产品的无菌检测实操简介提纲

无菌检查实操简介（药典（2005版 ）无菌检查的操作简介）,一、无菌检查的基本条件二、常用培养基的制备三、常见样本的处理四、结果判定五、无菌操作流程六、其它说明七、审核 提示,一、无菌检查的基本条件,人,机,料,法,环,人：经过培训、授权,建立无菌概念、微生物专业知识，并经过无菌技术培训。熟知对相关产品的无菌检查要求和相关作业指导书 熟练填写建立的记录表单.,谁能授权？,机：主要设备,水浴箱,高压蒸汽灭菌器,天平,培养箱,100级洁净工作区,恒温水浴箱,保持营养琼脂培养基处于液体状态（约45），需要大量制作培养皿时使用。,室温时,热溶时,营养琼脂,培养箱 （生物培养箱）,普通：仅有升温控制。后者：设计有升温和降温的双向控制装置。二台温度(2328、3035 )南方高温天气（35度）时霉菌培养的控制？箱内的温度均衡性？,超净工作台 生物安全柜,作用：提供100级单向流空气区。作用效果：防止被操作物（检品）被污染。,作用：提供隔离系统（多气流方向）。作用：防止检品、操作人、环境被污染。,超净工作台整体设计,普通层流超净工作台内的气流最终直接对着操作者而排 向周围环境。因此，此类净化工作台不得用于处理感染性物品、有毒物品或敏感物品等。它们只适用一般性的无菌操作活动，如无菌物品的装配、常规物品的微生物检查、培养基的制备等。,生物安全柜的整体设计,生物安全柜的用途,专用于常规性微生物菌种的处理，如微生物的鉴别、生物指示剂的制备与培养、阳性对照或培养基灵敏度检查用标准菌株的制备、保藏和使用等。实验室如果配备一台净化工作台最好是生物安全柜。,无菌操作中使用的灭菌器,以火焰为中心点可形成近10cm直径的“无菌区”。酒精灯只可在单气流的环境中使用 可在单向气流或多向气流的环境中使用,金属用具、每次重复使用前的快速处理,红外线热能灭菌器.doc,电子火焰灭菌器.doc,物品：确认适宜,培养基 阳性对照菌,检品 其它酒精灯、三角烧瓶，接种环、无菌棉签、镊子，试管架，大试管若干等。,法：文件和记录,抽样的规定（药典2005版）,注：若每个容器中的装量不足接种两种培养基，那么表中的检验数量加倍.,抽样的规定（药典2005版）,1 每种培养基各接种10支供试品,抽样的规定（药典2005版）,每种培养基各接种10支供试品。抗生素粉针剂（5g）及抗生素原料（5g）的最少检验数量为6瓶或（支），桶装固体原料的最少检验数量为4个包装。如果医用器械体积过大，培养基用量可在2000ml以上，将其完全浸没。,无菌检验原始记录.doc,应记录实现可追溯的基本信息：品名、规格、型号生产批号抽样数量灭菌批号培养基的名称培养基的配制批号培养基的接种数量,培养温度检查方法检查日期培养过程的观察记录阳性对照菌的名称设备编号检查结果检查人,操作环境,在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行. 其全过程应严格 遵守无菌操作, 防止微生物污染。,注意鞋套与裤脚的连接,环境控制,单向流空气区、工作台面及环境（10000级）必须进行洁净度验证。验证依据：医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法日常：对试验环境进行监控维护过程中使用不脱落 颗粒物的专业擦拭毛巾、地拖。不同洁净区，分别专用。超净工作台清洁标准操作规程.doc100级洁净区的管理要求.doc,专业地拖,环境控制,在洁净区内，如条件许可，尽量使层流净化工作台始终处于运行状态。一旦停止运行而重新启动后，要对工作区进行彻底性消毒并且在使用前至少要预运行5min。此外，在每次使用前和使用后，均应对工作台面采取清洁和消毒措施。常用的消毒剂：乙醇、碘伏、新洁尔灭。 注意有效性（抗菌谱、有效浓度、干扰因素）常用消毒剂.doc工作区表面灭菌：紫外线照射。（能被普通的纸、玻璃阻挡）,二、常用培养基的制备制备的方式有以下三种：,目前最常见的方式,常用培养基的形态：二种,固体（营养琼脂）,斜面,培养皿（平板）,斜面：将培养基试管倾斜放置，凝固后即成。,培养基的种类,依据用途划分 1、无菌检查和测定菌数用培养基 2、增菌、运送用培养基 3、分离培养用培养基 4、鉴别用培养基 5、抗生素检定用培养基 6、其它类培养基（生芽孢琼脂斜面培养基）,常用的无菌检查脱水培养基,常用培养基的配方,A1.硫乙醇酸盐流体培养基,硫乙醇酸盐流体培养基,培养厌氧菌的原理：在液体中加入了0.05%0.07%的琼脂，增加了培养基的粘度，降低培养基中氧含量，使培养基在一定的时间内保持厌氧的条件，利于厌氧菌的生长。,红色氧化层：需氧菌生长层,常用培养基的配方 A2.改良马丁培养基,常用培养基的配方,A3. 选择性培养基 在上A1、A2 二种培养基增加：中和剂 ：对氨基苯甲酸表面活性剂 ：聚山梨脂80、 -内酰胺酶,A4 . 营养肉汤培养基,常用培养基的配方,其它脱水培养基,培养基制备流程图,培养基制备流程图,说明：按以上培养基的配方称取各组分后，充分溶解（必要时加热），分装试管（或其它适合的容器）后，包扎封口（应可通气）、高压蒸汽灭菌。 备用。 PH的调节方法：比色（胶体溶液）或生物型 普通PH计：适用离子溶液 培养皿（俗称平板）：需要在灭菌后无菌分装；,培养皿制备：无菌分装,皿内琼脂凝固后，不要长时间放置，应倒置存放、培养，以避免菌落蔓延生长。,培养基的配制的质量控制,灭菌：115灭菌30分钟。,培养基的装量：约为试管或容器高度的2/5。,制备中,灭菌指示剂,灭菌指示剂（生物型+化学型）,培养基的配制的质量控制,每批抽样：不少于5支。细菌培养基经3035培养14天, 应无菌生长。真菌培养基经2328培养14天，应无菌生长。 观察灭菌指示剂（呈阴性色）通过培养基灵敏度检查法。,灭菌后,培养基灵敏度检查法 目的：证明配置的培养基是适合相应的微生物生长。证明检查结果的准确、有效。可以与无菌检查同时进行。,试验用菌株的说明,* 非灵敏度检查用菌。,注意：培养时间要求不同,菌株的来源：,菌株的来源：,菌种的质量控制,保藏原理,适当的方式保存。,菌株的质量控制,传代不能超过5代。菌种传代.doc,甘油冷冻管G2,斜面：菌种作为工作用菌种G3/ W3,G0,G1,G2,甘油冷冻管G4,纯度、理化签定后挑取纯菌落,甘油冷冻管G3,斜面：菌种作为工作用菌种G4/ W4,G4,G3,G5,斜面：菌种作为工作用菌种G5/ W5,甘油冷冻管G5,提示：,培养基的灵敏度检查法是一项对微生物专业要求较高的操作技术。目前多数企业都不具备作该试验的技术人员，目前比较普通做法是购买有资质的脱水培养基（如中检所），同时要求制造商提供有关报告。自己不做该检查。如果培养基在有效期内没有用完，在继续使用前应再次验证其培养灵敏度。培养基灵敏度检查法.doc,培养基的配制的质量控制,225、避光。有效期：非密闭3周，密闭1年。硫乙醇酸盐流体培养基使用培养前，培养基的氧化层（粉色层）不超过液面高度1/5。否则,须经水浴煮沸加热（不超过20分钟）,迅速冷却，只限加热一次。培养结束后培养基的氧化层（粉色层），不超过液面高度的1/2。,保存,使用后,成品培养基,规模化生产细菌培养基节省时间和制备成本没有灰尘、粉尘对环境的影响良好的批量一致性和可追溯性,保存：225、避光。有效期：非密闭3周，密闭1年。,液体培养基,优势,三、常见样本的处理,三、常见样本的处理,方法验证试验目的：证明所采用的方法适合于该产品的无菌检查（测定供试品是否具有抑细菌和抑真菌作用）。试验的时机：1）建立产品的无菌检查方法时。 2）产品的组分或原检验条件发生改变时，检查方法应重新验证。验证范围： 对每一试验菌应逐一进行验证。方法： 检品+灵敏度检测试验菌 + 培养基 =试验菌生长良好。无菌检查方法验证试验.docx,无菌检查和验证示例,产品：纳米银离子敷料，规格6cm7cm，包装规格：1片/袋验证试验：培养基15ml/支，剪取1片样品（1cm3cm），直接接种硫乙醇培养基4支、改良马丁2支，再加入6株阳性菌。表：样品对6株阳性菌的试验结果,结果分析：该检验量对26003（金黄色葡萄球菌）有抑制作用。解决方法：增加培养基用量。 表：样品对26003的再次验证,再验证结果分析： 纳米银离子敷料，该检测量在该条件下无抑菌作用或者其抑菌作用可以忽略不计。验证结论： 纳米银离子敷料的无菌检查方法是取样品10袋、培养基40ml/支，每支培养基接种量1cm3cm，培养14天。,数量依据表3确定,三、常见样本的处理,1、液体样品：薄膜过滤法 药典推荐使用全封闭的系统进行检查。目前已商品化的产品： 集菌仪 实物展示、培养器（滤筒）结构说明 滤膜孔径： 0.45m 滤膜直径： 50mm,集菌仪工作原理图示,三、常见样本的处理,两种培养基的接种支/瓶数之比为2：1无菌检查的阳性阴性对照设置.docx,改良马丁培养基1支（100ml/支）,硫乙醇酸盐培养基2支（100ml/支）,薄膜过滤法的接种数量,其中1支在培养14天后，加入阳性对照菌,阴性对照：使用相应的溶剂、稀释液和冲洗液同法操作。,其它细菌过滤器,接真空泵增加过滤速度,微生物过滤膜,常用孔径：除菌-0.22m 集菌-0.45m,不同溶液可选择不同的截流效果膜,阳性对照菌的使用,* 使用的菌液浓度100cfu/ml。,对照菌液的制备同培养基灵敏度检查的菌液制备,标准菌株G3/W3,对照菌液的制备 使用的菌液浓度：10100cfu/ml,菌落计数,2）、在营养琼脂培养皿上计算菌落数。每个菌堆积点算一个菌。,1）、菌液稀释后可直接与细菌标准浓度比浊管比较。,三、常见样本的处理,2、固体样品： 直接接种法,固体样品检查应注意的事项,样品的要求完整：最小包装完好、没有任何污染、破损。有效：名称、地址、批号、规格型号。,*样品检验前的处理：信息、脱去外包装、标记编号。用适宜的消毒液对其外表面进行消毒、紫外线照射。* 培养基硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基接种支/瓶数之比为2：1。供试品体积不得大于培养基体积的 10%。硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于 15ml。改良马丁培养基每管装量不少于10ml。培养基的用量和高度同方法验证试验。,三、常见样本的处理,3、表面有活性剂、中和剂或灭活剂、抗菌作用的供试品:薄膜过滤法,检查前应证明检查方法的有效性及对微生物的生长无影响。抑细菌和抑真菌试验.docx 供试品具有抑菌作用或含防腐剂时，须用冲洗液冲洗滤膜，冲洗次数一般不少于三次。每张滤膜每次冲洗量一般为100ml，总冲洗量不得超过1000ml，以避免滤膜上的微生物受损伤。所用的冲洗量、冲洗方法同方法验证试验,4、其它产品复溶、清洗：将复溶液、清洗液按薄膜过滤法进行。,2005版药典明确检验方法的IVDD,培养及观察,逐日观察并记录是否有菌生长,23 28 ：改良马丁培养基1份,30 35 ：硫乙醇酸盐培养基2份、,培养14天后,四、结果判定,判定方法逐日观看任何一管培养基是否保持透明（阴性）、或出现浑浊、絮状物（阳性）。对照菌液的生长（细菌在24小时内应有菌生长，真菌应在培养2472小时有菌生长。）,培养及观察,培养 14天后，不能从外观上判断有无菌生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中及营养琼脂斜面和改良马丁琼脂斜面培养基上，细菌培养 2天、真菌培养 3天，观察接种的同种新鲜培养基及营养琼脂和改良马丁琼脂斜面培养基上是否有菌生长；或取培养液（物）涂片，染色，镜检，判断是否有菌，必要时作菌种鉴定。,细菌转种的器具、分离,结果判定,当符合下列至少一个条件时方可判试验结果无效： 无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求。 回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素。 阴性对照管有菌生长。(4) 供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。 试验若经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法检查，若无菌生长，判供试品符合规定；若有菌生长，判供试品不符合规定。,五、无菌检查操作流程,无菌操作流程,一盏酒精灯，以火焰为中心点可形成近10cm直径的“无菌区”。,六、其它说明,六、其它说明,检样过程中应在工作台上打开一块空白平板计数琼脂，其暴露时间应与检样时间相当，以了解检样在检验操作过程中有无受到来自空气的污染。 (要求：每平皿1CFU)无菌检查的培养时间：7天？药典2000版2005版药典是14天。产品检测工作区与阳性对照菌接种区是否应分开？（2005版药典未明确？各检测中心是分设的）,（2010版药典 ？ 2010.7.1生效）表1: 出厂制品不同规格及原液和半成品最少抽验数量,（2010版药典？）表2：上市制品监督抽验数量,（2010版 药典？）表3 :不同规格制品的最少接种量,2010版药典的变化：培养基的灭菌检查数量： =不少于10支。培养基的灭菌条件： 115灭菌30分钟=验证合格的灭菌程序灭菌。直接接种的数量：？未明确,七、审核提示,文件：1）是否编制了作业文件和相适应的记录？有否包括检验方法的验证？2）检验范围是否包括了需-厌氧细菌和霉菌、真菌（有的企业自己做无菌检查，但不知道要检查二类菌）3）使用的培养基是否适合、是否有灵敏度检查记录或报告？（有的企业