第3章 微生物资源的分离和保存（3节）

资源微生物学Resource Microbiology(第三章 )主讲人：周而勋博士、教授、博导（资环学院植物病理学系）电话 ： 38297832 (办 ),-mail: /zyhjxy/wygkcn_ShowArticle.asp?EC_ArticleID=850 或 /view/3121519.htm 1第三章 微生物资源的分离和保存 第一节 分离资源微生物的基本原则 第二节 各类微生物的分离程序 第三节 资源微生物的保存2第一节 分离资源微生物的基本原则 一、选择试验样品的原则 二、样品采集 三、预处理 四、培养成分的设计原则 五、抑制剂 六、关于混合菌3一、选择试验样品的原则 1、温度、酸碱度等环境因素 （ 1）温度 一些特殊用途的酶，要求能耐高温或低温。 现已发现，有的微生物能在 80 以上生长，最高的可达 140 。如工业上广泛应用的 -淀粉酶， PCR广泛应用的 Taq酶，就是从高温菌开发出来的。 也有的微生物能在极端低温环境下生长，如寒冷地带或冷冻库中。洗涤剂工业需要的 “低温酶 ”就可从这些微生物中开发。4 （ 2）酸碱度 如果需要筛选酸性酶、碱性酶，就可分别从酸性或碱性环境分离有关的微生物。 总之，在极端环境下（如极端高温、低温、极端酸碱度、高盐、高辐射、低氧）下生存的微生物必然有特殊的代谢类型，也必然产生特殊的产物。这是不可忽视的微生物资源。5 2、天然基质 （ 1）腐生菌 自然界中的大多数微生物靠分解纤维素、木质素、几丁质、角蛋白进行生活，这为我们分离相应酶的产生菌提供了可能性。 （ 2）寄生菌或内生菌 有些寄生菌可引起植物病害，但其代谢物有很好的利用价值。 如引起 水稻恶苗病（徒长病） 的真菌可产生赤霉素 （商品名 “920”） ，是一种植物生长调节剂，能促进植物生长，已开发利用。6赤霉素 （ “920”）7 有些内生菌可产生与寄主相同的活性代谢物。如前面谈到， 红豆杉（紫杉） 的 内生真菌 安德紫杉菌 Taxomyces andreanae ，可产生与从 红豆杉（紫杉） 提取的相同的抗癌药物 紫杉醇 。8 （ 3）共生菌 最常见的共生菌有细菌中的 根瘤菌 、放线菌中的 弗兰克氏菌 和真菌中的 菌根菌 。它们是非常宝贵的微生物肥料资源，有很好的开发潜力。 （ 4）化能自养菌 为了利用微生物来回收金属，就要从硫磺矿、硫铁矿等天然环境中采集样品，才能够找到所需的菌种。9 3、综合因素 资源开发的目标常常不是单一因素，而是许多因素的综合。 如要开发高温脂肪酶，就要到高温地区的长期炼油或长期贮油的地方取样。 又如：要开发高温纤维素酶，就要到堆沤肥的地方取样。 总之，根据不同的开发目的，综合考虑各种环境条件，找到符合要求的菌种。10二、样品采集 1、土壤采集 可采集农田、林地、草地的表层或耕作层(10-40cm)土壤。 分离细菌，土样要保持湿润；分离放线菌和真菌，土样可适当风干。 2、湖泥、海泥采集 采集湖底、海底泥可采用采泥器或重锤式取样器采集。 样品装于无菌瓶中，尽可能在短时间内用于试验。11 3、水样采集 根据不同的开发目的，选择不同的水体进行采样。 水体包括江、河、湖泊、海洋、污沟以及温泉等。 不同的水体含有不同类型的微生物。 温泉水中存在的微生物数量少，有必要进行适当的浓缩。方法：用 0.5m 滤膜过滤温泉水，滤膜上微生物的浓度大大增加。12 4、昆虫样品采集 在菜园、果园、茶园、林场、草地等场所采集病死的昆虫，最好是长出 霉状物的死虫。13 5、植物样品采集 对于根瘤菌，采集根部。 对于内生菌，可采集根、茎、叶、花、果实等各部位。 对于药用植物（中草药），通常采集药用部分。大豆根瘤14三、预处理 1、富集培养 向样品中加入一定数量或浓度的化学物质，如纤维素、角蛋白、几丁质、果胶、维生素、氨基酸、硫磺等，混匀后，适当培养，以增加目的菌的数量。 2、高温处理 为了分离一些高温菌或芽孢杆菌，对样品进行适当的高温处理，可大大减少其它微生物的数量，而增加目的菌的分离率。15四、培养基成分的设计原则 1、开发意图放在分离过程中 如果要分离某一特定的目的菌，可使用特定的底物（碳、氮源）和培养条件，以便只分离到目的菌，而其它菌不生长。 例如，要开发 低温碱性脂肪酶 的产生菌，就要满足 3个条件：使用 脂肪 作为唯一碳源， pH调到 10以上，在 低温 下培养。16 2、大剂量加入同类化合物 为了分离产生某类物质的微生物，可在分离培养基中大剂量加入该类物质，有可能使抗这类物质且产生这类物质的菌种生长起来，而不抗这类物的菌种无法生长。 例如： 酿酒酵母 必须对酒精有抗性。所以，在培养基中可加入高浓度的酒精。 因为，某种生物活性物质的产生菌，其基因组都是由某种物质的结构基因、调控基因和 抗性基因 组成的。17 3、特殊成分 除了与开发目的有关的成分外，为了使目的菌生长，有时需在培养基中加入一些特殊成分，如维生素、氨基酸、无机盐等。 例如：为了分离硅酸盐细菌，需在培养基中加入长石或硅藻土，而不必加入氮源。 4、混合基质 如果要分离混合菌，所需的培养基无疑应该使用混合基质。 例如：要分离加速垃圾分解的混合菌，就要向培养基中加入纤维素、几丁质等物质。18五、抑制剂 1、分离细菌 使用 放线菌酮 和 制霉菌素 ，可抑制真菌的生长，提高细菌的分离率。 2、分离放线菌 使用 重铬酸钾 ，可抑制细菌和真菌的生长，而几乎不抑制放线菌的生长。 3、分离真菌 使用 青霉素 和 链霉素 ，可抑制细菌的生长。19六、关于混合菌 分离的本意是得到单一菌种的纯培养。但是在一些情况下，分离资源微生物不一定需要纯培养。 例如：分解作物秸杆的菌种就是一类混合菌种。秸杆的主要成分是纤维素、半纤维素、木质素、果胶质等物质，单一的微生物菌种不可能同时具备分解上述各种物质所需要的全部酶。在这种情况下，采用混合菌种的效果就要好得多。（第三章第一节结束） 20第二节 各类微生物的分离程序 一、放线菌 二、细菌 三、真菌21一、放线菌 总要求 ：尽可能让样品中的放线菌都长出来，而其它微生物（细菌、真菌）又尽可能都不长。为了达到这个目的，可从以下几方面来考虑： 1、设计多种不同的培养基 如：不同营养成分、不同 pH值、添加不同抑制剂及其它特殊物质 (如维生素、激素 )等。 2、采用不同的培养条件 如不同的培养温度、不同的培养时间等。22 3、对样品进行预处理 目的：减少真菌和细菌的数量，增加放线菌的分离频率。 方法： （ 1）土样自然风干 5-30天。 （ 2）风干土样在 120 干热处理 1h。 （ 3）综合处理。如：用 0.05%的 SDS加 1%的腐植酸或 6%的酵母膏， 40振荡培养 20 min。23 4、放线菌常用培养基 高氏 1号琼脂培养基： 可溶性淀粉 20.0g； K2HPO4 0.5g； MgSO47H2O 0.5g； NaCl 0.5g； FeSO4 10.0mg； 琼脂 20.0g； 加水至 1000.0ml； pH 7.2。24二、细菌 除了 第一节 叙述的普遍性原则外，分离资源细菌还应注意以下几点： 1、培养基成分 成分以肉汁（膏）和蛋白胨为主。 2、 pH值 以中性偏碱（ pH7.0-7.2）为佳。 3、抑制剂 可使用 50-100g/ml的放线菌酮或制霉菌素抑制放线菌和真菌的生长。25 4、细菌常用培养基 肉汁胨琼脂培养基： 牛肉浸膏 3.0g； 蛋白胨 5.0g； NaCl 5.0g； 琼脂 20.0g； 加水至 1000.0ml； pH 7.0-7.2。26三、真菌 分离一般真菌并不困难。分离资源真菌应注意的问题是： 1、以马丁 (Martin)和查彼克 (Czapek)琼脂为基本培养基。 2、 pH值以酸性为好 一般 pH为 5.0左右。 3、及时纯化单菌落 真菌扩展很快，务必及时挑取单菌落纯化，以免菌落间互相污染。27 4、真菌常用培养基 （ 1）马丁 (Martin) 琼脂培养基 葡萄糖 10.0g； 蛋白胨 5.0g； KH2PO4 1.0g； MgSO47H2O 0.5g； 琼脂 20.0g； 1%孟加拉红 3.0ml； 1%链霉素 3.0ml； 加水至 1000.0ml； 不调 pH。28 （ 2）查彼克 (Czape