流式细胞技术

流式细胞术及其应用,概念,流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。流式细胞仪（Flow Cytometer)集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。,流式细胞仪特点,单细胞悬液或生物颗粒,分析速度高,多参数,精度高,当代最先进的细胞定量分析技术,流式细胞仪检测范围,细胞大小细胞粒度细胞表面面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量,细胞结构,特异性抗原（细胞表面/胞浆/核）细胞内细胞因子细胞活性酶活性激素结合位点细胞受体,细胞功能,临床研究,淋巴细胞亚群测定、血小板分析、网织红细胞分析、白血病和淋巴瘤免疫分型、HLA-B27分析、PNH诊断、人类同种异体器官移植中应用、细胞因子测定、AIDS诊断与治疗和疗效评价、flow-FISH法测定端粒长度,基础研究,淋巴细胞功能、树突状细胞(DC)研究、造血干细胞研究、细胞周期分析、细胞凋亡分析、凋亡相关蛋白分析、细胞功能研究、多药耐药基因研究(MDR)、肿瘤相关基因表达研究、RNA测定、DNA测定、总蛋白测定、癌基因和抑癌基因表达产物测定、血管内皮细胞研究,样品培养细胞新鲜组织石蜡包埋,单细胞 悬液,标记荧光抗体,检测,表型测定,细胞分选,流式细胞术操作流程,统计学 分析,继续培养,流式细胞术的应用,细 胞 周 期 分 析,,样品制备,1000rpm 5分钟收集2X106个细胞,PBS漂洗 两次,70%酒精4度固定过夜,收集固定的细胞,PBS漂洗,0.5 PBS悬浮细胞,2.5l 10g/l RNase A,37度消化1小时,过300目细胞筛,50l 0.1mg/ml PI（含1%Triton)，,1000rpm 5分钟 离心,两次,混匀，室温静止5分钟,上机,建立获取模式，获取数据 （PI单染分析细胞周期，同时看凋亡）,去甲斑蟊素对肝癌细胞周期的作用,数据分析,圈门去除细胞碎片，分析细胞凋亡,圈门去除粘连体，分析细胞周期,细胞凋亡分析,H2O2诱导成神经瘤细胞的凋亡照片，蓝色为细胞核，绿色是凋亡细胞。 A.K. Stout and J.T. Greenamyre, Emory University,细胞凋亡,细胞凋亡首先出现的是染色质的浓缩, 导致致密的、分离的、边界清晰的半月形的染色质颗粒集中于核膜边缘;随后染色质浓缩过程伴随有核膜及细胞膜的内陷, 接着核碎裂成分离的片段, 胞浆浓缩, 细胞支架断裂,这些片段被细胞膜包裹; 跟着出现的是凋亡细胞断裂成若干个有完整包膜包裹的凋亡小体(apoptosis body) , 小体的大小及其内容差异甚大, 大部分含有若干核片段, 少数可能没有核片段。,细胞核染色体局部凝聚,细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻染色体局部凝聚,引自 /experiment/cellular4/80861.shtml,缺乏IL3诱导的细胞凋亡,Michael G. Ormerod Journal of Immunological Methods 265 (2002) 73 80,Annexin V-PE/7-AAD 双染色法,双阴：活细胞 Annexin V-PE单阳：早期凋亡细胞双阳：晚期凋亡细胞 7-AADd单阳：坏死细胞,检测淋巴细胞引起的细胞毒作用,细胞毒性淋巴细胞（包括细胞毒性T细胞CTL和自然杀伤细胞NKC）能释放包含穿孔素蛋白和颗粒酶的颗粒或通过Fas-Fas连接作用于靶细胞，引起靶细胞内Caspase酶激增，导致细胞死亡包括凋亡。具有重大研究和应用价值。通常测定淋巴细胞介导的细胞毒性作用