重组克隆的筛选与鉴定

重组克隆的筛选与鉴定内容提要第一节载体表型选择法第二节DNA电泳检测法第三节核酸杂交检测法第四节免疫化学检测法第五节转译筛选法第六节真核重组基因的选择方法第2页,共167页，2024年2月25日，星期天一般克隆与筛选策略第3页,共167页，2024年2月25日，星期天第一节载体表型选择法根据载体提供的表型进行选择的方法：抗生素抗性基因的插入失活选择法

-半乳糖苷酶的显色反应选择法第4页,共167页，2024年2月25日，星期天一般原理一种利用抗生素抗性基因或其他基因的插入失活，来筛选重组子的方法。通常外源DNA插入的位点设计在特定基因上，一旦外源DNA插入，该基因就被破坏而失去活性。由此来判断载体上是否带有外源DNA。一、插入失活法的原理第5页,共167页，2024年2月25日，星期天二、利用抗生素抗性基因：pBR322以pBR322为例，说明利用抗生素抗性基因的插入失活的原理。1.原理在pBR322上有多个单一的限制酶位点，如BamHI位点，恰好在一个四环素抗性基因内。如果有外源DNA插入BamHI位点，那么涉及四环素抗性的基因就损坏，因此，带有重组pBR322质粒的细胞，仍对氨苄青霉素有抗性，但对四环素的抗性消失（敏感）。第6页,共167页，2024年2月25日，星期天2.筛选的方法①转化细胞涂布于含有氨苄青霉素的固体培养基上，并培养至菌落出现。②用一个牙签接触培养基的表面，将沾有不同菌落的牙签，放到另一含有四环素的固体培养基表面接触一下。③适温培养，有的克隆生长，有的不生长。④根据不会生长的位置，再回到带氨苄的培养基上去找那些原始的克隆。⑤这些克隆因为丧失了对四环素的抗性，就是含有重组pBR322质粒的重组子。第7页,共167页，2024年2月25日，星期天图pBR322的结构图第8页,共167页，2024年2月25日，星期天3.抗菌素标记的选择（1）Ampr氨苄青霉素抗性基因产生

-内酰胺酶。酶使氨苄青霉素变为青霉酮酸。青霉酮酸使蓝灰色的碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）褪色。Ampr有PstI、ScaI等多个插入位点。（2）四环素抑制细菌生长，但不杀死细菌。（3）环丝氨酸杀死生长的细菌，但不杀停止生长的细菌。第9页,共167页，2024年2月25日，星期天4.选择的过程（1）四环素抗性插入失活如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素抗性基因失活，可用四环素﹢环丝氨酸的平板，选择重组克隆。Tetr插入失活的细菌，其生长可被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；Tetr不失活的细菌，能抗四环素，正常生长，但可被环丝氨酸杀死。第10页,共167页，2024年2月25日，星期天无环丝氨酸图四环素抗性插入失活重组克隆第11页,共167页，2024年2月25日，星期天（2）氨苄青霉素抗性插入失活氨苄青霉素抗性基因编码产生

-内酰胺酶。酶使氨苄青霉素变为青霉酮酸。青霉酮酸使蓝灰色的碘-青霉素指示液褪色。如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基因失活，就不能使碘-青霉素指示液褪色呈蓝灰色。据此选择阳性克隆。第12页,共167页，2024年2月25日，星期天图氨苄青霉素抗性插入失活第13页,共167页，2024年2月25日，星期天第14页,共167页，2024年2月25日，星期天三、利用-半乳糖苷酶显色选择重组子的原理1.-半乳糖苷酶与LacZ基因由E.colilac操纵子上的LacZ基因编码。分解乳糖生成葡萄糖和半乳糖。2.LacZ

基因突变的LacZ基因，只编码

-半乳糖苷酶的部分肽段（氨基端）。第15页,共167页，2024年2月25日，星期天2.培养基中IPTG、X-gal的作用（1）IPTG作用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷是诱导物，可诱导lacZ基因的表达

-半乳糖苷酶。（2）X-gal作用5-溴-4-氯-3-吲哚-

-D-半乳糖苷。作为

-半乳糖苷酶水解的底物。（3）X-gal的显色反应β-半乳糖苷酶(四聚体)将X-gal水解成半乳糖苷和蓝色的吲哚衍生物(靛蓝)。在4℃蓝色加深。第16页,共167页，2024年2月25日，星期天

-互补作用是pUC质粒载体的特性。pUC载体：含有LacZ

基因，编码

-半乳糖苷酶的部分肽段（

片段，氨基端）。受体菌：基因组中带有突变的

-半乳糖苷酶基因（缺失

片段），可被IPTG诱导表达（只编码

-半乳糖苷酶的

-肽）。载体和受体菌基因组互补：只有当受体菌吸收了带有LacZ

基因的pUC质粒，才能合成完整的有活性的

-半乳糖苷酶。3.-互补作用第17页,共167页，2024年2月25日，星期天氨苄青霉素抗性基因LacZ

基因：编码

-半乳糖苷酶的部分肽段。LacZ

上有插入外源DNA的MCS位点。pUC18/19的结构图第18页,共167页，2024年2月25日，星期天利用蓝白斑法筛选pUC8/9重组子，是一种直接检测

-半乳糖苷酶活性的方法。①先将转化子涂于含有氨苄青霉素的培养基，能合成

-半乳糖苷酶。②然后再通过检测

-半乳糖苷酶的活性，来选择重组子，如果既能抗氨苄青霉素，又能合成

-半乳糖苷酶的细胞，就是重组子细胞。4.筛选的方法：蓝白斑法第19页,共167页，2024年2月25日，星期天③

-半乳糖苷酶分解X-gal的显色反应很灵敏。当在含有氨卡青霉素、X-gal、IPDG的培养基中，那些能合成完整的

-半乳糖苷酶的非重组子克隆，会因它能分解X-gal而变成蓝色；④而重组子克隆因LacZ

基因被破坏，不能合成完整的

-半乳糖苷酶，故不能分解X-gal而呈白色。第20页,共167页，2024年2月25日，星期天5.选择培养的原理在含有X-gal和IPTG的选择培养基上，载体上没有插入片段的转化子为蓝色菌落，而携带插入片段的重组质粒转化子为白色菌落。平板37℃培养后，放于冰箱3-4小时，可使显色反应充分，菌落为蓝色。第21页,共167页，2024年2月25日，星期天图

-半乳糖苷酶显色反应*

-半乳糖苷酶

乳糖半乳糖葡萄糖X-gal半乳糖5-溴-4-氯靛蓝++蓝色第22页,共167页，2024年2月25日，星期天图LacZ插入外源DNA第23页,共167页，2024年2月25日，星期天图白色菌落与蓝色菌落的挑选第24页,共167页，2024年2月25日，星期天四、pBS重组质粒的筛选实验使用的载体为pBS质粒。转化受体菌为E.coliDH5α菌株。由于pBS上带有Ampr和lacZ基因，故重组子的筛选采用Amp抗性筛选与α-互补现象筛选相结合的方法。第25页,共167页，2024年2月25日，星期天载体α-供体为羧基末端缺失的β-半乳糖苷酶。如pUC、pGEM系列载体。菌株α-受体为氨末端缺失的β-半乳糖苷酶。如DH5α(LacZ△M15)、JM101~110(LacZ△M15)等。第26页,共167页，2024年2月25日，星期天1.抗性筛选因pBS质粒带有Ampr基因，而外源DNA片段上不带该基因，故转化受体菌后，只有带有pBSDNA的转化子，才能在含有Amp的LB平板上存活下来；而只带有自身环化的外源DNA片段的转化子则不能存活。此为初步的抗性筛选。第27页,共167页，2024年2月25日，星期天2.lacZ基因的插入失活pBS质粒上带有β-半乳糖苷酶基因的调控序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。该编码区有一个多克隆位点，但并不破坏lacZ的阅读框架，不影响其正常功能。第28页,共167页，2024年2月25日，星期天3.DH5α菌株E.coliDH5α菌株带有β-半乳糖苷酶的C端的部分编码序列。在各自独立的情况下，pBS和DH5α编码的β-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在pBS和DH5α融为一体时，可形成具有β-半乳糖苷酶活性的蛋白质。第29页,共167页，2024年2月25日，星期天4.α-互补现象lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性突变体之间实现互补的现象。由α-互补产生的Lac+细菌较易识别，它在生色底物X-gal存在下，被IPTG诱导，形成蓝色菌落。第30页,共167页，2024年2月25日，星期天当外源DNA片段插入到pBS质粒的多克隆位点后，导致读码框架改变，表达蛋白失活，产生的肽段失去α-互补能力。因此，在同样条件下，含重组质粒的转化子，在生色诱导培养基上，只能形成白色菌落。第31页,共167页，2024年2月25日，星期天α互补作用/现象当pUC质粒转化LacZ基因的氨基未端编码序列缺失的Lac-指示菌株时，能恢复β-半乳糖苷酶活性，从而在含IPTG和X-gal的平板上，分解X-gal成5-溴-4-氯靛蓝，出现蓝色菌落的现象。当外源DNA插入pUC的MCS时，α-互补作用被破坏，在IPTG和X-gal平板上则不显蓝色而出现白色菌落。第32页,共167页，2024年2月25日，星期天第三节DNA电泳检测法PFGE第33页,共167页，2024年2月25日，星期天从转化后的克隆（转化子）中快速抽提重组质粒，琼脂糖凝胶电泳比较其分子量大小。插入外源DNA的重组质粒分子量大，没有插入外源DNA的质粒分子量小。比较不同质粒在凝胶中的迁移率，迁移快慢不同，即可选出重组子。一、直接电泳检测法第34页,共167页，2024年2月25日，星期天Marker载体重组图琼脂糖凝胶电泳图谱的比较已知未知第35页,共167页，2024年2月25日，星期天二、酶切产物电泳筛选法1.原理根据已知的外源DNA序列的限制性酶切图谱，选择1~2种内切酶切割质粒，电泳后比较DNA带数和长度。或用一种内切酶切下插入片段，再用另一种酶酶切这个片段，电泳后比较两者是否符合预计的结果。第36页,共167页，2024年2月25日，星期天图酶切产物的电泳筛选第37页,共167页，2024年2月25日，星期天图限制性内切酶酶切图谱第38页,共167页，2024年2月25日，星期天图表型筛选加酶切筛选０AATTAATT第39页,共167页，2024年2月25日，星期天三、PCR扩增检测法1.原理在模板序列上扩增出预期DNA片断。2.过程（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。（2）用插入的DNA片段的引物作PCR。（3）PCR产物电泳检查。（4）PCR产物的长度是否与外源基因一致。第40页,共167页，2024年2月25日，星期天第四节核酸的分子杂交核酸杂交技术由Hall、Nygaard等于70年代建立，应用DNA或RNA探针，与靶序列在溶液中杂交，检测固定在硝酸纤维素（NC）膜上的核酸序列的技术。核酸杂交法利用标记的核酸探针，与转化细胞的DNA进行杂交，可以直接筛选和鉴定目的序列克隆。第41页,共167页，2024年2月25日，星期天常用的方法：将转化后生长的菌落，复印到硝酸纤维膜上，再用碱裂细菌菌落，释放的DNA就吸附在膜上，再与标记的核酸探针温育杂交，核酸探针就结合在含有目的序列的菌落DNA上。该技术已广泛应用于基因的表达、基因定位、克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列检测、遗传病疾病的诊断及生物分类等方面。第42页,共167页，2024年2月25日，星期天一、核酸分子杂交的基础1.变性与退火DNA以双链形式存在，在进行分子杂交时，先将双链DNA分子解聚为单链，这一过程称为变性。两条单链通过碱基互补，聚合成稳定的双链区的过程称为退火或复性。第43页,共167页，2024年2月25日，星期天2.同源序列不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序，即某种程度的同源性，就可形成杂交双链。分子杂交可在DNA与DNA（Southernblot）、RNA与DNA（Northernblot）或RNA与RNA（Insitu）的二条单链之间进行。第44页,共167页，2024年2月25日，星期天3.分子杂交法分子杂交是通过一定方法，将核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性标记的探针与被固定的核酸分子杂交，经显影后，显示出目的DNA或RNA所处的位置。分子杂交就是将一种核酸单链用同位素或非同位素标记成为探针，再与另一种核酸单链进行杂交。第45页,共167页，2024年2月25日，星期天4.探针经过同位素或非同位素标记的已知序列的寡核苷酸。单一的已知序列的寡核苷酸探针，能与它们的目的序列配对，可以准确地设计杂交条件，以保证探针只与目的序列杂交而不与序列相近的非完全配对序列杂交，对于一些未知序列的目的片段则无效。第46页,共167页，2024年2月25日，星期天5.杂交的灵敏度和特异性核酸分子杂交具有高度的灵敏度和特异性。可以根据所使用的探针的已知序列，进行特异性的靶序列检测。第47页,共167页，2024年2月25日，星期天二、探针的类型根据核酸的性质，可分为：DNA探针、RNA探针、cDNA探针和寡核酸探针。根据是否使用放射性标记物，可分为：放射性标记探针和非放射性标记探针。根据是否存在互补链，可分为：单链和双链探针。根据放射性标记物掺入情况，可分为：均匀标记和末端标记探针。第48页,共167页，2024年2月25日，星期天1.双链DNA探针双链DNA探针的合成方法主要有两种：①切口平移法。②随机引物合成法。第49页,共167页，2024年2月25日，星期天2.单链DNA探针单链DNA探针主要有两种合成方法:①以M13载体衍生序列为模板，用Klenow片段合成单链探针。②以RNA为模板，用反转录酶合成单链cDNA探针。第50页,共167页，2024年2月25日，星期天3.末端标记DNA探针以Klenow片段标记3’末端为例说明末端标记的方法。第51页,共167页，2024年2月25日，星期天4.寡核苷酸探针利用寡核苷酸探针可检测到靶基因上单个核苷酸的点突变。常用的寡核苷酸探针主要有两种:单一已知序列的寡核苷酸探针许多简并性寡核苷酸探针组成的寡核苷酸探针库。第52页,共167页，2024年2月25日，星期天三、探针的标记方法与选择1.探针标记的方法①缺口平移法②DNA快速末端标记③T4多核苷酸激酶标记DNA5’末端法④随机引物延伸法⑤聚合酶链反应法。第53页,共167页，2024年2月25日，星期天2.标记方法的选择根据实验的要求如灵敏度和显示方法等，选择合适的标记方法。①一般放射性探针比非放射性探针的灵敏度高。②在检测单拷贝基因序列时，应选用标记效率高、显示灵敏的探针标记方法。③在对灵敏度要求不高时，可采用保存时间长的生物素探针技术，或比较稳定的碱性磷酸酶显示系统或过氧化物酶系统。第54页,共167页，2024年2月25日，星期天四、分子杂交1.常用的核酸杂交方法①

Southern印迹杂交（Southernblot）②

Northern印迹杂交（Northernblot）③菌落原位杂交（Colonyinsituhybridization）④组织原位杂交（Tissueinsituhybridization）等。⑤点杂交（Dotblot）第55页,共167页，2024年2月25日，星期天2.分子杂交的分类根据被测定的对象不同，可分为2大类:(1)Southern杂交被检对象为DNA，探针为DNA或RNA。DNA片段经电泳分离后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，然后与探针杂交。(2)Northern杂交RNA片段经电泳后，从凝胶中转移到硝酸纤维滤膜（NC）上，然后用探针杂交。被检对象为RNA，探针为DNA或RNA。第56页,共167页，2024年2月25日，星期天五、Southernblot1.Southern杂交或DNA印迹1975年由Southern创建，称为Southern印迹技术。用DNA或RNA探针检测样品DNA。2.特点Southern杂交用以检测经限制性内切酶切割后的DNA片段中是否存在与探针同源的序列。从宿主细胞中提取基因组DNA或质粒载体，再用探针杂交。只有插入目的片段的重组体，才能与探针杂交，并在X光底片上曝光显示印迹。第57页,共167页，2024年2月25日，星期天3.杂交的方法转膜：将DNA样本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳，分离各酶解片段，然后经碱变性、Tris缓冲液中和、高盐下通过毛吸作用，将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素（NC）滤膜上，烘干固定后，即可用于杂交。杂交：在一定条件下，探针与同源DNA片段杂交，然后漂洗除去非特异性结合的探针。通过自显影检查目的DNA所在位置。第58页,共167页，2024年2月25日，星期天4.杂交的步骤或程序(1)酶切待测目的DNA，凝胶电泳分离各酶切片段，并使DNA原位变性为单链。(2)将单链DNA片段转移到硝酸纤维素（NC）滤膜或尼龙膜上。(3)预杂交滤膜，掩盖滤膜上非特异性位点。(4)让单链的探针与同源DNA片段杂交，漂洗除去非特异性结合的探针。(5)通过自显影检测目的DNA所在位置。第59页,共167页，2024年2月25日，星期天Southern杂交(Southern印迹法)将混合在一起的限制性酶切DNA片段，用琼脂糖电泳分开，并变性为单链DNA，再转移到一张硝酸纤维素膜上。在膜上的单链DNA可用32p标记的单链DNA探针杂交。再用放射自显影方法，显示出与探针顺序互补的限制性酶切DNA片段的位置。这个方法能将上万个片段中的某一个特殊的目的片段鉴定出来。第60页,共167页，2024年2月25日，星期天图Southernblot第61页,共167页，2024年2月25日，星期天图Southernblot第62页,共167页，2024年2月25日，星期天凝胶电泳底片显示杂交印迹图Southern印迹第63页,共167页，2024年2月25日，星期天六、Northernblot1.Northern印迹杂交对被检测的RNA进行变性凝胶电泳，以除去RNA中的二级结构，使大小不同的RNA完全分离。将变性后RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上，然后与探针杂交。第64页,共167页，2024年2月25日，星期天2.特点用DNA或RNA探针检测RNA样品。从宿主细胞中提取RNA，再用探针杂交。主要检测插入片段是否被转录。用甲基氧化汞、乙二醛或甲醛变性RNA，变性后的RNA有利于在转印过程中与硝酸纤维素膜结合，以及保持其单链状态。用NaOH会水解RNA。第65页,共167页，2024年2月25日，星期天七、DNA-RNA杂交DNA-RNA杂交采用R-环检测法。选择过程①用mRNA与重组载体杂交。②在70%甲酰胺中，DNA双链变性，复性时，DNA-RNA杂交分子比DNA-DNA双链更稳定。③电镜下可见到R-环形结构。第66页,共167页，2024年2月25日，星期天图DNA-RNA杂交（R-环）第67页,共167页，2024年2月25日，星期天八、菌落原位杂交

Colonyinsituhybridization1.杂交的方法①将细菌从平板转移到硝酸纤维素滤膜上。②将滤膜上的菌落原位裂解，以释出DNA。③烘干，将DNA固定于膜上。④与32P标记的探针杂交。⑤平板置于4℃，放射自显影，检测菌落杂交信号（结果），并与平板上的菌落对应。第68页,共167页，2024年2月25日，星期天2.特点对应的菌斑(或噬菌斑)位置不变，可以直接找出阳性菌落。对分散在若干个琼脂平板上的少数菌落(~200)进行克隆筛选时可采用本法。将分散在若干个琼脂平板上的少数菌落归并到一个琼脂主平板以及已置于第二个琼脂平板表面的一张硝酸纤维素膜上。经培养一段时间后，对菌落进行原位裂解。第69页,共167页，2024年2月25日，星期天图菌落原位杂交Colonyinsituhybridization第70页,共167页，2024年2月25日，星期天九、组织原位杂交Tissueinsituhybridization，简称原位杂交1.方法组织或细胞经适当处理后，使细胞通透性增加，探针直接进入细胞内与DNA或RNA杂交。第71页,共167页，2024年2月25日，星期天2.特点组织的原位杂交与菌落的原位杂交不同，可以确定探针的互补序列在细胞内的空间位置。例如，通过与细胞RNA的杂交，可分析一种RNA在细胞组织中的分布、显示细胞及病原微生物的存在方式和部位等。

第72页,共167页，2024年2月25日，星期天十、斑点杂交斑点杂交是指将DNA或RNA样品直接点在硝酸纤维素滤膜上,然后与核酸探针分子杂交,以显示样品中是否存在特异的DNA或RNA。同一种样品经不同倍数的稀释,还可以得到半定量的结果。所以它是一种简便、快速、经济的分析DNA或RNA的方法,在基因分析和基因诊断中经常用到,是研究基因表达的有力工具。但由于目的序列未与非目的序列分离,不能了解目的序列的长度。尤其在本底干扰较高时,难以区分目的序列信号和干扰信号。第73页,共167页，2024年2月25日，星期天点杂交法（Dotblot）将被检测标本点到膜上，烘烤固定。这种方法耗时短，可做半定量分析，一张膜上可同时检测多个样品。为使点样准确方便，有多种多管吸印仪如Bio-Dot(Bio–Rad)，它们有许多孔，样品加到孔中，在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状，反复冲洗进样孔，取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，这时的膜就可以进行杂交。第74页,共167页，2024年2月25日，星期天凝胶中DNA片段的相对位置在DNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着。附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交，利用放射自显影术确定探针互补的每条DNA带的位置，从而可以确定在众多酶解产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。第75页,共167页，2024年2月25日，星期天1.核酸杂交重组克隆与探针杂交。2.检测用的探针与外源DNA插入片段互补的序列。3.识别标记（1）放射性同位素：32P或125I。（2）非放射性标记：荧光素一、原理第76页,共167页，2024年2月25日，星期天酶切前酶切后插入片段载体载体载体重组体重组体第77页,共167页，2024年2月25日，星期天第五节免疫化学检测法对表达产物的检测。蛋白—蛋白“杂交”利用抗体作为“探针”，检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。第78页,共167页，2024年2月25日，星期天一、放射性抗体检测法1.抗体与产物的结合方式根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性质可分为几种作用方式：第79页,共167页，2024年2月25日，星期天待测基因产物蛋白一抗二抗125I标记的二抗结合蛋白固相支持滤膜待测基因产物蛋白一抗125I标记的二抗固相支持滤膜待测基因产物蛋白一抗固相支持滤膜固相支持滤膜待测基因产物蛋白一抗二抗125I标记的二抗结合蛋白125I标记的二抗第80页,共167页，2024年2月25日，星期天2.放射性抗体检测法过程第81页,共167页，2024年2月25日，星期天3.Broome-Gilbert双位点检测法检测融合蛋白既检测外源基因产物又检测载体基因产物第82页,共167页，2024年2月25日，星期天质粒基因A插入基因B表达质粒蛋白A外源蛋白B融合蛋白第83页,共167页，2024年2月25日，星期天固相支持滤膜抗A抗体125I标记的抗B抗体质粒蛋白A外源蛋白B质粒蛋白A外源蛋白B固相支持滤膜抗A抗体发光，底片曝光第84页,共167页，2024年2月25日，星期天二、免疫沉淀检测法1.原理利用抗原—抗体凝集反应。用于检测分泌型产物。第85页,共167页，2024年2月25日，星期天2.方法把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体反应形成“沉淀圈”。对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。第86页,共167页，2024年2月25日，星期天第87页,共167页，2024年2月25日，星期天三、酶联免疫吸附测（ELISA）Enzyme-linkedimmunosorbantassay1.原理一抗（primaryantibody）与目标分子的特异结合二抗（secondaryantibody）与一抗的特异性结合酶连（enzyme-linke）二抗上携带一种酶能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量。第88页,共167页，2024年2月25日，星期天待测基因产物蛋白一抗二抗酶

待测基因产物蛋白一抗二抗无色的底物有色的产物比色观察酶

第89页,共167页，2024年2月25日，星期天2.ELISA检测的一般步骤（1）固定样品将待测样品加入96孔微量滴定板（microtiterplate）的孔中，干燥后就被固定在孔底。第90页,共167页，2024年2月25日，星期天孔底第91页,共167页，2024年2月25日，星期天（2）一抗结合加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体第92页,共167页，2024年2月25日，星期天一抗第93页,共167页，2024年2月25日，星期天（3）二抗结合加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉。二抗只识别一抗。二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物酶、脲酶等）。第94页,共167页，2024年2月25日，星期天二抗第95页,共167页，2024年2月25日，星期天（4）显色反应加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物质（或发光）。第96页,共167页，2024年2月25日，星期天第97页,共167页，2024年2月25日，星期天图ELISAassay第98页,共167页，2024年2月25日，星期天（5）比色在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打印出结果。第99页,共167页，2024年2月25日，星期天图Safire多功能扫描型酶标仪第100页,共167页，2024年2月25日，星期天3.ELISA的局限性有效，但准确性稍差（主要取决于一抗的特异性）。必须与其他方法一起综合考虑。最好用单克隆抗体（monoclonalantibody）第101页,共167页，2024年2月25日，星期天第102页,共167页，2024年2月25日，星期天临床检验常用的单抗第103页,共167页，2024年2月25日，星期天四、免疫印迹法（westernblotting）在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测胶上的蛋白质泳带第104页,共167页，2024年2月25日，星期天1.原理（1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）①SDS是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质维持线性状态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上负电荷②聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）（Polyacrylamidegelelectrophoresis）在电场的作用下线性蛋白质链在聚丙烯酰胺凝胶介质中向正极移动，移动的速率主要取决于其分子量大小（链的长短），从而把不同分子量的肽链分开。第105页,共167页，2024年2月25日，星期天电泳buffer电泳buffer图电泳槽第106页,共167页，2024年2月25日，星期天点样电泳方向图第107页,共167页，2024年2月25日，星期天③蛋白质电泳的分子量标准已知分子量的蛋白质混合液，与待测样品一起电泳，为样品蛋白质提供分子量估计。商品化供应道尔顿(质量单位,等于一氧原子质量的十六分之一。一克约为6×1023道尔顿第108页,共167页，2024年2月25日，星期天第109页,共167页，2024年2月25日，星期天Dalton第110页,共167页，2024年2月25日，星期天④凝胶中的蛋白质染色：1）直接染色考马斯亮蓝：灵敏度底、只能检出>0.3-1μg/带，但可褪色回收。硝酸银：灵敏度高、可检出2-5ng/带。2）转到膜上进行染色。第111页,共167页，2024年2月25日，星期天图直接染色电泳结果第112页,共167页，2024年2月25日，星期天（2）Westernblotting①Western（转膜）电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转到膜上（硝酸纤维素膜、PVDF膜、中性尼龙膜等）第113页,共167页，2024年2月25日，星期天胶里的蛋白质带在电场的作用下横向转移到正极一侧的膜上第114页,共167页，2024年2月25日，星期天膜胶蛋白第115页,共167页，2024年2月25日，星期天图Western装置第116页,共167页，2024年2月25日，星期天②Blotting原理与ELISA相同。辣根过氧化物酶：HRPO第117页,共167页，2024年2月25日，星期天待测蛋白硝酸纤维素膜一抗二抗辣根过氧化物酶底物产物，并发出光PAGE胶待测蛋白底片曝光第118页,共167页，2024年2月25日，星期天第119页,共167页，2024年2月25日，星期天③Blotting过程1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与膜上的蛋白结合。2）洗去未结合的一抗。3）用二抗与一抗结合（二抗上带有HRPO）。4）清洗掉未结合的二抗。5）用HRPO的底物浸泡膜。6）暗室里曝光，冲洗胶片。ImmunoBlotting第120页,共167页，2024年2月25日，星期天④结果第121页,共167页，2024年2月25日，星期天图单抗blotting结果第122页,共167页，2024年2月25日，星期天图多克隆抗体Blotting的结果第123页,共167页，2024年2月25日，星期天第六节翻译筛选法借助无细胞翻译系统，通过表达或抑制所选择的克隆载体上的外源基因的转录，来筛选其产物是否符合预期。适用于mRNA转录丰度高的外源基因。第124页,共167页，2024年2月25日，星期天一、无细胞翻译系统能把外源的mRNA翻译成蛋白质的细胞提取物。如：麦胚提取物系统、网织红细胞提取物系统。第125页,共167页，2024年2月25日，星期天二、转译筛选与预期的产物分子量相符？第126页,共167页，2024年2月25日，星期天mRNA无细胞翻译系统35S标记的甲硫氨酸翻译35S标记的肽链PAGE电泳放射自显影比较放射性带纹的位置载体+外源DNA转录第127页,共167页，2024年2月25日，星期天三、杂交抑制转译法1.原理mRNA一旦与DNA杂交成RNA-DNA双链后就不能被核糖体翻译出蛋白质（转译被抑制）。第128页,共167页，2024年2月25日，星期天单链mRNA核糖体小亚基核糖体大亚基能翻译mRNADNA核糖体小亚基核糖体大亚基不能翻译第129页,共167页，2024年2月25日，星期天2.过程第130页,共167页，2024年2月25日，星期天四、杂交释放转译法1.原理在高甲酰胺溶液中载体上克隆的cDNA与它的mRNA杂交吸附，然后洗脱，释放出与它对应的mRNA，进行体外转录。研究其转录产物的性质是否是预期的基因产物（如分子量、免疫源性等）。第131页,共167页，2024年2月25日，星期天2.过程第132页,共167页，2024年2月25日，星期天硝酸纤维素滤膜载体和插入的cDNA总mRNAcDNA基因的mRNA杂交洗脱cDNA基因的mRNA体外翻译cDNA编码的蛋白电泳凝胶放射自显影cDNA编码的蛋白硝酸纤维素滤膜载体和插入的cDNA硝酸纤维素滤膜载体和插入的cDNA收集35S标记的氨基酸第133页,共167页，2024年2月25日，星期天五、DNA-蛋白质相互作用筛选法专门设计检测能同DNA特异结合的蛋白质因子。第134页,共167页，2024年2月25日，星期天待测蛋白质硝酸纤维素滤膜能与蛋白质结合的DNA序列放射性标记待测蛋白质硝酸纤维素滤膜能与蛋白质结合的DNA序列放射性标记第135页,共167页，2024年2月25日，星期天第七节真核重组基因的选择方法一、哺乳动物基因转移的选择标记1.胸苷激酶（thymidinekinase,tk）（1）TK选择原理①四氢叶酸的必要性真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲基。第136页,共167页，2024年2月25日，星期天二氢叶酸还原酶

dihydrofolatereductase，DHFR二氢叶酸四氢叶酸DHFR第137页,共167页，2024年2月25日，星期天②氨甲喋啉（Methotrexate）的抑制作用氨甲喋啉（或氨基喋啉）是叶酸的类似物。能抑制二氢叶酸还原酶，从而阻断dATP、dCTP和dTTP的合成：第138页,共167页，2024年2月25日，星期天dUMP

dATP

TTP

dCTP

氨甲喋啉

抑制

抑制

第139页,共167页，2024年2月25日，星期天③次黄嘌呤的补救作用细胞可以利用次黄嘌呤合成dATP和dCTP。④胸苷酸激酶的补救作用TK+细胞能产生胸苷酸激酶，所以可以利用培养基中的胸苷（T）合成TTP，存活。第140页,共167页，2024年2月25日，星期天TtkdUMP

dATP

TTP

dCTP

次黄嘌呤

补救

氨甲喋啉

抑制

抑制

第141页,共167页，2024年2月25日，星期天（2）TK选择过程①HAT培养基含次黄嘌呤、氨基喋啉和胸苷的培养基(hypoxanthine，aminopterin，thiymidine）②宿主细胞

Tk-

细胞株③载体标记

TK基因，只有转入TK基因的细胞才能生存。第142页,共167页，2024年2月25日，星期天第143页,共167页，2024年2月25日，星期天2.二氢叶酸还原酶基因（DHFR）（1）选择原理①二氢叶酸还原酶的必要性真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲基。第144页,共167页，2024年2月25日，星期天dUMPdATPTTPdCTP四氢叶酸四氢叶酸第145页,共167页，2024年2月25日，星期天二氢叶酸还原酶合成四氢叶酸二氢叶酸四氢叶酸二氢叶酸还原酶第146页,共167页，2024年2月25日，星期天DHFR+细胞DHFR+细胞能产生二氢叶酸还原酶，所以能合成四氢叶酸。能在无胸腺嘧啶和次黄嘌呤的培养基中生存不需要补救！第147页,共167页，2024年2月25日，星期天DHFR-

细胞DHFR-

细胞不能产生二氢叶酸还原酶，所以不能合成四氢叶酸。不能在无胸腺嘧啶和次黄嘌呤的培养基中生存。需要补救！第148页,共167页，2024年2月25日，星期天②胸腺嘧啶和次黄嘌呤补救无四氢叶酸提供甲基，dNTP合成受阻时，胸腺嘧啶和次黄嘌呤分别补救:第149页,共167页，2024年2月25日，星期天dUMPdATPTTPdATP次黄嘌呤补救胸苷补救第150页,共167页，2024年2月25日，星期天（2）选择过程①宿主细胞DHFR-细胞株（不能在无核苷酸的培养基中生长）。需要胸腺嘧啶和次黄嘌呤补救！②无核苷酸的培养基透析除去血清中的内源性核苷酸，以免补救。第151页,共167页，2024年2月25日，星期天③氨甲喋呤“加压”添加少量氨甲喋啉抑