生化实验 绪论及蛋白质沉淀变性反应（1）课件

生物化学实验 张志红 ,付永贵 张志红 TELE-mail: 付永贵 TEL:E-mail: 主要内容 绪论 实验室一般规则及实验室安全 实验报告的撰写及实验成绩的评定 本学期实验内容及安排 实验一 蛋白质沉淀、变性反应 3 生物化学实验室规则（ 1） 1、遵守纪律，不得无故迟到、早退、大声谈笑。 2、预习，熟悉实验目的、原理、步骤。 3、严格听从教师的指导，及时记录实验原始数据。 4、实验场所整洁、公用试剂用后放回原位，实验完毕，清洗 实验器皿、收拾台面，方可离开。 5、注意节约试剂，防止损坏仪器。使用贵重仪器时，严格遵 守操作规程，发现故障，立即报告教师，不得擅自检修。 4 生物化学实验室规则（ 2） 6、 乙醇、丙酮、乙醚等易燃品不能直接加热，远离火源操作及 放置。 7、所有废液、废弃物等，均收集在指定容器内，不得倒在水 槽内或到处乱仍。强酸和强碱不能直接倒在水槽中，应先稀 释，然后倒入水槽，再用大量自来水冲洗水槽及下水道。 8、室内严禁吸烟！煤气、水管用完即关。 Long hair should be tied back to avoid burns. In addition, avoid wearing loose articles of clothing such as ties or dangling jewelry that may come into contact with laboratory surfaces. 5 实验室安全 -安全用电 使用电学仪器时，要注意电压、电流是否符合仪器的要求， 必要时需使用稳压设备。 严格按照电器使用规程操作，不能随意拆卸，摆弄电器。 严防触电。绝不可用湿手或眼睛旁视时开电闸和电器开关。 检查电器设备是否漏电时，应使用试电笔。凡是漏电仪器一 律不能使用。 6 实验室安全 -防止火灾 起火的原因：有电流短路，不安全地使用电炉、煤气灯 和易燃易爆药物着火。 实验必须配备一定数量的消防器材，请按消防规定保管 使用，最重要的是每个实验者都应有实验室安全观念， 时刻保持警惕。 7 实验室内严禁贮存大量的易燃物 (如乙醚、丙酮、乙醇， 苯等 )。 必须存放的少量即将使用的易燃物，也应将它放在远离 火源处，火焰熄灭后才可大量倾倒这些液体。 低沸点的有机溶剂不准在火焰上直接加热，只能利用带 回流冷凝管的装置在水浴上加热或蒸馏 。 实验室安全 -防止火灾 8 实验室安全 - 防止火灾 2008.03.13 东南大学 2007.03.28 兰州理工大学 9 名称 沸点 / 闪点 / 自燃点 / 乙醚 34.5 40 180 丙酮 56 17 538 二硫化碳 46 30 100 苯 80 11 乙醇 78 12 400 闪点：液体表面的蒸汽和空气的混合物在遇明火或火花时着火的最低温度。 自燃点：液体蒸汽在空气中自燃时的温度。 常见有机溶剂的易燃性 不能放冰箱中储存！不能在火源附近储存、操作！ 10 易燃物蒸汽在空气中的爆炸极限 名称 爆炸极限 (体积百分数 ) 乙醚 1.9 36.5 丙酮 2.6 13 乙醇 3.3 19 氢气 4.1 74.2 甲醇 6.7 36.5 乙炔 3 82 实验室内严禁贮存大量的易燃物！ 11 实验室安全 -严防中毒 化学试剂有相对无毒、中度毒性和剧毒之分，在处理剧毒 药物时要特别谨慎、小心。国际上常用某些标志标示不同 毒型的化学药品。 使用毒性物质和致癌物必须根据试剂瓶上标签说明严格操 作，安全称量、转移和保管。操作戴手套，必要时戴口罩 或防毒面具，并在通风橱中进行。沾过毒性、致癌物的容 器应单独清洗 、处理。 12 实验室安全 -严防中毒 水银温度计、气量计等汞金属设备破损时 必须立即采取措施回收汞，并在污染处撒 上一层硫磺粉以防汞蒸气中毒， 注意室内 通风 。 * 13 警告标志 有辐射性 安全布告 生物危险品 * 14 高度可燃的 爆炸性的 危险化学药品标志 有毒的 腐蚀性的刺激性有害的 有氧化作用的 * 15 氯化钠 优级纯 化学药品的质量标签 * 16 氯化钠 分析纯 化学药品的质量标签 * 17 氯化钠 化学纯 化学药品的质量标签 18 实验室安全 -避免烧伤和创伤 使用玻璃、金属器材时注意防止割伤及机械创伤。 如发生意外，找实验室工作人员 (少量急用药物备 用 )。 浓酸、浓碱腐蚀性很强，必须极为小心地操作。用 吸量管量取这些试剂 (包括有毒物 )时，必须使用橡 皮球，绝对不能用口吸取。 19 实验室安全 -预防生物危害 微生物、动物的组织、细胞培养物、血液和分泌物 都可能存在细菌和病毒感染的潜在危害，处理生物材 料必需小心谨慎，做完实验必须用肥皂、洗涤剂或消 毒液洗手。 被污染的物品，必须进行高压消毒或烧成灰烬。 被污染的玻璃用具应在清洗和高压消毒前立即浸泡在 适当的消毒液中。 20 实验室急救 1 机械损伤：立即止血，到医院诊治。 强碱：先用大量自来水冲洗，再用 5%硼酸溶液或 2%乙酸溶液涂洗。 强酸：大量自来水冲洗，再以 5%碳酸氢钠溶液洗涤。 酚： 用酒精洗涤。 煤气中毒：立即到室外，严重者就医。 21 实验室急救 2 玻璃割伤：检查伤口内有无玻璃碎片，硼酸水洗净， 涂擦碘酒或红汞水，必要时用纱布包扎。 烫伤：浓酒精消毒，涂上苦味酸软膏。 触电：关闭电源 用干木棍使电线与被害者分开。 着火 ： 汽油、乙醚等有机溶剂：石棉布、沙土 电线：切断电源或用四氯化碳灭火器 衣服：勿奔走，湿衣包裹或躺地滚动 。 22 实验报告的撰写 实验报告分为以下几部分： 原理 实验步骤 结果与讨论 问答 实验成绩的评定： 实验报告 平时操作、表现 姓名，班级，学号， 课室，实验时间、 实验教师 实验内容及安排 ( 72学时 ) 1、 绪论、蛋白质沉淀、变性反应 9月 26-27 2、 蛋白 质 浓度测定 考马斯亮蓝法 10月 10-11 3、 阳离子交换树脂层析分离氨基酸 10月 17-18 4、 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 10月 24-25 5、 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白 10月 31-11月 1 6、 影响酶促反应速度因素 最适 pH、 激活剂 （ 抑制剂 ） 11月 7-8 7、 脂肪酶活性的测定 11月 14-15 8、过氧化氢酶米氏常数测定 11月 21-22 实验内容及安排 （续） 9、 糖的定量测定 11月 28-29 10、 维生素 C的定量测定 12月 5-6 11、 脂肪酸 B氧化作用 12月 12-13 12、转氨基作用 12月 19-20 13、 鱼类 DNA的提取 12月 26-27 14、 核酸浓度测定 UV吸收法 1月 2-3 15、 聚合酶链式反应（ PCR） 1月 2-3 16、 DNA的琼脂糖凝胶电泳 1月 9-10 一、实验目的 1、了解蛋白质的一些理化性质，认识蛋白质的 可逆反应和不可逆反应。 2、 了解蛋白质的沉淀反应、变性作用和凝固作用的 原理及它们的相互关系。 实验一 蛋白质沉淀、变性反应 蛋白质 是由 氨基酸组成的大分子化合物 , 其 分子量颇大，介于一 万到百万之间 ，是一种 亲水胶体 。 蛋白质 分子 表面 的 亲水基团 （ -OH,-COOH,-NH3,以及肽键）等，在 水溶液中能与水分子起水化作用（ Hydration），使蛋白质分子表面形 成一个 水化层 。每克蛋白质分子能结合 0.3-0.5克水。 蛋白质分子表面上的可解离基团，在适当的 PH条件下，都带有相同 的净电荷，与其周围的反离子构成稳定的 双电层 。 二、实验原理 由于蛋白质溶液具有 水化层和双电层 两方面的稳定因素，所以胶体 系统是相当稳定的。 在一定物理化学因素 (如盐析、重金属离子、有机酸、无机酸和加热 )影响下 ,蛋白质颗粒失去电荷，脱水，甚至变性，以固态形式从溶液中 析出，这个过程称为蛋白质的沉淀反应。这种反应可分为两种类型： 1、可逆沉淀反应：蛋白质分子内部结构并未发生显著变化，基本保持 原有的性质，沉淀因素除去后，能溶于原来的溶剂中 。 2、不可逆沉淀反应：蛋白质分子内部结构、空间构象遭到破坏， 失去原来的天然性质。 蛋白质溶液的沉淀稳定是相对的，有条件的 。 如果条件发生改变，破坏了蛋白质溶液的稳 定性，蛋白质就会从溶液中沉淀出来 。 蛋白质分子表面 水化层 双电层 稳定的亲水胶 脱水，失去电荷 沉淀反应 可逆沉淀反应 （不变性沉淀反应） 如：盐析作用 不可逆沉淀反应 （变性沉淀反应） 如：重金属盐沉淀作用 蛋白质沉淀变性的常见方法 常用方法 原理 常用试剂 实用 盐析 破坏蛋白质胶体溶液的水化层和电荷 层 (NH4)2S04、 Na2S04、 Na3P04、 NaCl、 MgS04 常用此法来分离和纯化蛋白质。 有机试剂盐 析 脱水作用；降低水的介电常数和蛋白 质溶解度；蛋白质析出 乙醇、丙酮、甲醇 低温乙醇提取血液中的蛋白质组 分 强酸、强碱 沉淀 破坏蛋白质分子结构发生蛋白质变性 盐酸 , 硫酸 , 硝酸、氢氧 化钠 灭活病毒 加热 变性 鸡蛋、肉类等加工 重金属盐沉 淀 变性；生成不溶性盐 Ag+， Hg2+， Cu2+和 Pb2+ 临床上常用蛋清或牛乳解救误服 重金属盐的病人 有机酸沉淀 生成不溶性盐 苦味酸、鞣酸、三氯醋酸 、磺基水杨酸等生物碱试 剂 沉淀蛋白滤液等 三、实验材料及设备 蛋白质溶液： 取 10ml鲜鸡蛋清，用蒸馏水稀释至 100ml ，搅拌后用 4-8层纱布过滤，新鲜配制。 蛋白质氯化钠溶液： 取 20ml蛋清，加蒸馏水 200ml和饱 和氯化钠溶液 l00ml，充分搅匀后用 4-8层纱布滤去不溶 物（加氯化钠的目的是溶解球蛋白）。 1. 材料 2. 试剂 3%硝酸银， 0.5%乙酸铅， 10%三氯乙酸溶液，饱和硫酸铵溶液， 10%氢氧化钠溶液，浓盐酸，浓硫酸，浓硝酸， 5%磺基水杨酸 ， 0.1%硫酸铜，饱和硫酸铜溶液， 0.1%乙酸， 10%乙酸，饱和 氯化钠溶液，硫酸铵粉。 3. 器材 水浴锅 ,漏斗 ,滤纸 ,吸管 ,试管及试管架 ,量筒等。 四、实验内容 1. 蛋白质的可逆反应 蛋白质的盐析 步骤 现象 解释结论 取一支试管，加入 3mL蛋白质氯 化钠溶液和等量的 饱和硫酸铵溶 液 ，混匀，静置 10分钟 观察有无蛋白质（ 球蛋白）的沉淀 过滤后，向滤液中加入 硫酸铵粉 末，边加边用玻璃棒搅拌 ，直至 粉末不再溶解，直至饱和 观察有无沉淀（清 蛋白）析出 静置，弃去上清液，取出部分清 蛋白，加少量蒸馏水 观察沉淀的再溶解 操作 现象 操作 现象 Tube 1 1mL蛋白质溶液 3-4滴 3%硝酸银 溶液 过量 的硝酸 银 Tube 2 1mL蛋白质溶液 1-3滴 0.5%乙酸铅 过量 的乙酸 铅 Tube 3 1mL蛋白质溶液 3-4滴 0.1%硫酸铜 过量 的硫酸 铜 2. 蛋白质的不可逆反应 2.1. 重金属离子沉淀蛋白质（ 3支试管 ） 操作 现象 Tube 1 0.5mL蛋白质溶液 数滴 10%三氯乙酸溶液 Tube 2 0.5mL蛋白质溶液 数滴 5%磺基水杨酸 2. 蛋白质的不可逆反应 2.2 有机酸沉淀蛋白质（ 2支试管） 操作 现象 操作 现象 Tube 1 15滴 浓盐酸 沿管壁加入 6滴蛋白质溶液， 勿摇 振荡 Tube 2 15滴 浓硫酸 沿管壁加入 6滴蛋白质溶液， 勿摇 振荡 Tube 3 15滴 浓硝酸 沿管壁加入 6滴蛋白质溶液， 勿摇 振荡 2. 蛋白质的不可逆反应 2.3 无机酸沉淀蛋白质 （ 3支试管） 2. 蛋白质的不可逆反应 2.4 加热沉淀蛋白质 试剂 管号 蛋白质溶液 0.1%乙酸 10%乙酸 饱和 NaCl 10%NaOH 纯净水 1 2 3 4 5 10 10 10 10 10 - 5 - - - - - 5 5 - - - - 2 - - - - - 2 7 2 2 - 5 取试管 5支按下表添加试剂和操作（ 单位：滴 ） 操作步骤 编号 混匀 沸水浴中加热 10 分钟 中和 过量的酸 或 碱 1 Pro.+d.H2O 2 Pro.+ 0.1%乙酸 +d.H2O 3 Pro.+ 10%乙酸 +d.H2O 4 Pro.+10%乙酸 +饱和 NaCl 5 Pro.+10% NaOH+ d.H2O 2.4 加热沉淀蛋白质的总结 卵清蛋白的 PI(等