壳聚糖提取工艺的研究

壳聚糖提取工艺的研究1 前言壳聚糖(Chitosan)是一种阳离子型直链氨基多糖，又称为甲壳胺、壳多糖、可溶性甲素、脱乙酰甲壳素、聚氨基葡萄糖等，化学名为聚-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖 1。它是甲壳素( chitin)脱去分子中的乙酰基而形成的。甲壳素，广泛存在于昆虫、甲壳类动物外壳、真菌细胞壁及一些藻类中，是由 N-乙酰氨葡糖聚合而成的多糖。一般把脱乙酰度在 70%以上的称为壳聚糖，70%以下的称为甲壳素 2。蟹壳大 约 3/4 为 碳 酸 钙 ， 余 1/4 中 约 有 一 半 为 甲 壳 质 ， 余 一 半 主 要 为 蛋白 质 。 现 如 今 ， 蟹 已 大 范 围 养 殖 并 在 各 大 市 场 普 及 ， 蟹 壳 极 易 得 到 ， 而 成 本又 较 低 ， 所 以 选 择 蟹 壳 为 原 料 制 取 壳 聚 糖 。1.1 壳聚糖的理化性质1.1.1 主要物理性质不能完全溶解于水和碱溶液中，但可溶于稀酸(pH6)，游离氨基质子化促进溶解。壳聚糖在溶液中是带正电荷多聚电解质，具有很强的吸附性；壳聚糖的溶解性与脱乙酰度、相对分子质量、粘度有关，脱乙酰度越高，相对分子质量越小，越易溶于水；壳聚糖的溶解性与脱乙酰度、相对分子质量、粘度有关，脱乙酰度越高，相对分子质量越小，越易溶于水。壳聚糖具有很好的吸附性、成膜性、通透性、成纤性、吸湿性和保湿性 3。1.1.2 主要化学性质甲壳素和壳聚糖可与多种有机酸的衍生物如酸酐、酰卤（主要是酰氯）反应，导入不同分子量的脂肪族或芳香族酰基，这是壳聚糖化学反应中研究得最多的一种；甲壳素和壳聚糖的羟基可与烃基化试剂反应生成醚，如甲基醚，苄基醚、羧甲基醚等；甲壳素和壳聚糖的特殊结构使得它们对具有一定离子半径的一些金属离子在一定的 PH 条件下具有螯合作用。1.2 壳聚糖的应用1.2.1 医 学 应 用1.2.1.1 促 进 凝 血 和 伤 口 愈 合 ： 壳聚糖具有促进血液凝固的作用，可用作止 血剂 。它还可用于伤口填料物质，具有灭菌、促进伤口愈合、吸收伤口渗出物、不易脱水收缩等作用 4。1.2.1.2 可作 为 药 物 的 缓 释 基 质 ： 壳聚糖能被生物体内的溶菌酶降解生成天然的代谢物，具有无毒、能被生物体完全吸收的特点，因此用它作药物缓释剂具有较大的优越性。日 本 已有以壳聚糖作为基质的缓释药 物 出售 4。1.2.1.3 用 于 人 造 组 织 和 器 官 ：壳聚糖与磷酸钙的复合物可作为骨的替代物，用于骨的修补及牙的填料；壳聚糖衍生物与聚酯的复合材料可用作人造血管。壳聚糖和甲壳素混合后可制成高强度的丝状纤维，用作手术线。这种手术线能被生物体内的溶菌酶降解，伤口愈合后不需拆除就能被机体充分吸收，不会产生过敏反应。 1.2.1.4 具 有 免 疫 调 节 活 性 ： 壳聚糖具有激活机体系 统 、介导机体系统的系列生 物 学 效应，提高吞噬细胞的系统功能。巨噬细胞表面存在着细菌多糖的受体，而壳聚糖作为细菌多糖的类似物，能刺激巨 噬 细 胞 活化 4。1.2.2 生物学方面的应用1.2.2.1 作为固定化酶的载体：壳聚糖是一种网状载体，具有机械性能良好、化学性质稳定、耐热性强等优点，特别是分子中存在的氨基易与蛋白质或酶结合，可络合金属离子，使酶免受金属离子的抑制，同时它又易于通过接枝而改性，因此是一种良好的蛋白质和酶的载体 5。现已成功地在壳聚糖上固定了碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、淀粉酶、天冬氨酸酶、纤维素及半纤维素酶等。壳聚糖对酶的固定化技术的常用方法是将酶包埋在载体上或通过醛桥将酶固定到载体上。1.2.2.2 细胞培养用微载体：壳聚糖来自于生物体，细胞毒性极低、亲和性好、安全性高，是制造细胞培养用微载体的好材料。现在用壳聚糖培养细胞有两种常用的技术：一是将细胞封入微型胶囊中，即将悬浮细胞带有负电荷的羧甲基纤维素溶液滴入带正电荷的壳聚糖溶液中，形成封有细胞的胶囊。二是将壳聚糖溶液涂敷在具有一定直径的硅胶颗粒上，为哺乳动物细胞的附着提供亲和表面 5。2 材料与方法2.1 材料原料：蟹壳。试剂：HCOOH、NaOH、KMnO 4、草酸，均为分析纯。2.2 方法2.2.1 生产工艺蟹壳剔杂洗净，用甲酸浸泡脱去无机盐后，水洗至中性，加入稀氢氧化钠溶液中浸煮脱除蛋白质，粗制甲壳素。粗品用 1%KMnO4 溶液浸渍 1 小时，水洗后置于 1%的草酸溶液中，于(6070) 搅拌，水洗，精制甲壳素 6。将甲壳素分别浸入(4060)% 浓氢氧化钠溶液中，温度控制在(130140)，反应(24) 小时，然后水洗、干燥后得壳聚糖。2.2.2 脱钙阶段条件的测定2.2.2.1 在 90反应 4h 的条件下，用酸浓度 40、 45、50、55、60、65%来测定甲酸浓度对产品的影响。2.2.2.2 用 50%甲酸在 90下浸泡蟹壳，在 1、2、3、4、5h 时间下测定甲酸处理时间对产品的影响。2.2.2.3 用体积分数为 50的甲酸酸浸 4h，在 90、100、110、120、130温度下测定甲酸处理温度对产品的影响。2.2.3 脱蛋白质阶段条件的测定2.2.3.1 取 10 克脱钙蟹壳于 100下分别以不同浓度 1、5、10、15、20%氢氧化钠溶液提取 4h，测定碱液处理温度与蛋白提取量的关系，得最佳氢氧化钠浓度。2.2.3.2 取 10 克脱钙蟹壳，用 5氢氧化钠溶液在 100条件下分别提取蛋白3、4、5、6、7h，得出最佳反应时间。2.2.3.3 取 10g 脱钙蟹壳以 5氢氧化钠溶液分别于 80、90、100、110、120下提取 4h，确定碱液处理温度。2.2.4 单因素对脱乙酰的影响2.2.4.1 碱液浓度：在温度为 140反应 4h 的条件下，取碱液浓度40%、 45%、 50%、55%、 60%测得碱液浓度对脱乙酰度的影响。2.2.4.2 处理时间：在 55%的碱液和 140的温度下，取反应时间2、3、4、5、6h 来测定反应时间对脱乙酰度的影响。2.2.4.3 温度：用 55%的碱液，反应 4h，取温度 110、120、130、140、150测定温度对脱乙酰的影响。2.2.5 脱乙酰正交实验设计根据单因素分析脱乙酰的测定结果，选择碱液浓度（A ） 、处理时间（B ） 、温度（C ）三因素，设计脱乙酰正交实验，来确定最佳参数。表 1 脱乙酰正交因素水平表因素水平 A/% B/hC/1 50 2 1202 55 3 1303 60 4 1402.2.6 测定脱乙酰度方法称取 0.30.5g 壳聚糖样品，每种样品 3 个重复，放入 250m L 锥形瓶中，加入 0.1mol/L HC1 标准溶液 30m L，搅拌至完全溶解，加入 56 滴甲基橙一苯胺蓝指示剂，用 0.1mol/L NaOH 标准溶液滴定溶液变成浅黄绿色 7。记下NaOH 的用量，根据 HC1 和 NaOH 的量即可算出样品的脱乙酰度：NH2(%)=(C1V1-C2V2)0.016100/G(100-W)脱乙酞度 = NH2(%)100%/9.94%式中：C 1盐酸标准溶液浓度(1mol/L)C2氢氧化钠标准溶液浓度(1mol/L)V1加入盐酸标准溶液体积(mL)V2滴定时消耗氢氧化钠标准溶液体积(mL)G试样重(g)W试样水分 (%)0.016与 1 mol/L 盐酸相当的氨基量(g)2.2.7 粘度的测定移取溶液于乌氏粘度计中，用秒表分别测定溶剂及不同浓度壳聚糖溶液（用溶剂逐步稀释得到）的流出时间，取多次测量结果的平均值。2.2.8 Ca2+浓度的测定Ca2+浓度的测定采用 EDTA 络合滴定法 8，Ca 2+浓度计算公式如下：(Ca2+， mg/L)=(V1-V0)CEDTA1000/VCEDTA=0.01mol/L；V 1 消耗 EDTA 标准液体积；V 0 空白消耗 EDTA 溶液体积；V 吸取水样体积。3 结果与讨论3.1 脱钙阶段条件的测定结果3.1.1 甲酸处理浓度的测定结果取 10 克洗净蟹壳在 90反应 4h，测定甲酸处理浓度对产品的影响，结果见表 2。表 2 甲酸处理浓度对产品的影响甲酸浓度/% 钙提取量/g 脱乙酰度/% 粘度 /PaS40 2.55 76.78 0.6245 2.60 77.13 0.5750 2.67 78.25 0.4955 2.66 78.10 0.4160 2.58 77.91 0.3365 2.49 77.79 0.22由表 2 可知，随着甲酸体积分数的增加，产品粘度度降低，脱乙酰度升高；当甲酸体积分数大于 50时，产品脱乙酰度升高缓慢，脱钙量最大，当甲酸体积分数大于 55时，产品粘度大幅度下降。综合考虑甲酸浓度选 50为宜。3.1.2 甲酸处理时间的测定结果取 10 克洗净蟹壳用 50%甲酸在 90下分别浸泡 1、2、3、4、5h，考察酸浸时间对产品的影响，结果见表 3。表 3 甲酸处理时间对产品的影响反应时间 /hCa2+浓度/10 -4molL-1粘度 /PaS 脱乙酰度 /%1 1.4 0.75 74.72 1.3 0.71 75.03 1.1 0.46 75.94 0.7 0.38 76.85 0.6 0.24 77.6由表 3 可以看出，酸处理时间为 4h 时，钙质即可完全除尽，并且随着酸浸时间的延长，脱乙酰度缓慢增加，但粘均分子量大幅减小。此外，实验中得知过于延长酸处理时间，对脱除钙质不会有明显效果，反而有可能增加甲壳素分子的降解，可见适宜的酸浸时间为 4h。3.1.3 甲酸处理温度的测定结果取 10 克洗净蟹壳在体积分数为 50的甲酸在 80、90、100、110、120温度下酸浸 4h，测定处理温度对产品的影响，结果见表 4。表 4 甲酸处理温度对产品的影响处理温度 钙提取量/g 粘度 /PaS 脱乙酰度80 2.66 0.68 78.390 2.74 0.67 78.5100 2.44 0.60 78.1110 2.35 0.51 77.7120 2.21 0.39 77.3由表 4 知，随着温度的升高，钙提取量越小。根据甲酸本身挥发性较强，考虑其用料经济，选取酸浸温度为 90。3.2 脱蛋白质阶段条件的测定结果3.2.1 氢氧化钠浓度测定结果取 10 克脱钙蟹壳于 100下分别以 1、5、10、15、20%氢氧化钠溶液提取4h。结果见图 1。0510152025.91.0.1.2.31.4蛋白提取量(g) 碱 液 浓 度 (%)图 1 不同浓度的碱液对蛋白质提取量的影响由图 1 知，当氢氧化钠浓度为 5时，提取量最高，随后随着氢氧化钠浓度的增大而降低。因此本试验中提取蛋白质的最佳氢氧化钠浓度是 5。3.2.2 碱液处理时间的测定结果将 10g 脱钙蟹壳于 100下以 5氢氧化钠溶液分别提取3、4、5、6、7h，实验结果见图 2，3456780.91.1.2.3提取量(g)时 间 (h)图 2 碱液处理时间对蛋白质提取量的影响由图 2 知，当氢氧化钠浓度与反应温度一定时，反应时间不同，蛋白质的提取量也不同，当反应时间为 4h 时，提取量最高，然后随时间的增加而减少。原因可能是由于时间过长时，蛋白质在碱的催化作用下水解程度增加。因此筛选反应时间为 4h。3.2.3 碱液处理温度测定结果取 10g 脱钙蟹壳以 5氢氧化钠溶液分别于 80、90、100、110、120下提取 4 h。结果见图 3。809010101201300.60.91.21.5蛋白提取量(g) 温 度 ( )图 3 碱液处理温度与蛋白提取量的关系由图 3 知，不同温度下蛋白质的提取量有显著差异，蛋白质的提取量在100时达到最大值，因此确定碱液处理温度为 100。3.3 单因素对脱乙酰的影响3.3.1 碱液浓度的测定结果把制好的甲壳素分别用 40、45、50、55、60%碱液在温度 140下反应4h，测得碱液浓度对脱乙酰度的影响，结果见图 4。40455056065726780284脱乙酰度(%) 碱 液 浓 度 (%)图 4 碱液浓度与脱乙酰度的关系如图 4，当碱液浓度在 55%时脱乙酰度最高，所以碱的最佳浓度为 55%。3.3.2 处理时间的测定结果用 55%碱液在 140的温度下，分别取 2、3、4、5、6h 来测定反应时间对脱乙酰度的影响，结果见图 5。234567758184脱乙酰度(%) 时 间 (h)图 5 处理时间对脱乙酰度的影响如图 5，在反应时间达 4h 后乙酰度基本保持不变，所以最佳处理时间应为4h。3.3.3 温度的测定结果用 55%的碱液在 110、120、130、140、150温度下反应 4h,测定温度对脱乙酰的影响，结果见图 6。 1012013014015016074678082脱乙酰度(%) 温 度 ( )图 6 温度对脱乙酰度的影响如图 6 ，当温度达到 140时，脱乙酰度基本不再增大，根据文献知浓碱脱乙酰基时温度对脱乙酰有较大影响，所以选择反应温度为 140。3.4 脱乙酰正交实验的测定结果脱乙酰正交实验结果，见表 5。表 5 脱乙酰正交实验结果因素序号A/% B/h C/脱乙酰度(%)1 1(50) 1(2) 1(120) 74.062 1 2(3) 2(130) 78.203 1 3(4) 3(140) 80.674 2(55) 1 2 78.395 2 2 3 81.676 2 3 1 75.917 3(60) 1 3 79.648 3 2 1 76.119 3 3 2 80.11K1 232.93 232.09