藏红花素对骨髓造血干祖细胞集落形成的影响藏红花素对骨髓造血干祖细胞集落形成的影响

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摘要目的本实验探讨藏红花素对骨髓造血干/祖细胞体外集落形成的影响。方法提取骨髓单个核细胞进行集落培养,分为空白对照组及藏红花素组,藏红花素浓度分别为0.25MG/ML、0.59/ML、LMG/ML、2MG/ML,培养14天后在倒置显微镜下进行总造血集落、红系造血集落计数。结果1藏红花素浓度O.25.1MG/ML时随藏红花素浓度增加总造血集落计数增加,总造血集落计数与藏红花素浓度成正相关,藏红花素浓度为LMG/ML时增加最显著;藏红花素浓度增加至2MG/ML时总集落计数减少;增加至4MG/ML时不形成集落。2藏红花素浓度在0.25.1MG/ML时以粒一巨噬细胞集落CFUGM、混合集落CFU.GEMM等非红系集落形成为主。3藏红花素浓度在12MG/ML时,随浓度增加总造血集落形成显著下降而红系集落形成增加。结论1在0.25.1MG/ML,藏红花素可以显著增加总集落及红系集落的形成,集落百分比以非红系为主;2在1.2MG/ML,藏红花素则降低总集落形成,促进红系集落形成;3适宜浓度的藏红花素可提高骨髓造血干/祖细胞集落形成,提示藏红花素能提高骨髓造血能力。硕士研究生丁雯雯儿科学指导教师孙立荣教授关键词藏红花素;造血干/祖细胞;集落培养ABSTRACTOBJECTIVETODETECTTHEAFFECTOFCROCINONTHECOLONYFORMINGABILITYOFBONEMARROWHEMATOPOIETICPROGENITORCELLS.METHODSWEUSEDAMETHYLCELLULOSEBASEDCOLONYFORMINGASSAYTOEXAMINETHECOLONYFORMINGABILITYOFHUMANHEMATOPOIETICPROGENITORCELLS.THEFINALCONCENTRATIONSOFCROCINWAS0.25MG/ML,O.5MG/ML,LMG/ML,2MG/M1.COLONYFORMINGUNITSCFUWERECOUNTEDAFTER14DAYS。RESULTS1OURRESULTSSHOWEDTHATCFUSINCREASEDWHENCROCINCONCENTRATIONELEVATEDFROMOLMG/ML,ANDCELLSTREATEDWITHLMG/MLCROCINHADSIGNIFICANTINCREASEOFCFUS.OTHERWISEWHENCROCINCONCENTRATIONELEVATEDTO2MG/ML,CFUSDECREASED;TO4MG/MLTHEREWERENONECFUSFORMED.2CFUGMANDCFUGEMMWEREMORETHANBFUSWITHCROCINCONCENTRATIONIN0.25一LMG/M1.3CFUSDECREASEDSIGNIFICANTLYWHENCROCINCONCENTRATIONELEVATEDTO2MG/ML;OTHERWISEBFUSINCREASED.CONCLUSION1THEPRECLINICALSTUDYDEMONSTRATEDTHENEWAGENTCROCINCOULDINCREASECFUSOFHUMANHEMATOPOIETICPROGENITORCELLSWITHCROCINCONCENTRATIONINO.25一LMEDML;CFU.GMANDCFUGEMMWEREMORETHANBFUS.2WHENCROCINCONCENTRATIONELEVATEDTO2MG/ML,CFUSDECREASED,OTHERWISEBFUSINCREASED.3THENEWAGENTCROCINCOULDELEVATETHECOLONYFORMINGABILITYOFHUMANHEMATOPOIETICPROGENITORCELLS、析TLLAPPROPRIATECONCENTRATIONSO.25LMG/M1.ITREFLECTEDTHATCROCINMAYIMPROVEHEMATOPOIESIS.POSTGRADUATESTUDENTDINGWENWENPEDIATRICSDIRECTEDBYPROF.SUNLIRONGKEYWORDSCROCIN;HEMATOPOIETICPROGENITORCELLS;COLONYFORMINGUNIT目录引言1第L章材料与方法2第2章结果42.1藏红花素对造血干/祖细胞总集落形成的影响一42.2藏红花素对红系集落形成的影响52.3藏红花素对造血干/祖细胞总集落与红系集落形成的影响比较一5第3章讨论6结论8参考文献9综述10综述参考文献16附录21学位论文独创性声明、学位论文知识产权权属声明22攻读学位期间的研究成果23致谢24青岛大学硕士学位论文引言过去二十年中,人们研究发现大量植物来源的天然化合物具有抗癌作用,中草药亦被越来越多地用于肿瘤患者的治疗中。藏红花是鸢尾科植物家族,自古以来就被民间医学广泛应用ILJ,其花柱头含有藏红花素、花青素、胡萝卜素和番茄红素等,是已知的具有药理活性的成分。藏红花制剂包括藏红花提取液、藏红花素、藏红花酸、藏红花苦素、藏红花醛等。藏红花提取液可对多种肿瘤产生抑制作用,包括白血病、骨肉瘤、纤维肉瘤、卵巢癌【2J。藏红花素,呈桔黄色,水溶性好,稳定性强,作为藏红花提取液中的主要成分被提纯和研究。而近年来研究发现藏红花具有很强的细胞保护作用,其主要成分之一藏红花素具有很强的清除自由基的能力【3J,推测其多种药理作用可能与此相关,包括改善酒精引起的小鼠学习能力下降、降血脂、抗动脉粥样硬化、抗炎、抗神经元老化等14,工6|。本实验组对藏红花素进行了较为深入的研究,其对多种肿瘤细胞,包括急性白血病细胞HL60、淋巴瘤细胞,产生抑制作用。藏红花素的细胞保护作用体现在对脑、心肌、肝脏、视网膜等器官组织上,研究者71还发现藏红花素可小幅度提高DALTON’S淋巴瘤移植小鼠的外周血中性粒细胞计数。其机制尚未阐明,可能与藏红花素的抗氧化应激作用有关。众所周知,目前的化疗药物对造血干/祖细胞可产生强烈的抑制作用,而一些中药制剂则能增强骨髓的造血功能。藏红花素作为一种中药制剂,其细胞保护作用能否体现在造血干/祖细胞上,国内外尚无相关实验研究。藏红花素是否能既杀灭白血病细胞,又不损伤甚至保护造血干/祖细胞,是其有别于其他抗白血病药物的关键。本实验通过体外骨髓造血干/祖细胞混合集落培养,发现藏红花素能增强造血干/祖细胞集落形成,提高骨髓的造血能力,这可能解释藏红花素提高外周血中性粒细胞计数,并为藏红花素应用于肿瘤治疗提供理论基础。材料与方法第1章材料和方法1.1实验材料藏红花素购自SIGMA公司甲基纤维素购自SIGMA公司胎牛血清购自HYCLONE公司ISCOVE’SMODIFLEDDULBECCO’SMEDIUMIMDM购自HYCLONE公司HUMANSTEMCELLFACTORSCF购自PEPROTECH公司HUMANINTERLEUKINIL.3购自PEPROTECH公司GM.CSF、G.CSF、EPO购自PEPROTECH公司2.巯基乙醇购自吉诺生物医药技术有限公司马血清购自广州蕊特生物科技有限公司牛血清白蛋白V购自SIGMA公司FICOLLPAGUE1.077购自天津灏洋生物制品科技有限公司1.2藏红花素溶液的配制无菌条件下将1000MG藏红花素溶于20MLIMDM中,并加62.5MGEDTACRGCIN的稳定剂配成50M咖150N珊01几储存液,4℃贮存。临用时IMDM稀释为适当浓度。1.3骨髓单个核细胞心C提取骨髓标本来自本院血液儿科急性淋巴细胞白血病患儿6例。入组标准化疗后骨髓细胞形态学完全缓解、外周血中性粒细胞计数L5109/ML。取胸骨骨髓0.5ML,按下述操作提取单个核细胞1.EDTA抗凝的骨髓按L2的比例与细胞缓冲液含2%FBS的IMDM,下同混匀;2.在另外的离心管中加入分离液FICOLL.PAGUE,‘比重1.077,将等体积的骨髓细胞悬液沿管壁缓慢加至分离液面上,尽量保持界面清楚,20C,2000转/分离心12RAIN;3.取分离液和最上层IMDM液间的白色云雾层狭窄带750TAL,加入45ML细胞缓冲液中,1500转/分离心10MIN,洗涤细胞2次,即得到单个核细胞;4.1MLIMDM培养基与单个核细胞制成细胞悬液,计数细胞浓度,调节浓度至2105/ML。1.4集落培养甲基纤维素半固体培养基含2.巯基乙醇1.4510一MOL/ML,马血清30%,BSAI%,EP01U/ML,SCF50NG/ML,IL.350NG/ML,GMCSF20NG/ML,GCSF20NG/ML,甲基纤维素0.9%,青.链霉素100U/ML。将骨髓单个核细胞培养于24孔培养板中,分为空白对照组及藏红花素组每组3个复孔,藏红花素浓度分别为0.25MG/ML、0.5MG/ML、LMG/ML、2MG/ML、4MG/ML、8MG/ML,IMDM补齐每孔至0.5ML,调整每孔细胞浓度1104/ML,在37℃、5%C02、饱和湿度条件下培养14天后进行集落计数,光学显2青岛大学硕士学位论文微镜下计数红系细胞集落及总集落形成数。取3个复孔平均数为该组集落数。藏红花素浓度为4MG/ML、8MG/ML时无集落形成,故后续实验删除该2组。1.5统计分析采用随机区组设计的方差分析对实验数据进行统计分析,多重比较采用最小显著差数法LSD法,以P0.05表示差异有统计学意义。结果第2章结果2.1藏红花素对造血千/祖细胞总集落形成的影响以不同浓度藏红花素培养骨髓单个核细胞形成的总集落计数见表1。藏红花素影响骨髓造血干/祖细胞的集落形成F37.3,P0.05,在藏红花素浓度OLMG/ML时,总集落形成数量与藏红花素浓度成正相关R0.834,P0.01,见图L。藏红花素浓度为0.25MG/ML较空白对照组无差异,0.5MG/ML时较空白对照组显著增加,至LMG/ML时增加最显著显著高于其它各组,P0.05。藏红花素2MG/ML时集落形成数量下降。表1.不同藏红花素浓度培养14天集落计数注加入不同浓度的藏红花素后各组集落形成数量均数间有差别,F37.3,P0.05,红系集落数各组均数差别有意义F2.87,P0.05;不同患者的骨髓标本间差异无显著性,P0.05;幸藏红花素浓度为LMG/ML集落形成较其它各组差异有显著性,P0.05;料藏红花素浓度为O.5MG/ML集落形成较对照组、2MG/ML组差异有显著性,P0.05;料木藏红花素浓度为0.25MG/ML集落形成较对照组无显著差异,P0.05;其余各组间差异无显著性。O藏红花素浓度为2MG/ML与1M∥ML之间红系集落数量差异有显著性,P0.05,与其它组问差异均具有显著性;OO藏红花素浓度为1M∥ML与其它组间差异具有显著性;其它组间差异无显著性。图1藏红花素对造血TG.IT细胞总集落形成影响趋势4青岛大学硕士学位论文2.2藏红花素对红系集落形成的影响藏红花素影响红系集落形成数目,各组差异有显著性F2.87,PO.05,以藏红花素浓度LMG/ML、2MG/ML对红系集落形成的增加最明显,较其余各组均显著增多PO.05,两组之间差异有显著性PO.05。在0.25.2MG/ML之间,红系集落数量增加与藏红花素浓度呈正相关相关系数RO.69,PO.01。红系集落占总集落百分比见图3在A.D组中分别为17.6%、18.6%、17.1%、15.1%、33.3%,E组明显高于其他组。非红系集落粒.巨噬细胞集落CFU.GM、混合集落CFU.GEMM在A.D组占到80%以上,其中在D其比例近85%。图2藏红花素对红系集落形成影响趋势图2.3藏红花素对造血干/祖细胞总集落与红系集落形成的影响比较如图3所示,藏红花素浓度0.1MG/ML时总集落形成及红系集落形成均随浓度增加而增加,至2MG/ML时总集落计数显著减少,呈负相关,红系集落计数显著增加,呈正相关。红系集落所占百分比在藏红花素浓度为LMG/ML与O.5M∥ML相比,总集落增加54%,红系集落仅增加36%;2MG/ML与LMG/ML比较,红系集落计数显著增加,总集落计数显著下降PO.05,从而使红系集落百分比明显高于其它组。图2红系集落形成占总集落形成百分比讨论第3章讨论中草药的抗肿瘤作用近年来越来越受到重视,其兼备细胞保护、免疫调节等作用,似乎较传统抗肿瘤药物更适合于恶性肿瘤的治疗。藏红花素是中药藏红花的重要组成,是一种新的抗肿瘤药物,许多实验证实藏红花素可增加细胞凋亡,抑制肿瘤细胞的增长。体外实验研究证实藏红花素能抑制急性白血病细胞HL60的增殖。在体内试验,HAMIDABAKSHI等【7】证实藏红花素能抑制DALTON’S淋巴瘤移植小鼠的肿瘤生长。这奠定了藏红花素在血液系统肿瘤中的应用价值。同时HAMID发现藏红花素在抗肿瘤生长的同时,并不引起小鼠血红蛋白及中性粒细胞含量下降,且中性粒细胞百分数及绝对计数较正常对照组有小幅度升高,因此我们考虑藏红花素对正常造血不产生抑制作用。而造血干/祖细胞是造血的起始,藏红花素能否对造血干/祖细胞产生保护作用,目前国内外尚无相关研究。而本实验通过藏红花素对体外造血干/祖细胞集落形成的影响,证明适宜浓度的藏红花素O.25.1MG/M1可显著增强体外造血干/祖细胞集落形成,这说明藏红花素对造血干/祖细胞具有保护作用,且可以在造血千/祖细胞水平干预外周血细胞成分。1藏红花素0.25。LMG/M1可显著增强体外造血干/祖细胞总集落形成,但是浓度增至2MG/ML时总集落形成显著下降,4MG/ML时没有集落形成。本实验组既往实验也显示藏红花素在适宜浓度范围内显示细胞保护作用,高浓度则引起细胞坏死,显示高浓度的藏红花素具有细胞毒性作用。2藏红花素对红系集落形成的影响主要体现在2MG/ML浓度时总造血集落形成显著下降而红系集落形成显著增加,提示在高浓度藏红花素作用下,红系造血干/祖细胞较非红系更能耐受藏红花素的毒性作用。3藏红花素对红系集落的形成及非红系集落的形成具有浓度差异性。浓度在O.1MG/ML时粒.巨噬细胞集落CFUGM、混合集落CFUGEMM占到80%以上,在LMG/ML时达到85%,且非红系集落的增加程度较红系集落高54%36%,提示藏红花素在此浓度范围内以增加非红系集落形成为主,这可以解释藏红花素处理的DALTONS淋巴瘤移植小鼠外周血中性粒细胞升高的现象。藏红花素增加造血干/祖细胞集落形成的机制尚需进一步研究。既往研究显示藏红花素为一种细胞保护剂,其细胞保护作用体现在延长缺氧小鼠的存活时间蝎J,保护缺氧心肌细胞【9】,抑制CCL4引起的肝损伤【10】、减轻缺血再灌注引起的多脏器损伤,抗动脉粥样硬化、神经细胞保护作用等。其细胞保护作用涉及多种机制,其中抗氧化反应被认为是最重要的机制。藏红花素在细胞水平、分子水平、基因水平均发挥抗氧化作用。①藏红花提取物能显著抑制MDBH及巴豆油引起的脂质过氧化IL,LLJ;可以显著刺激Y.谷胱甘肽MRNA表达,通过增加谷胱甘肽合成来抑制神经鞘磷脂酶6
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