β乳球蛋白的中性蛋白酶水解作用研究

安 徽 农 业 大 学毕 业 论 文（设计）论文题目 -乳球蛋白的中性蛋白酶水解作用研究 姓 名 李 晋 津 学 号 08118027 院 系 茶与食品科技学院 专 业 食品质量与安全 指导教师 薛 秀 恒 职 称 讲师 中国合肥二一二年 六月安徽农业大学学士学位论文（设计）开题报告课题名称 中性蛋白酶水解 -乳球蛋白条件的研究 课题来源 安徽省自然科学基 金学生姓名 李 晋 津 专业 食品质量与安全 学号 08118027指导教师姓名 薛 秀 恒 职称 讲师研究内容实验拟以-乳球蛋白改性及降低- 乳球蛋白含量为目标，通过中性蛋白酶水解-乳球蛋白的水解条件的单因素实验及正交实验，确定出水解- 乳球蛋白的最佳酶解条件，并对其酶解产物进行电泳检测，检验酶解程度。研究计划第一阶段（2011/11/022011/12/02）查相关资料；第二阶段（2011/12/022012/01/20）准备试验材料做预备试验；第三阶段（2012/01/302012/03/07）做单因素和正交试验并取得相关数据；第四阶段（2012/04/102012/06/06） 整理分析数据并写论文。特色与创新运用 SAS 系统统计正交实验结果得出最佳酶解条件，通过 SDS-PAGE 蛋白电泳证明，-乳球蛋白被酶解为小肽。指导教师意见教研室意见学院意见主要领导签名：年 月 日目 录摘要 .1一、引言 .11.1 -乳球蛋白的结构与应用 .11.2 -乳球蛋白的致敏性及其水解改性 .2二、实验材料与方法 .42.1 实验材料 .42.2 试剂与仪器设备 .42.2.1 试剂 .42.2.2 主要仪器设备 .42.3 实验方法 .42.3.1 测定指标与方法 .42.4 试验方案的设计 .62.4.1 温度对 -乳球蛋白水解影响的检测方法 .62.4.2 时间对 -乳球蛋白水解影响的检测方法 .62.4.3 酶添加量对 -乳球蛋白水解影响的检测方法 .62.4.4 正交实验 .72.4.5 电泳实验 .7三、 结果与分析 .93.1 温度对氨基酸态氮含量的影响结果 .93.2 时间对氨基酸态氮含量的影响结果 .103.3 酶添加量对氨基酸态氮含量的影响结果 .103.4 正交实验结果 .113.5 电泳检测结果 .13四、讨论 .14五、结论 .15致谢 .17参考文献 .18Abstract .20-乳球蛋白的中性蛋白酶水解作用研究作者：李晋津 指导老师：薛秀恒（安徽农业大学茶与食品科技学院 合肥 230036）摘要：本实验以 -乳球蛋白为原料，通过单因素与正交实验，以甲醛滴定法测定蛋白水解后氨基酸态氮含量，确定中性蛋白酶水解 -乳球蛋白的最佳温度、时间、酶添加量，以实现 -乳球蛋白的改性及降解 -乳球蛋白。结果表明，中性蛋白酶水解 -乳球蛋白的最佳条件为 50水浴温度下， 0.0079g 中性蛋白酶水解 40分钟；SDS-PAGE 蛋白电泳显示， -乳球蛋白被酶解为小肽。关键词：中性蛋白酶；-乳球蛋白；酶解；小肽一、引言1.1 -乳球蛋白的结构与应用-乳球蛋白（-lactoglobulin，-Lg ）是由乳腺上皮细胞合成的特有蛋白，普遍存在于驯鹿、猪、马、羊、猫和狗等多种哺乳动物的乳汁中，但是在单峰驼和人乳中不存在或含量甚微 1。牛奶中的 -Lg 分子质量在 18 kD 左右，等电点为 5.3，共由 162 个氨基酸残基组成，含有 5 个半胱氨酸残基。-Lg 由非共价键连接的 2 个单位亚基组成，每个单体含有 2 个二硫键（Cys66-Cys160 和 Cys106-Cysl19）和一个自由巯基 （Cysl21） 。 -Lg 在牛奶中主要以二聚体的形式存在，二聚体像一个拉长的椭圆体，长约 6.95nm，宽约 3.6nm2。-Lg 具有紧密的三级结构，单体近似球形，它的三维结构在 pH 中性时，由 8 条反平行链组成 -桶状结构，有 1 个 +1 拓扑，此结构外部有 1 个含有 3 个转角的 a-螺旋和 9 条 链（A、B 、C 、 D、E、F 、 G、H、I） 1。A-D 链形成一个面，E-H 链形成另外一个面。A 链与其它 3 条链（B、H、I）氢键结合，A 链和 H 链之间的结合形成 -桶状结构的闭合，外面有 a-螺旋保护 -桶状结构 3。EF 链形成的结构作为结合位点的“大门” ，当 pH 较低时， “大门”关闭，结合位点受抑制；当 pH 较高时，“大门”开放，配体可以与结合位点结合。如图 1-1。图 1-1 -乳球蛋白的三维结构示意图研究表明，-乳球蛋白中心形成一个疏水性结构，- 乳球蛋白具有很强的结合脂溶性维生素及脂肪酸的能力，可以作为像 VA、V E 等脂溶性营养物质的添加载体，这可用于生产无脂或低脂且富含脂溶性维生素的营养食品。目前，-乳球蛋白的应用主要是在食品工业上，由于其具有多种生物学活性，同时经蛋白酶水解后仍可得到多种生物活性肽，因此被应用于食品加工中。-Lg的热变性与牛奶加工密切相关，可以利用在不同加热条件下，-Lg 含量的变化规律区分不同加工类型的牛奶。国际乳业联合会（IDF）规定巴氏杀菌乳和高温巴氏杀菌乳中可溶性 -Lg 的质量浓度应分别大于 2600mg/L 和 2000mg/L，UHT 乳中可溶性 -Lg 浓度应高于 50mg/L4。因此，-Lg 可以作为牛奶热加工程度的评价指标。在生奶样中添加 -乳球蛋白，不仅可以增加乳清蛋白的浓度，而且还能推迟 UHT 乳（瞬时超高温灭菌乳）的凝集时间。-Lg具有很强的脂肪酸结合力，一般作为功能性配料使用。由于-乳球蛋白对脂溶性维生素（如V A， VE等）有一定的吸附作用，可作为维生素的载体应用在食品加工中。目前，一些生产商已采用热诱导-乳球蛋白胶来模仿和替代脱脂食品中的动物脂肪 5，从而作为脂肪的替代品应用在低脂食品的加工生产中。此外，-Lg固有的生物活性，如抗氧化性，可以应用于化妆品生产。1.2 -乳球蛋白的致敏性及其水解改性随着对 -乳球蛋白的深入研究，发现它是婴儿牛乳过敏症的主要致敏原。据报道有 0.57.5的婴儿会发生对牛乳的过敏反应，如湿疹、腹泻等 6。这是由于新生儿的胃肠道通透性较强，可直接吸收 -乳球蛋白，从而引起婴儿的过敏反应 7。因此消除牛奶中主要致敏原 -乳球蛋白的致敏性仍是国际乳制品加工技术研究的热点之一。消除-乳球蛋白 致敏性的主要措施是将 -乳球蛋白过敏原进行降解 。目前，对- 乳球蛋白过敏原进行降解的方法有加热、加压、酶解、化学改性与发酵改性等，但对目的蛋白的直接酶解方法以其安全性高、工艺操作简便且便于控制等优点成为大多数研究者是首选的方法 8-10。 蛋白酶是以蛋白质一级序列结构中的某一肽键为切割位点的，具有专一性与靶向性，每一种蛋白酶在蛋白表面都以不同的肽键作为靶点，如果靶点存在于 -Lg 过敏原表位上，在蛋白酶对蛋白质进行水解的过程中，可以靶向地切割过敏原表位的肽键，产生氨基酸，消除致敏性 11。Linda 利用胰蛋白酶或用胰蛋白酶和胃蛋白酶共同作用水解 -乳球蛋白，发现水解后的 -乳球蛋白的过敏性降低，但不会完全消除 12。Bernard 用胰蛋白酶水解酪蛋白，发现其可以水解肽链第 152位，53139 位片段，用纤溶酶可以水解酪蛋白的第 106209 位片段这些多肽片段中包含有过敏性表位，经水解后可以使酪蛋白的过敏性降低 13。也有研究者对几种酶的 -Lg 酶解性能进行了筛选，结果表明菠萝蛋白酶与中性蛋白酶降低了-Lg 大部分的致敏性，胰凝乳蛋白酶对致敏性的消除效果较好 14-15。前 期 的 研 究 ，大 多 数 是 以 碱 性 蛋 白 酶 、 木 瓜 蛋 白 酶 、 枯 草 杆 菌 蛋 白 酶 、 胃 蛋 白 酶 、 胰 蛋 白 酶 等进 行 酶 解 ， 胃 蛋 白 酶 是 外 肽 酶 ， 优 先 选 择 苯 丙 氨 酸 或 酪 氨 酸 残 基 的 C 末 端 降 解 ，特 异 性 水 解 疏 水 链 端 N。 外 肽 酶 不 能 水 解 分 子 内 肽 键 ， 分 子 内 大 量 的 肽 键 得 以 保存 ， 从 而 不 能 有 效 提 高 水 解 度 。中 性 蛋 白 酶 是 内 肽 酶 ， 催 化 蛋 白 水 解 时 基 团 专 一 性 较 差 ， 主 要 催 化 由 疏 水 性氨 基 酸 的 羧 基 形 成 的 酰 胺 键 ， 水 解 蛋 白 质 分 子 内 部 的 肽 键 ， 生 成 相 对 分 子 量 较小 的 多 肽 。 但 目 前 对 中 性 蛋 白 酶 的 酶 解 作 用 研 究 甚 少 ， 其 最 佳 酶 解 条 件 不 甚 明 确 ，因 此 ， 本 实 验 以牛乳中主要致敏原 -乳球蛋白为研究对象，通过中性蛋白酶水解作用的因素研究，确定中性蛋白酶水解 -乳球蛋白的最佳酶解条件，增强中性蛋白酶在 -乳球蛋白 过敏原表位上的识别靶向性，提高中性蛋白酶对 -乳球蛋白的脱敏效果，降低 -乳球蛋白 的致敏性，这对提升乳制品的食用价值具有重要意义，为 -Lg 在乳品工业中的应用提供理论和实验依据。二、实验材料与方法2.1 实验材料-乳球蛋白标准品 sigma 公司生产中性蛋白酶（6000 活力单位/克） 北京索莱宝科技有限公司2.2 试剂与仪器设备2.2.1 试剂NaOH 分析纯邻苯二甲酸氢钾 分析纯95%乙醇 分析纯酚酞 分析纯甲醛溶液 分析纯丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺 Beijing solarbio science& technology 公司生产尿素（电泳级） biosharp 公司生产Tris Base 和 SDS Amresco 公司生产2.2.2 主要仪器设备核酸蛋白检测仪 Bibby Scientific LtdPHS-3D 型酸度计 金坛市盛蓝仪器制造有限公司SL202N 型电子天平 上海民桥精密科学仪器有限公司EL204 型分析天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司数显恒温水浴锅 江苏金坛市金城国胜实验仪器厂DYY-6C 型电泳仪 北京六一仪器厂2.3 实验方法2.3.1 测定指标与方法实验以游离氮含量为指标，用甲醛滴定法测定中性蛋白酶水解 -乳球蛋白后的氨基酸态氮含量，以分析水解效果。具体方法为：吸取酶解液 20mL 加入烧杯中，加 60mL 纯水搅匀。酸度计测 pH，以0.05mol/L NaOH 滴定至酸度计指示计为 8.2，记下消耗的 NaOH 溶液的体积。然后向其中加入 10.0mL 甲醛溶液，滴定至溶液 pH 为 9.2，记下消耗的NaOH 体积。同时以 80mL 纯水做空白实验。记下消耗的 NaOH 体积 V2。氨基酸态氮含量%= (公式 2-1) %102m.4c)(1V式中：V 1实验组在甲醛滴定终点（pH9.2）所消耗的 NaOH 标准溶液的体积；V2空白组在甲醛滴定终点（pH9.2）所消耗的 NaOH 标准溶液的体积；cNaOH 标准溶液的浓度，mol/L；m测定用样品溶液相当于样品的质量，g；0.014 N2 的毫摩尔质量， g/mmoL。1实验所需溶液配制：(1) -乳球蛋白溶液的配制：称取 50mg 的 -乳球蛋白标准样品，加纯水溶解后，定容至 50mL 容量瓶中，摇匀，制成 1mg/mL 的稀释液置 4冰箱中备用。(2) 0.05mol/L NaOH 溶液配制：准确称取 1.0g NaOH，用去 CO2 蒸馏水定容至 500mL 容量瓶中。盖紧胶塞，摇匀，置于广口瓶中备用。(3) 0.05mol/L NaOH 溶液的标定：称取 0.36g 邻苯二甲酸氢钾（105下烘干）于三角瓶中，倒入 50mL 去 CO2 水混匀。向其中加入 2 滴酚酞试剂。用上述所配的 0.05mol/L NaOH 溶液滴定至瓶内液体为粉红色， 30s 不褪色。记下消耗的NaOH 溶液的体积 V1。平行四组，结果如表 2-1。做空白实验，记下消耗 NaOH 溶液体积 V2。 计算公式：c(NaOH)= m100/(V 1-V2)M M=204.22 (公式 2-2）表 2-1 邻苯二甲酸氢钾质量 m 与消耗的 NaOH 体积 V1称取邻苯二甲酸氢钾的质量 m(g) 实验组消耗 NaOH 体积 V1(mL)0.3600 35.500.3603 35.400.3606 35.430.3608 35.45空白组消耗 NaOH 体积 V2=0.020mL将表 2-1 数据带入公式求得 c(NaOH)，取平均值，c(NaOH)=0.04982mol/L，说明上面所配 0.05mol/L NaOH 溶液符合要求。2.4 试验方案的设计首先，选定酶解反应的单因素条件，即温度、时间、酶添加量，根据查阅资料在中性蛋白酶最适反应温度上下选定 5 个水平条件，如表 2-2。表 2-2 酶解条件单因素实验水平因素序号 温度() 时间 (min) 酶添加量(g)1 30 30 0.0022 40 60 0.0043 45 90 0.0064 50 120 0.0085 55 150 0.0102.4.1 温度对 -乳球蛋白水解影响的检测方法分别称取 0.006g 中性蛋白酶加入 2mL 配制的 -乳球蛋白样液于 5 个试管中，标号 1、2、3、4、5，调节水浴温度 30、40 、 45、50 、55，水浴30min，然后沸水浴 10min。冷却后将其定容至 100mL，摇匀静置。吸取 20mL 于烧杯中，加入 60mL 纯水搅匀。后按 2.3.1.1 甲醛滴定法操作，记下 pH9.2 时消耗的 NaOH 的体积 V1 。2.4.2 时间对 -乳球蛋白水解影响的检测方法分别称取 0.006g 中性蛋白酶加入 2mL 配制的 -乳球蛋白样液于 5 个试管中，分别标号 1、2、3、4、5，调节水浴温度为 45，分别水浴30min、60min、90min、120min、150min，然后沸水浴 10min。冷却后将其定容至 100mL，摇匀静置。吸取 20mL 于烧杯中，加入 60mL 纯水。后按 2.3.1.1 甲醛滴定法操作，记下 pH9.2 时消耗的 NaOH 的体积 V1 。2.4.3 酶添加量对 -乳球蛋白水解影响的检测方法分别称取 0.002g、0.004g、0.006g、0.008g、0.010g 中性蛋白酶，加入 2mL配制的 -乳球蛋白样液于 5 个试管中，分别标号 1、2、3、4、5，45条件下水浴 30min，然后沸水浴 10min。冷却后将其定容至 100mL，摇匀静置。吸取 20mL 于烧杯中，加入 60mL 纯水。后按 2.3.1.1 甲醛滴定法操作，记下 pH9.2 时消耗的 NaOH 的体积 V1。2.4.4 正交实验在上述单因素水平实验基础上，取水解