第4章人工染色体载体

西南大学生物技术专业 基因工程 1第四章 人工染色体载体第一节 粘粒载体第二节 酵母人工染色体载体第三节 细菌人工染色体载体第四节 P1噬菌体载体和 P1人工染色体载体本课件是在网络资源基础上改进而成，在此对有关人士特致感谢！西南大学生物技术专业 基因工程 2常规载体在工作时都是在不影响质粒或噬菌体复制功能的基础上装载外源 DNA片段的，同时保持质粒或噬菌体的基本特性。这样一来，这些载体所装载的容量就受到限制。利用染色体的复制元件来驱动外源 DNA片段的载体称为人工染色体载体 ，其装载外源 DNA片段的容量可以与染色体的大小媲美。西南大学生物技术专业 基因工程 3第一节 粘粒载体一、粘粒的结构特征和用途粘粒实际是质粒的衍生物，是带有 cos序列的质粒。 cos序列是 l噬菌体 DNA中将 DNA包装到噬菌体颗粒中所需的 DNA序列。粘粒的组成包括 质粒复制起点 、 抗性标记 、 cos位点 ，因而能像质粒一样转化和增殖。它的大小一般 5-7kb左右，用来克隆大片段 DNA，克隆的最大 DNA片段可达 45kb。有的粘粒载体含有两个 cos位点，在某种程度上可提高使用效率。西南大学生物技术专业 基因工程 4二、粘粒载体的工作原理粘粒载体的主要工作原理类似 l噬菌体载体 。在外源片段与载体连接时，粘粒载体相当于 l噬菌体载体的左右臂， cos位点通过粘段退火后，再于外源片段相间连接成多联体。当多联体与 l噬菌体包装的蛋白质混合时l噬菌体 A基因蛋白的末端酶功能将切割成两个 cos位点，并将两个同方 cos位点之间的片段包装到 l噬菌体颗粒中去。允许插入片段为 30-45kb。西南大学生物技术专业 基因工程 5 三、粘粒克隆载体 粘粒 pJB8、含双 cos位点的粘粒载体、 pcos1 EMBL等。 四、粘粒载体文库的扩增和贮存 噬菌体颗粒状的粘粒文库在含有几滴氯仿的 SM溶液中可以保存几周。 可以采用影印到硝酸纤维素膜上保存、挑取所有菌落混合培养后深冷保存，等。 五、粘粒载体文库的常见问题 载体分子自连，重组率降低 多个外源片段串联进入载体中 原料 DNA片段短于 200kb时，制备的目的 DNA中相当一部分的末端的一端不带酶切位点 总 DNA纯度影响目的 DNA的制备 空载体现象 不同重组子的拷贝数不同 文库的代表性不足，缺泛一些目标基因。西南大学生物技术专业 基因工程 6西南大学生物技术专业 基因工程 7第二节 酵母人工染色体载体 酵母人工染色体载体 （ yeast artificial chromosome， YAC）：就是模拟酵母菌染色体的复制而构建的载体。西南大学生物技术专业 基因工程 8一、 YAC载体的复制元件YAC载体的复制元件是其核心组成成分，骑在酵母中复制的必须元件包括 复制起点序列 即自主复制序列、用于有丝分裂和减数分裂功能的 着丝粒 和 两个端粒 。这些元件能够满足自主复制、染色体在子代细胞间的分离及保持染色体稳定的需要。西南大学生物技术专业 基因工程 9端粒重复序列： 是定位于染色体末端的一段序列，用于保护线状 DNA不被胞内的核酸酶降解，已形成稳定的结构。着丝粒： 是有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点，使染色体在分裂过程中能正确分配到子细胞中。在 YAC中起到保证一个细胞内只有一个人工染色体的作用。西南大学生物技术专业 基因工程 10二、 YAC载体的工作原理YAC载体主要是用来构建 大片段 DNA文库 ，特别是用来构建高等真核生物的基因组文库，并不用作常规的基因克隆。图示是 pYAC4载体的遗传结构图，当用 BamH 切割成现状后，就形成了一个微型酵母染色体，包含染色体复制的必要 順式元件 。这些元件在酵母菌中可以驱动染色体的复制和分配，从而决定着个微型染色体可以携带酵母染色体大小的 DNA片段。允许插入片段大小：没有限制，一般为 250-400kb。西南大学生物技术专业 基因工程 11YAC载体的原理性工作流程：西南大学生物技术专业 基因工程 12对于 BamH 切割后形成的微型酵母染色体，当用 EcoR或 Sma 切割抑制基因 sup4内部的位点后形成染色体的两条臂，与外源大片段 DNA在该切点相连就形成一个大型人工酵母染色体，转化到酵母菌后可像染色体一样复制，并随细胞分裂分配到子细胞中去，达到克隆大片段 DNA的目的外源 DNA片段的装载导致抑制基因 sup4插入失活，从而使重组菌形成红色菌落；而载体自身连接转入到酵母细胞后所形成的菌落为白色。YAC的缺点：插入片段容易出现缺失和重排现象， YAC与酵母染色体大小相似不容易分离和纯化。YAC的优点：酵母细胞比大肠杆菌对不稳定的、重复的和极端的 DNA片段有更强的容忍性，文库的代表性强，适合作真核染色体片段功能研究。西南大学生物技术专业 基因工程 13第三节 细菌人工染色体载体细菌人工染色体载体 （ bacterial artificial chromosome， BAC） ： 就是基于大肠杆菌的 F质粒 构建的高容量低拷贝质粒载体。F质粒 ：是一个约 100kb的质粒，编码 60多种参与复制、分配和结合过程的蛋白质。西南大学生物技术专业 基因工程 14一、 BAC载体及其结构组成BAC载体大小约 7.5kb，其本质是一个质粒克隆载体。 BAC载体与常见克隆载体的核心区别在于其 复制单元 的特殊性 。复制单元 来自 F质粒，包括严谨型控制的复制区 oriS、启动 DNA复制的由 ATP驱动的解旋酶（ RepE），以及 3个确保低拷贝并使质粒精确分配至子代细胞的基因座（ parA、 parB、 parC）。西南大学生物技术专业 基因工程 15西南大学生物技术专业 基因工程 16二、 BAC载体工作原理BAC载体的工作原理与常规的质粒克隆载体相似。不同的是， BAC载体装载的是大片段DNA， 一般在 100 300kb。对如此大的 DNA片段一般要通过脉冲场凝胶电泳来分离。另外，由于 BAC载体的拷贝数小，制备难度大。为解决这个问题，有的学者将 BAC载体作为外源片段克隆到常规高拷贝质粒载体上，从而在大肠杆菌中以多拷贝的形式复制，便于载体的制备，使用时将高拷贝质粒去掉。西南大学生物技术专业 基因工程 17第四节 P1噬菌体载体和 P1工人染色体载体一、 P1噬菌体的分子特征 ：双链线状 DNA， 110kb，末端具有 10kb左右冗余序列，感染进入大肠杆菌后冗余序列发生重组，形成环状分子， c 决定进入溶原或裂解状态。包装方式与 不同。二、 P1噬菌体载体元件 ：复制元件、