时断颈处死大鼠。3、ω组肝脏缺血前10分钟经下腔静脉注入生理盐水2ml/kgω3PUFAs2ml/kg,其余操作同HIRI组。四、实验方法1、标本的提取所有大鼠实验前均禁食12小时,自由饮水,称重,腹腔内注射3戊巴比妥钠30mg/kg,起效后迅速固定,常规备皮、消毒、铺单后上腹部正中切口进腹,显露肝脏,分离肝十二指肠韧带,假手术组术中只牵拉分离肝十二指肠韧带,不阻断肝脏血流,HIRI组在肝脏缺血前10分钟经下腔静脉注入生理盐水,4ml/kg,用无损伤血管夹阻断通往大鼠肝左、中叶的血管、胆管蒂,造成肝实质70缺血。60分钟后去除血管夹复流,ω组肝脏缺血前10分钟经下腔静脉注入生理盐水2ml/kgω3PUFAs2ml/kg,其余操作同HIRI。恢复血流后,分别于1小时、6小时每个时间点随机抽取10只大鼠采下腔静脉血,分装于2只抗凝管中,在4ºC低温离心10000rpm,离心15分钟后一管取上清液测血清ALT、AST的活性,另一管血清分装于EP管中,放置于80ºC冰箱中冷藏,用以待测血清MDA、SOD含量,再取部分肝左叶组织同时断颈处死大鼠,用10福尔马林固定,常规石蜡包埋,切片,苏木精伊红(HE)染色,用于常规病理和免疫组化检查。2、血清ALT、AST的活性测定采用OlymmpusAU400全自动生化分析仪测定。3、TBA法血清MDA含量1原理丙二醛是一种生物体脂质氧化的天然产物,在较高的温度及酸性环境中可与硫代巴比妥酸(thiobarbituricacid,TBA)反应,形成红色MDATBA加合物,此加合物在535nm处有最大吸收峰,根据此通过比色法进行检测。2试剂盒的准备工作A、TBA储存液的配制称取适量TBA,用TBA配制液配制成浓度为0.37的TBA储存液B、MDA检测工作液的配制根据待测定的样品数(含对照),参考下表在临检测前新鲜配制适量的MDA检测工作液
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脂肪酸 预处理 对于 大鼠 肝脏 缺血 灌注 损伤 保护 维护 机制 研究 钻研
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vyyolyg827上传于2014-03-19

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