油樟根茎叶总DNA的提取毕业论文

本科毕业论文（设计）毕业论文题 目： 油樟 DNA 提取的研究 专 业： 生 物 科 学 学生姓名： 沈 志 强 学生学号： 030601023 系 级 班： 生物工程 03 级 1 班 指导教师： 罗 通 职称: 教 授 宜宾学院教务处制宜宾学院YIBIN UNIVERSITY宜宾学院本科毕业设计（论文）I摘要油 樟 是 樟 科 樟 属 植 物 ， 本 课 题 主 要 研 究 油 樟 根 茎 叶 DNA 的 提 取 方法 以 及 对 根 茎 叶 DNA 提 取 效 果 进 行 对 比 分 析 。 油 樟 的 细 胞 内 含 有 大 量的 多 糖 、 多 酚 、 鞣 质 等 次 生 代 谢 物 ,针 对 这 一 情 况 本 研 究 在 常 规 CTAB法 的 基 础 上 做 了 进 一 步 改 进 ， 成 功 提 取 出 了 高 质 量 DNA。 做 的 改 进 主要 有 ： 在 CTAB 提 取 缓 冲 液 中 加 入 2gPVP 以 除 去 酚 类 杂 质 ； 将DNA 样 品 溶 于 TE 缓 冲 液 中 保 存 时 在 样 品 中 加 入 3 lRNaseA， 以 除 去RNA。 用 改 进 CTAB 法 提 取 的 DNA 得 率 和 纯 度 都 较 高 。 用 改 进 CTAB 法提 取 的 油 樟 根 DNA 得 率 小 于 油 樟 茎 DNA 的 得 率 小 于 油 樟 叶 DNA 得 率 ，由 于 植 物 各 组 织 器 官 的 基 因 组 DNA 是 相 同 的 ， 因 此 宜 用 更 易 研 磨 成 细粉 的 油 樟 嫩 叶 来 提 取 油 樟 DNA， 用 做 科 研 和 教 学 。关 键 词 ： 油 樟 ； DNA； CTAB（ 十 二 烷 基 三 甲 基 溴 化 铵 ） ； 电 泳 ； 光 吸 收宜宾学院本科毕业设计（论文）IIAbstractCinnamomum longepaniculatum belongs to laurel family and Lauraceae species. The topics studied mainly the method of extracting DNA and compared the DNA extracting methods from roots, branches of Cinnamomum longepaniculatum . Cells of Cinnamomum longepaniculatum contain a large number of polysaccharides, polyphenols, tannins, and other secondary metabolites. Based on conventional CTAB method, a serial of improvements were carried out and high-quality DNA was successfully obtained. The main improvements are: 2g PVP was added into CTAB extraction buffer to remove impurities phenols; 3l RNaseA into the samples when DNA samples preserved in TE buffer to remove RNA. Improved CTAB extraction of DNA yield and purity was higher. The DNA yield using improved CTAB extraction was roots stems leaves. Because genomic DNA is same, it is easier to extract DNA from leaves of Cinnamomum longepaniculatum for research.Keywords: Cinnamomum longepaniculatum; DNA; CTAB method of DNA; electrophoresis; absorbing value of light宜宾学院本科毕业设计（论文）III目 录摘要 .IAbstract.II第 1 章 绪论 .1第 2 章 油樟根茎叶 DNA 的提取方法 .31.材料、药品、仪器 .31.1 材料 .31.2 主要试剂溶液 .31.3 主要仪器设备 .42.实验方法和步骤 .42.1 常规方法的提取 .42.2 改良 CTAB 法 .52.3 油樟根、茎、叶 DNA 提取的比较方法 .63.结果及分析 .63.1 0.8%琼脂糖凝胶电泳结果及分析 .63.2 紫外光谱分析 .84.讨论 .104.1 CTAB 法的基本原理 .104.2 几种主要试剂的作用与对比 .104.3 方法的探索及改进 .114.4 注意要点 .124.5 实验过程中遇到的问题及对策 .125.总结 .135.1.135.2.135.3.13参考文献 .14致谢 .15文献综述 .16宜宾学院本科毕业设计（论文）1第 1 章 绪 论图 1-1 油 樟如 图 1-1 油 樟 Cinnamomum longepaniculatum (Gamble)是 樟 科樟 属 植 物 。 高 大 乔 木 ， 叶 互 生 ， 卵 形 、 椭 圆 形 或 短 圆 形 ， 先 端 长 渐 尖 或 急尖 ， 基 部 楔 形 至 近 圆 形 ， 长 5.5-12cm， 宽 3-6 cm， 幼 时 即 无 毛 ， 腹面 暗 绿 色 ， 有 光 泽 ， 背 面 粉 绿 色 ， 通 常 羽 状 脉 ， 中 脉 两 面 凸 起 ， 侧 脉 约5-6 对 ， 两 面 凸 起 ， 脉 腋 腹 面 泡 状 隆 起 ， 背 面 有 小 窝 孔 ， 孔 内 有 短 毛 ， 横脉 和 细 脉 背 面 较 明 显 ， 叶 柄 长 2-3 cm， 无 毛 。 圆 锥 花 序 腋 生 ， 纤 细 ，疏 散 ， 通 常 长 10 cm 以 上 ， 无 毛 ， 花 梗 长 1-3 cm， 无 毛 ； 花 被 长 约2 mm， 外 侧 无 毛 ， 内 侧 密 被 毛 ， 裂 片 卵 形 ， 长 1.5 mm， 花 后 花 被 上 部自 花 被 管 的 顶 端 处 整 齐 环 裂 脱 落 ； 雄 蕊 长 约 1 mm， 被 柔 毛 ， 第 3 轮的 花 丝 基 部 有 1 对 具 短 柄 状 的 腺 体 ， 退 化 雄 蕊 长 约 0.5 mm， 被 毛 ，近 心 形 ； 雌 蕊 无 毛 ， 子 房 近 圆 球 形 状 ， 花 柱 较 子 房 为 长 ， 柱 头 小 ， 盘 状 。果 阔 倒 卵 状 ， 顶 端 平 或 微 凹 ， 歪 斜 ， 稍 扁 ， 长 9 mm， 直 径 8 mm， 果托 碟 状 ， 全 缘 ， 直 径 约 3.5 mm； 果 梗 长 4-5 mm， 向 上 增 粗 。 花 期 4-5 月 ； 果 期 8-9 月 1。油 樟 在 四 川 有 大 量 分 布 ， 产 于 叙 永 、 宜 宾 、 屏 山 、 娥 眉 、 雅 安 、 邛 崃等 地 。 宜 宾 是 油 樟 的 分 布 中 心 。 在 经 历 了 许 多 坎 坷 之 后 ， 油 樟 终 于 闪 现 出了 它 那 金 子 般 的 光 芒 。 1951 年 修 建 成 渝 铁 路 时 ， 油 樟 被 成 批 地 砍 伐 用作 枕 木 ； 1958 年 大 办 钢 铁 时 ， 油 樟 竟 老 嫩 不 拘 ， 被 用 作 烧 泡 炭 的 燃 料 ；1960 年 生 活 困 难 时 ， 为 了 熬 煮 樟 油 ， 对 幸 存 的 樟 树 进 行 了 掠 夺 性 的 采 摘 。宜宾学院本科毕业设计（论文）2这 些 事 实 都 导 致 珍 贵 的 油 樟 资 源 招 到 了 大 规 模 的 破 坏 ， 幸 好 在 1978年 十 一 届 三 中 全 会 以 来 ， 各 项 林 业 政 策 得 到 了 落 实 ， 油 樟 林 也 逐 渐 得 以 恢复 。1978 年 樟 油 产 量 增 长 为 356t， 比 1959 年 的 305 t， 增 长16.7%。 到 1985 年 宜 宾 县 已 有 油 樟 林 35130 亩 ， 采 叶 油 樟 树 达 到 369万 余 株 ， 全 县 树 龄 达 到 100 年 以 上 的 油 樟 64 株 ， 200 年 以 上 的 9 株 。1986 年 宜 宾 县 被 列 为 四 川 油 樟 基 地 2， 由 于 大 力 发 展 油 樟 ， 到 1995 年 ， 宜 宾 全 县 油 樟 面 积 由 1980 年 的 0.28 万 hm2 发 展 到 0.77 万hm2 ， 樟 油 产 量 从 1980 年 的 400 多 吨 ， 增 加 到 1995 年 的 1200 t ， 占 全 国 同 类 产 品 产 量 的 75 %， 占 全 省 产 量 的 90 %， 产 品 畅 销 日本 、 德 国 、 法 国 、 美 国 等 50 多 个 国 家 和 地 区 ， 为 国 家 创 汇 450 多 万美 元 3。 宜 宾 县 被 称 为 全 国 保 存 和 发 展 最 好 的 天 然 香 料 油 源 基 地 。樟 油 粗 加 工 的 主 产 品 1. 8-桉 叶 油 素 ， 被 称 为 “中 国 桉 叶 油 ”4，1984 年 被 评 为 四 川 省 优 质 产 品 。 1999 年 ， 为 适 应 西 部 大 开 发 的 形 势 ，增 加 长 江 上 游 绿 色 植 被 ， 加 大 力 度 保 护 油 樟 树 这 一 独 特 资 源 ， 建 设 全 国 最大 的 木 本 香 料 油 基 地 ， 宜 宾 县 又 决 定 到 2001 年 ， 用 3 年 时 间 ， 再 营造 0.30 万 hm2 油 樟 树 基 地 。 油 樟 树 具 有 生 长 快 、 材 质 好 ， 萌 发 力 强 、干 形 通 直 ， 树 形 美 观 等 特 点 ， 叶 、 枝 、 根 、 茎 、 花 、 果 富 含 芳 香 油 ， 是 提炼 天 然 香 料 的 优 良 树 种 ， 也 是 目 前 全 国 保 存 和 发 展 最 好 的 天 然 香 料 油 源 。它 含 有 1 8-桉 叶 油 素 、 -萜 品 醇 （ 松 香 醇 ） 和 香 穗 烯 等 40 多 种 成分 ， 经 过 深 度 加 工 可 以 提 取 多 种 重 要 的 天 然 单 离 原 料 ， 是 国 防 、 轻 工 、 香料 、 医 药 和 高 级 电 镀 工 业 的 稀 有 原 料 5。 特 别 是 从 中 提 取 的 1 8-桉叶 油 素 物 性 稳 定 、 芳 香 纯 正 ， 在 国 际 贸 易 中 被 称 为 “中 国 桉 叶 油 ”，在 世 界 各 国 都 属 免 检 产 品 。为 了 充 分 开 发 利 用 油 樟 这 一 优 势 资 源 ， 国 家 科 委 于 1996 年 将 其列 入 了 国 家 “星 火 计 划 ”和 名 特 优 经 济 林 商 品 基 地 建 设 项 目 6。 宜宾 县 地 处 金 沙 江 和 岷 江 下 游 “金 三 角 ”地 带 ， 是 全 国 最 大 的 油 樟 基 地 ，樟 油 产 量 占 全 国 的 75%， 占 四 川 的 90%， 被 中 外 客 商 誉 为 “油 樟 王 国 ”。 大 力 发 展 油 樟 ， 对 农 民 致 富 、 出 口 创 汇 、 增 加 税 收 、 绿 化 荒 山 以 及 维 持长 江 上 游 的 生 态 环 境 等 都 起 着 十 分 重 要 的 作 用 。 我 们 学 校 已 经 建 立 了 以 油樟 为 主 要 研 究 对 象 的 “西 南 特 色 经 济 植 物 重 点 实 验 室 ”， 为 了 从 分 子水 平 上 对 其 做 进 一 步 的 研 究 ， 本 课 题 开 始 了 初 步 的 尝 试 ， 目 的 是 为 以 后 的分 子 生 物 学 分 析 打 下 基 础 。宜宾学院本科毕业设计（论文）3第 2 章 油樟根茎叶 DNA 的提取方法由 于 DNA分 子 标 记 实 验 以 及 其 他 许 多 分 子 实 验 ， 是 从 研 究 生 物 个 体 的基 因 组 ， 脱 氧 核 糖 核 酸 开 始 的 ， 因 此 ， 能 否 得 到 高 质 量 的 基 因 组 DNA自 然 成 为 DNA标 记 技 术 关 键 的 一 步 ， 只 有 高 质 量 的 DNA， 才 能 够 获 得 理想 的 DNA条 带 。 油 樟 的 细 胞 内 含 有 大 量 的 多 糖 、 多 酚 、 鞣 质 等 次 生 代 谢 物 。这 些 次 生 代 谢 产 物 , 不 仅 能 干 扰 DNA 的 提 取 过 程 , 影 响 DNA 的 得 率 , 还 能 与 DNA 发 生 不 可 逆 的 结 合 (尤 其 是 多 酚 氧 化 后 产 物 ) , 影 响 DNA 的 质 量 , 使 提 取 的 DNA 样 品 呈 棕 褐 色 , DNA 溶 液 粘 稠 , 这 种 不 纯 的DNA 既 不 能 被 内 切 酶 酶 切 , 也 不 能 作 为 PCR 模 板 , 不 能 用 于 常 规 的 分子 生 物 学 分 析 和 研 究 7 。 因 此 , 如 何 从 油 樟 中 取 得 适 于 分 子 遗 传 分 析和 鉴 定 的 高 纯 度 基 因 组 DNA 是 对 其 进 行 分 子 生 物 学 研 究 首 先 要 解 决的 问 题 。 虽 然 目 前 国 内 外 针 对 多 种 顽 拗 植 物 基 因 组 DNA 的 提 取 进 行 了大 量 的 研 究 , 提 出 了 许 多 改 进 方 法 , 但 这 些 技 术 方 法 只 是 针 对 某 种 或某 类 植 物 而 言 , 不 同 的 顽 拗 植 物 所 含 的 次 生 代 谢 物 种 类 和 含 量 不 同 , 因 此 改 进 的 方 法 也 存 在 差 异 , 不 能 普 遍 适 用 。 要 想 得 到 高 质 量 的DNA， 在 DNA提 取 过 程 中 既 要 防 止 DNA的 降 解 和 变 性 ， 又 要 尽 量 保 持 其 在生 物 体 内 的 天 然 状 态 。 要 提 取 天 然 的 具 有 生 物 活 性 的 DNA， 必 须 在 温和 的 条 件 下 ， 防 止 过 酸 、 过 碱 和 DNA酶 的 污 染 ， 避 免 剧 烈 振 动 与 搅 拌8。 采 用 常 规 CTAB法 提 取 的 油 樟 基 因 组 DNA 质 量 很 差 ,本 研 究 就 以 油樟 的 根 、 茎 、 叶 为 实 验 材 料 ,探 讨 提 取 高 质 量 油 樟 基 因 组 DNA 的 方 法 。1.材料、药品、仪器1.1 材料采 于 宜 宾 县 宗 场 镇 孜 岩 村 陆 场 主 承 包 的 油 樟 林 ， 采 取 了 幼 嫩 的 油 樟 根 、茎 、 叶 ， 装 入 1.5mlEppendorf管 和 5ml离 心 管 ， 立 即 置 液 氮 罐 中 预 冷 ，带 回 实 验 室 后 ， 保 存 于 -70 的 冰 箱 中 备 用 。1.2 主要试剂溶液1.2.1 液 氮 ;宜宾学院本科毕业设计（论文）41.2.2 CTAB提 取 缓 冲 液 （ 2） ： 100mmol/l Tris-Hcl(PH8.0),20mmol/l EDTA,1.4mmol/lNacl,2%(W/V)CTAB,4%(V/V) -巯 基 醇 ,2%(W/V)PVP;1.2.3 CTAB沉 淀 缓 冲 液 （ 1） ： 50mmol/l Tris-Hcl(PH 8.0),10mmol/l EDTA,0.7mmol/lNacl,1%(W/V)CTAB,2%(V/V) -巯 基 乙 醇 ;1.2.4 CTAB/Nacl溶 液 （ 10%CTAB/0.7mol/lNacl） :在 80ml蒸 馏 水 中 溶解 4.1gNacl,缓 慢 加 入 10gCTAB,同 时 加 热 搅 拌 ， 如 果 需 要 ， 可 加 热 至65 溶 解 9;1.2.5 氯 仿 /异 戊 醇 （ 24： 1） ;1.2.6 电 泳 缓 冲 液 （ TAE） ：A)50储 存 液 （ PH 约 8.5） :24.2gTris 碱 ,5.7ml 冰 醋 酸 ，3.72gEDTA,补 加 水 至 100mlB)1 工 作 液 ： 40mmol/lTrisAc,1mmol/lEDTA;1.2.7 琼 脂 糖 凝 胶 ： 0.8g 琼 脂 糖 ， 0.5 g/mlEB,补 加 1 TAE 至100ml。1.3 主要仪器设备1.3.1 通 风 橱1.3.2HH-S 数 显 恒 温 水 浴 锅1.3.3 冷 冻 高 速 离 心 机1.3.4 紫 外 分 光 光 度 计1.3.5CHN868PH 计1.3.6 立 式 电 热 压 力 蒸 汽 灭 菌 器1.3.7 优 普 超 纯 水 机1.3.8 格 兰 仕 微 波 炉1.3.9BIO-RAD 凝 胶 成 像 系 统1.3.10 电 热 恒 温 鼓 风 干 燥 箱2.实验方法和步骤2.1 常规方法的提取本 研 究 参 考 精 编 分 子 生 物 学 实 验 指 南 ， 采 用 常 规 CTAB 法 来 提取 油 樟 根 、 茎 、 叶 DNA， 具 体 操 作 程 序 如 下 ：宜宾学院本科毕业设计（论文）52.1.1 在 所 需 的 CTAB 抽 提 液 中 加 入 -巯 基 乙 醇 ， 使 终 浓 度 达4%（ V/V） ， 将 此 溶 液 及 CTAB/Nacl 溶 液 加 热 至 65 ;2.1.2 取 新 鲜 幼 嫩 叶 片 （ 根 或 茎 ） 约 3g,迅 速 放 入 离 心 管 中 ， 置 于 液 氮罐 中 预 冷 ;2.1.3 将 样 品 从 液 氮 罐 中 取 出 ， 放 入 预 冷 的 研 钵 中 ， 在 研 钵 中 不 断 倒 入 液氮 ， 将 叶 片 （ 根 或 茎 ） 研 磨 成 细 粉 ;2.1.4 迅 速 将 研 磨 好 的 细 粉 装 入 试 管 中 ， 加 入 12 l 预 热 的 -ME/CTAB， 混 合 使 之 充 分 湿 润 ;2.1.5 将 试 管 置 于 65 水 浴 中 ， 保 温 80min,不 时 混 匀 ;2.1.6 待 冷 至 室 温 后 ， 用 等 体 积 的 酚 /氯 仿 /异 戊 醇 （ 25： 24： 1） 抽 提 ，轻 缓 颠 倒 充 分 混 匀 ， 于 4 ， 12000rpm 离 心 10min， 回 收 上 （ 水 ） 相 ;2.1.7 在 回 收 的 上 层 中 加 入 1/10 体 积 的 65 预 热 的 CTAB/Nacl 溶 液 ，颠 倒 混 匀 ;2.1.8 用 等 体 积 的 氯 仿 /异 戊 醇 抽 提 ， 混 匀 ， 于 4 ， 12000rpm 离 心10min， 回 收 上 （ 水 ） 相 ;2.1.9 加 入 正 好 1.5 体 积 的 CTAB 沉 淀 液 ， 颠 倒 离 心 管 混 匀 ， 如 果 沉 淀 可见 ， 继 续 步 骤 2.1.11， 否 则 于 65 预 热 30min;2.1.11 加 入 0.6 体 积 的 异 丙 醇 沉 淀 核 酸 ， 充 分 混 匀 ， 于 4 ，12000rpm 离 心 10min， 沉 淀 DNA， 用 80%的 乙 醇 洗 涤 沉 淀 物 ， 干 燥 ;2.1.12 沉 淀 干 燥 后 溶 于 100 lTE 缓 冲 液 中 ， -20 储 存 备 用 ;2.1.13 用 0.8%的 琼 脂 糖 凝 胶 做 电 泳 分 析 ; 2.1.14 用 紫 外 分 光 光 度 计 做 紫 外 光 谱 分 析 。2.2 改良 CTAB 法具 体 操 作 程 序 如 下 （ 所 有 步 骤 为 严 格 的 无 菌 操 作 ） ：2.2.1 在 12mlCTAB 抽 提 液 中 加 入 480l-巯 基 乙 醇 ,使 终 浓 度 达4%（ V/V） 。 将 此 溶 液 及 CTAB/NaCl 溶 液 水 浴 加 热 至 65 ；2.2.2 取 新 鲜 幼 嫩 根 （ 叶 片 或 茎 ） 约 3g， 放 入 预 冷 的 研 钵 中 ， 不 断 倒 入液 氮 将 根 （ 茎 或 叶 ） 研 磨 成 细 粉 ；迅 速 将 研 磨 好 的 细 粉 装 入 试 管 中 ， 加 入 预 热 的 -ME/CTAB， 混 合 使之 充 分 湿 润 ；2.2.3 将 试 管 置 于 65 水 浴 中 ， 保 温 80min,其 间 不 时 混 匀 ；2.2.4 将 样 品 转 移 至 50ml 离 心 管 中 ， 待 冷 至 室 温 后 ， 用 等 体 积 的 氯 仿 /异 戊 醇