白前苷B对肝损伤保护作用及机理研究

白前苷B对肝损伤保护

作用及机理的研究答辩人：梁爽专业：药理学导师：李沛波讲师当前第1页\共有55页\编于星期五\20点学位论文原创性声明

本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。当前第2页\共有55页\编于星期五\20点目录总结

白前苷B对D-GalN/LPS诱导小鼠急性肝损伤保护作用及机制研究

白前苷B对GCDC诱导肝细胞凋亡保护作用及机制研究白前苷B提取分离及检测研究目的、研究内容背景

创新点

展望

当前第3页\共有55页\编于星期五\20点一、背景—肝损伤的研究概况指标影响分类机理模型肝损伤当前第4页\共有55页\编于星期五\20点一、背景—肝损伤概况

肝损伤引发的肝脏疾病已成为常见病、多发病。肝损伤可导致肝纤维化，肝硬化,是肝癌发生的重要始动因素。发病率和死亡率高，极大地威胁着人类的健康。我国现有各类型肝病患者已超过2亿之众，其中乙肝病毒携带者约9300万，每年新增病例超过100万人，治疗费用达1000亿人民币以上。对肝脏疾病的治疗已成为研究热点，但迄今尚无治疗肝病的特效药物，因此需要寻找一种有效预防和治疗肝损伤的药物。当前第5页\共有55页\编于星期五\20点药物性肝损伤感染性肝损伤酒精性肝损伤缺血再灌注肝损伤胆汁淤积性肝损伤急性肝损伤慢性肝损伤免疫性肝损伤化学性肝损伤一、背景—肝损伤的分类发病速度发病原因发病机理当前第6页\共有55页\编于星期五\20点一、背景—肝损伤的机理质膜损害线粒体功能障碍胞内离子浓度改变降解酶被激活自由基损害

免疫性肝损伤化学性肝损伤细胞因子作用NO作用补体系统激活细胞间的协作

免疫变态反应

细胞凋亡

受体介导途径颗粒-排粒途径通过基因调控当前第7页\共有55页\编于星期五\20点一、背景—肝损伤实验模型手术造成肝损伤模型5酒精性肝损伤模型4黄疸性肝损伤模型

3免疫性肝损伤模型

2化学性肝损伤模型

1当前第8页\共有55页\编于星期五\20点CCl4诱导肝损伤

PAPA诱导肝损伤

其它

DMN诱导肝损伤

TTA诱导肝损伤

D-GalN诱导肝损伤

化学性肝损伤模型最早，最广泛的选择性肝毒性物质。与病毒性肝炎所造成的损伤类似常见的致肝癌剂

急性药物肝功能损伤模型

接近人类肝硬化

乙硫氨酸甲基偶氮苯黄曲霉素

当前第9页\共有55页\编于星期五\20点BCG/LPS诱导法

异种血清法

D-GalN/LPS

诱导法

conA诱导法

免疫性肝损伤模型肝炎免疫性肝损伤机制相似常用于肝纤维化模型，以猪血清最为常用

当前第10页\共有55页\编于星期五\20点

此方法诱发的动物肝损伤模型被公认为与临床上急性重症肝炎（急性肝坏死）病情相似。其损伤机制为：D-GalN为特异性肝细胞损伤药物，可促使肥大细胞释放组胺，引发结肠水肿，肠源性内毒素吸收增加。因此，经D-GalN处理后的动物,接受很小剂量的外源性LPS即可以引起以肝脏细胞凋亡为主要特征的急性肝损伤。其损伤过程中产生大量的炎症因子，与湿热黄疸发病机制最相似。

D-GalN/LPS

诱导法

当前第11页\共有55页\编于星期五\20点胆汁酸及其盐诱导黄疸性肝损伤ANIT所致小鼠黄疸性肝损伤

胆管结扎致梗阻性黄疸

ABC黄疸性肝损伤模型当前第12页\共有55页\编于星期五\20点

胆汁在细胞内的堆积是导致黄疸性肝细胞损伤的主要原因之一。GCDC是人体内作用最强的胆汁酸。其作用机理包括：

1.对细胞产生毒性，诱导肝细胞坏死

2.诱导肝细胞凋亡3.氧化应激作用

4.诱导线粒体功能失调胆汁酸及其盐诱导黄疸性肝损伤A当前第13页\共有55页\编于星期五\20点1.잠재고객其它细胞活性及凋亡内皮细胞生化指标氧化指标MDA,SOD,GSH-Px,CAT,LPO

ALT,AST,LDH,血清总胆红素,甘油三脂

透明质酸,ET

MTT，FCM，TUNEL

相关基因，受体及其酶

组织观察

HE染色,Masson三色胶原染色,电子透射电镜检查

Na-K-ATP酶，Ca-ATP酶，Ca

2+一、背景—肝损伤的实验检测指标当前第14页\共有55页\编于星期五\20点一、背景—中药抗肝损伤作用研究概况

中药作为我国的特色药物，因其副作用低，而且在保肝退黄方面独具优势，逐渐受到了大家的关注。对于肝损伤保护的中药研究，主要有抗内毒素治疗及抗自由基、促进肝细胞再生、调节免疫功能、改善微循环和抗细胞凋亡等。

目前已开发出很多疗效确切的活性物质用于肝损伤的治疗。其中包括：甘草—甘草酸、苦参–苦参碱、黄芩—黄芩苷等。当前第15页\共有55页\编于星期五\20点一、背景—田基黄及白前苷B

田基黄民间用于治疗湿热黄疸，临床常用于急、慢性肝炎的治疗，1977版中国药典就已收载了以田基黄为原料制成的田基黄注射液。现代药理学研究证明田基黄对免疫性、感染性、胆汁淤积性肝损伤具有保护作用。

当前第16页\共有55页\编于星期五\20点一、背景—田基黄及白前苷B研究基础本实验室研究表明：（1）田基黄的有效部位为黄酮类化合物，当前第17页\共有55页\编于星期五\20点一、背景—田基黄及白前苷B研究基础（2）白前苷B是黄酮类化合物中含量较高

当前第18页\共有55页\编于星期五\20点一、背景—田基黄及白前苷B研究基础（3）白前苷B提取分离

当前第19页\共有55页\编于星期五\20点一、背景—田基黄及白前苷B研究基础（4）白前苷B对D-GalN、CCl4所致化学性肝损伤和ANIT、BDL所致黄疸性肝损伤具有显著保护作用。

当前第20页\共有55页\编于星期五\20点二、研究目的

本文的研究目的是：以白前苷B为研究对象，利用体内外实验方法，结合田基黄的功用（治疗湿热黄疸），对其进行肝损伤保护作用及机理的研究。当前第21页\共有55页\编于星期五\20点三、研究思路田基黄具有清热利湿解毒之功，用于治疗湿热黄疸（1）黄疸（2）湿热当前第22页\共有55页\编于星期五\20点三、研究思路231白前苷B的提取分离体外实验，选择GCDC诱导肝细胞凋亡模型，阐明白前苷B的退黄机理

动物实验，选择D-GalN/LPS诱导小鼠肝损伤模型，对白前苷B保肝的作用及其机制进行研究。

1当前第23页\共有55页\编于星期五\20点四、白前苷B的提取分离—方法水提液制备白前苷B分离含量测定水提醇沉法聚酰胺吸附60%乙醇洗脱HPLC当前第24页\共有55页\编于星期五\20点四、白前苷B的提取分离—结果图2-1白前苷B对照品HPLC图谱图2-2提取物HPLC图谱名称供试品浓度（mg/ml）峰面积含量样品0.5629623.8098.30%白前苷B含量计算结果当前第25页\共有55页\编于星期五\20点四、白前苷B的提取分离及检测—小结

本实验中主要采用了水提醇沉、聚酰胺柱层析、重结晶，获得一个单体化合物，经过HPLC与对照品比较，其保留时间一致。从紫外光谱图上看，此样品UVI（nm）为257.8；UVII（nm）分别为376.5，与白前苷B对照品一致。因此，故推断该单体化合物为白前苷B，计算其纯度达到98.3%。

当前第26页\共有55页\编于星期五\20点五、白前苷B对GCDC诱导人正常肝细L-02凋亡保护作用及机理研究—方法细胞内钙离子：激光共聚焦显微镜线粒体膜电位：RH123染色氧化相关指标：ROS，GSH细胞活性：MTT，细胞凋亡：HOE33258染色

AnnexinV/pI染色白前苷B抗凋亡作用机制白前苷B对凋亡保护作用白前苷B安全范围检测肝损伤模型的建立MTT法检测细胞活性

GCDC诱导肝细胞凋亡当前第27页\共有55页\编于星期五\20点五、白前苷B对GCDC诱导人正常肝细L-02凋亡保护作用及机理研究—结果1、GCDC对L-02肝细胞活性的影响

注：与空白对照组比较：*p<0.05,**P<0.01。细胞存活率与GCDC呈剂量依赖关系

当前第28页\共有55页\编于星期五\20点五、白前苷B对GCDC诱导人正常肝细L-02凋亡保护作用及机理研究—结果2、Hoechst33258染色注：与空白对照组比较：*p<0.05,**P<0.01。随着GCDC的给药剂量增加，凋亡小体明显增多，凋亡率增加，结果与MTT一致。当前第29页\共有55页\编于星期五\20点五、白前苷B对GCDC诱导人正常肝细L-02凋亡保护作用及机理研究—结果

注：图中以AnnexinV为横轴，PI为纵轴；左上象限为机械性损伤细胞；右上为晚期凋亡细胞或者坏死细胞；左下为阴性正常细胞；右下为早期凋亡细胞。注：与空白对照组比较：*

p<0.05,**P<0.01。3、GCDC对L-02细胞凋亡率的影响

随着GCDC给药剂量增加，细胞凋亡（Q4区）明显增加。

当前第30页\共有55页\编于星期五\20点五、白前苷B对GCDC诱导人正常肝细L-02凋亡保护作用及机理研究—结果4、线粒体膜电位变化

如图所示，随GCDC给药剂量增加，荧光强度逐渐减少，证明线粒体膜电位逐渐下降，细胞凋亡增加。当前第31页\共有55页\编于星期五\20点五、白前苷B对GCDC诱导人正常肝细L-02凋亡保护作用及机理研究—结果

Ca2+被认为与细胞凋亡诱导和抑制的信号转导通路有关。随着GCDC给药量增加，细胞内Ca2+浓度逐渐增加，细胞凋亡增加。注：与空白对照组比较：**P<0.01。5、细胞内钙离子浓度变化当前第32页\共有55页\编于星期五\20点五、白前苷B对GCDC诱导人正常肝细L-02凋亡保护作用及机理研究—结果

6、细胞内ROS变化注：与空白对照组比较：*p<0.05,**P<0.01。ROS产物的增多检测是细胞氧化应激反应的重要指标，随着GCDC给药量的增加，ROS释放量增加。当前第33页\共有55页\编于星期五\20点五、白前苷B对GCDC诱导人正常肝细L-02凋亡保护作用及机理研究—结果7、细胞内GSH变化注：与空白对照组比较：**P<0.01。

随着GCDC的给药量增加，细胞内的GSH有明显的降低。细胞内ROS升高，是造成细胞内GSH降低的原因之一。

当前第34页\共有55页\编于星期五\20点五、白前苷B对GCDC诱导人正常肝细L-02凋亡保护作用及机理研究—小结

本实验根据文献报道及细胞凋亡相关机理，选用线粒体膜电位、钙离子浓度及氧化应激相关指标检测，确定GCDC诱导L-02肝细胞凋亡最佳浓度为100μmol/L。当前第35页\共有55页\编于星期五\20点五、白前苷B对GCDC诱导人正常肝细L-02凋亡保护作用及机理研究—结果

1、白前苷B安全浓度范围

注：本实验中选择白前苷B的最大作用浓度为250μmol/L为含有1%DMSO溶剂所能溶解的最大剂量。当前第36页\共有55页\编于星期五\20点五、白前苷B对GCDC诱导人正常肝细L-02凋亡保护作用及机理研究—结果2、白前苷B对GCDC处理的肝细胞的存活率影响

注：与空白对照组比较：##P<0.01;与GCDC组比较:*P<0.05,**P<0.01。

白前苷B对GCDC诱导的肝细胞存活率降低有保护作用，并且有剂量依赖性。

GCDC100μM当前第37页\共有55页\编于星期五\20点五、白前苷B对GCDC诱导人正常肝细L-02凋亡保护作用及机理研究—结果3、Hoechst33258染色检测对细胞凋亡的保护注：与空白对照组比较：##P<0.01;

与GCDC组比较:*P<0.05,**P<0.01。随着白前苷B的给药剂量增加，凋亡小体明显减少，细胞凋亡率降低，高浓度时与正常相似。说明白前苷B细胞凋亡有保护作用。正常对照GCDC100μM当前第38页\共有55页\编于星期五\20点五、白前苷B对GCDC诱导人正常肝细L-02凋亡保护作用及机理研究—结果

注：与空白对照组比较：##P<0.01;与GCDC组比较:

**P<0.01。4、白前苷B对细胞凋亡率的影响

随着白前苷B给药剂量增加，细胞凋亡（Q4区）明显减少，证明白前苷B对GCDC诱导的早期肝细胞凋亡有明显的保护作用。

注：图中以AnnexinV为横轴，PI为纵轴；左上象限为机械性损伤细胞；右上为晚期凋亡细胞或者坏死细胞；左下为阴性正常细胞；右下为早期凋亡细胞。GCDC100μM当前第39页\共有55页\编于星期五\20点五、白前苷B对GCDC诱导人正常肝细L-02凋亡保护作用及机理研究—结果

5、细胞线粒体膜电位白前苷B对肝细胞凋亡的保护作用与线粒体途径相关。当前第40页\共有55页\编于星期五\20点五、白前苷B对GCDC诱导人正常肝细L-02凋亡保护作用及机理研究—结果6、白前苷B对细胞内钙离子浓度的影响

注：与空白对照组比较：##P<0.01;与GCDC组比较:**P<0.01。GCDC100μM白前苷B给药组可以逆转GCDC诱导的细胞内Ca2+浓度升高。证明其保护肝细胞凋亡机理与调节细胞内Ca2+浓度相关。

当前第41页\共有55页\编于星期五\20点五、白前苷B对GCDC诱导人正常肝细L-02凋亡保护作用及机理研究—结果

7、白前苷B肝细胞内ROS的影响注：与空白对照组比较：##P<0.01;与GCDC组比较:*P<0.05，**P<0.01。

说明白前苷B对GCDC造成的肝细胞凋亡有明显的保护作用，其保护作用机制与抗细胞氧化作用相关。GCDC100μM当前第42页\共有55页\编于星期五\20点五、白前苷B对GCDC诱导人正常肝细L-02凋亡保护作用及机理研究—结果8、白前苷B对GCDC诱导细胞内GSH的影响

注：与空白对照组比较：##P<0.01;与GCDC组比较:**P<0.01。GCDC100μMGCDC可以产生细胞内氧化应激作用，使GSH降低，对肝细胞造成损伤，而白前苷B则对此产生保护作用。综合上述ROS检测，充分证明白前苷B保护肝细胞凋亡作用机制与抗细胞氧化应激作用相关。当前第43页\共有55页\编于星期五\20点五、白前苷B对GCDC诱导人正常肝细L-02凋亡保护作用及机理研究—小结

本实验结果表明：白前苷B在50—200μmol/L剂量范围内对GCDC诱导的黄疸性肝细胞凋亡有保护作用，并有明显的剂量依赖性。研究证明白前苷B抑制肝细胞凋亡的作用机理是：降低细胞内线粒体膜电位、抑制细胞内Ca2+的释放增多以及保护细胞氧化应激作用。当前第44页\共有55页\编于星期五\20点六、白前苷B对D-GalN/LPS诱导的肝损伤保护作用及机制的研究—方法肝细胞凋亡的检测

mRNA及蛋白水平TNF-α

、IL-6

的表达肝组织结构HE染色血清及肝组织相关生化指标检测

抑制小鼠死亡的量效关系实验

对小鼠肝损伤保护作用及机理研究

抑制小鼠死亡的时效关系实验

血清：ALT、AST、总胆红素肝组织：MDA、GSH、NO当前第45页\共有55页\编于星期五\20点六、白前苷B对D-GalN/LPS诱导的肝损伤保护作用机制的研究—结果1、量效关系及时效关系研究ED50=4.01（）mg/kg当前第46页\共有55页\编于星期五\20点六、白前苷B对D-GalN/LPS诱导的肝损伤保护

作用及机制的研究—结果（n=10）组别ALT（卡门氏）AST（卡门氏）总胆红素（μmol/L）空白对照39.49±10.1551.69±14.517.64±2.60D-GalN/LPS263.91±4.86##297.64±48.92##32.33±2.85##白前苷B低剂量239.45±6.81**188.84±24.55**20.44±1.81**白前苷B中剂量196.63±22.34**132.19±18.45**17.83±2.74**白前苷B高剂量100.94±19.35**66.43±15.7**11.54±1.61**（n=10）

组别NO（umol/gprot）MDA（nmol/mgprot）GSH（mgGSH/gprot）空白对照1.27±0.101.16±0.172.37±0.59D-GalN/LPS1.95±0.17##2.47±0.25##0.38±0.06##白前苷B低剂量1.71±0.26*1.93±0.16**0.60±0.06**白前苷B中剂量1.52±0.02**1.60±0.11**0.80±0.13**白前苷B高剂量1.37±0.10**1.33±0.24**1.43±0.39**注：与空白对照组比较：##P<0.01;与GCDC组比较:

*P<0.05,**P<0.01。

白前苷B具有保肝降酶、退黄作用。

白前苷B能提高肝脏抗氧化能力。2、血清及组织生化指标当前第47页\共有55页\编于星期五\20点六、白前苷B对D-GalN/LPS诱导的肝损伤保护作用及机制的研究—结果3、HE染色观察肝组织结构

肝组织结构清楚，肝索排列整齐，细胞核较大，核仁明显，结构清晰，肝细胞无变性、坏死、出血。肝索排列紊乱，细胞核明显不等，呈不同程度的固缩，细胞界限不清，并可见点状坏死。肝小叶周边肝细胞出现中至重度脂肪变性，细胞脂质，呈空泡状。

治疗各组，随给药剂量增加，肝组织结构逐渐清晰，高剂量组肝索结构排列与空白对照组相似，细胞碎片减少，细胞核结构恢复。当前第48页\共有55页\编于星期五\20点六、白前苷B对D-GalN/LPS诱导的肝损伤保护作用及机制的研究—结果4、HOE33342染色图

细胞核弥散均匀蓝色荧光

细胞核则出现浓染致密颗粒块状荧光，染色不均匀，核呈固缩圆珠状，有大量碎片存在，染色质边聚。

随给药剂量增加，核固缩数量减少，染色质边聚和碎片也逐渐减少，高剂量组细胞核形态恢复与正常对照组相似。当前第49页\共有55页\编于星期五\20点六、白前苷B对D-GalN/LPS诱导的肝损伤保护作用及机制的研究—结果（

n=10）组别TNF-α（ng/L）IL-6（pg/ml）空白对照30.88±10.4042.07±9.26D-GalN/LPS437.99±50.97##324.49±13.27##白前苷B低剂量253.01±20.64**197.39±22.55**白前苷B中剂量177.52±8.01**132.46±19.25**白前苷B高剂量93.04±28.27**67.97±12.71**注：与空白对照组比较：##P<0.01;与GCDC组比较:

*P<0.05,**P<0.01。

ABCDE

TNF-α

IL-6

β-actinA空白组B造模组C低剂量组D中剂量组E高剂量组5、TNF-α和IL-6蛋白及mRNA水平表达

白前苷B对D-GalN/LPS所致的小鼠急性肝损伤起到保肝护肝作用机理与调节免疫应答有关，通过调节炎症相关细胞因子而实现。

白前苷B可能通过下调TNF-α和IL-6的表达，使肝细胞炎症和坏死得以减轻，凋亡减少，从而对急性肝损伤起保护作用。当前第50页\共有55页\编于星期五\20点六、白前苷B对D-GalN/LPS诱导的肝损伤保护作用及机制的研究—小结

本实验通过对生化指标、组织切片、细胞凋亡以及细胞因子的检测，结果表明白前苷B对D-GalN/LPS诱导的小鼠急性肝损伤模型有保护作用。