需氧革兰阳性杆菌及检验

需氧革兰阳性杆菌及 检 验 华中科技大学同济医学院附属协和医院 熊 艳 革兰阳性杆菌菌属间的鉴别 棒状杆 菌属 芽胞杆 菌属 李斯特 菌属 丹毒丝 菌属 加特纳 菌属 形 态 棒状 杆菌有 芽胞 短杆、 链或丝 状 细杆或 丝状 杆菌、 多形性 触 酶 + + + - - 动 力 - V + - - 对 氧 需氧， 兼性厌 氧 需氧， 兼性厌 氧 兼性厌 氧 兼性厌 氧 兼性厌 氧 V： 炭疽芽胞杆菌阴性，其它芽胞杆菌阳性。 第一节 棒状杆菌属 棒状杆菌属的共同特征 l革兰阳性多形态杆菌 l无荚膜、无鞭毛、无芽胞 l细菌呈不规则栅栏状排列 l需氧或兼性厌氧 l触酶试验阳性 l细胞壁结构和血清学分析，证实与分枝 杆菌属、奴卡氏菌属有共同的成分。 一 白喉棒状杆菌 （一）生物学特性 l形态与染色 l培养特性 l菌落特征 l生化反应 l抗原构造 l抵抗力 形态与染色 细长弯曲、一端或两端膨大的革兰阳性杆 菌。无荚膜、无芽胞、无鞭毛、无菌毛。细菌排 列呈散在 L、 V、 Y字形及不规则栅栏状。 用美蓝、 Neisser法、 Albert法等染色 时，在细菌的一端或两端有浓染的颗粒，此颗 粒与菌体着色不同，称为 异染颗粒 ，为本菌重 要形态学特征，对鉴别细菌有重要意义。 2018/8/26 培养特性 v 需氧或兼性厌氧，生长温度为 1540 ，最 适生长温度为 3537 ， pH7.27.8。 v 营养要求高， 在普通培养基上虽能生长， 但生长不良，形态不典型，大多需要特殊氨基 酸。在加有血液、血清或鸡蛋的培养基上生长 迅速，形态典型，异染颗粒明显。 2018/8/26 菌落特征 l血平板：灰白、狭窄 溶血环。 l鸡蛋斜面和血清斜面：生长迅速，灰白色有光 泽菌落。 l亚碲酸钾血平板：为选择培养基，菌落呈黑色 。菌落分为重型、轻型或中间型。 生化反应 触酶（ +），氧化酶（ -） 能分解葡萄糖、麦芽糖、 果糖等 ，产酸不产气 。 不分解乳糖 、多数不分解蔗糖 。 靛基质试验、明胶液化、尿素分解 2018/8/26 抗原构造 l菌体 O抗原：与分枝杆菌、奴卡菌有共同抗原。 lK抗原：型特异性抗原，不耐热。 抵抗力 l对湿热和一般消毒剂敏感。 l对冷和干燥有一定抵抗力 。 （二）致病性 l致病物质：白喉外毒素 l由携带 - 棒状杆菌噬菌体的白喉杆菌产生。 l作用机制：抑制细胞内蛋白质的合成。 l经呼吸道飞沫传播，引起白喉。 l假膜脱落阻塞呼吸道是白喉早期死亡的主要原因 。 l中毒性心肌炎是白喉晚期死亡的主要原因。 （三）免疫性 l抗白喉免疫主要依靠白喉抗毒素的中和作用。 l成人绝大多数具有免疫性，主要由于隐性感染 所获得的免疫力。 l锡克试验用于检测机体有无白喉抗毒素抗体存 在。 （四）微生物学检验 l标本采集 l检验程序 l检验方法 l生化反应 l毒力试验 标本采集 l用无菌长棉拭子，从疑为假膜的边缘 采集分泌物。 l未见假膜的疑似患者或带菌者可采集 鼻咽部或扁桃体粘膜上的分泌物。 检验程序 咽拭标本 亚碲酸钾 血平板 观察菌落特征 直接涂片 革兰染色 异染颗粒染色 血平板 吕氏血清斜面 直接涂片 革兰染色 异染颗粒染色 涂片染色镜检 生化反应 毒力试验 检验方法 l标本直接涂片 革兰染色：观察形态、染色性 异染颗粒染色：观察异染颗粒 初步报告：检出形似白喉棒状杆菌 l分离培养 吕氏斜面：生长迅速，涂片镜检异染颗粒明 显 亚碲酸钾血平板：黑色菌落 生化反应 根据 糖发酵是否产酸 可鉴别棒状杆菌 中的不同种。 白喉棒状杆菌发酵葡萄糖、麦芽糖产 酸，不分解蔗糖；尿素酶（ ）、硝酸盐还 原试验（ +）等可用于与其他棒状杆菌的鉴 别。 毒力试验 l意义：是鉴定白喉杆菌为致病菌株的重要依据 l方法 艾立克平板毒力试验 对流电泳法 协同凝集试验 动物实验 二 其他棒状杆菌 第二节 需氧芽胞杆菌属 芽胞杆菌属共同特点 l绝大多数菌种在有氧条件下形成不大于 菌体横径的芽胞 l除炭疽芽胞杆菌外均有动力和溶血能力 l非抗酸性 l营养要求不高，在普通培养基上生长良 好 一 炭疽芽胞杆菌 （一）生物学特性 l形态与染色 l培养特性 l菌落特征 l生化反应 l抗原构造 l抵抗力 形态与染色 为致病菌中最大的革兰阳性杆菌，两端齐 平或凹陷，呈竹节状，单个或呈短链状排列。 无鞭毛，形成芽胞，有毒菌株可形成荚膜 。 人工培养或在外界环境中易产生芽胞， 在活体或完整未经解剖的尸体内不形成芽胞， 所以 炭疽病尸体严禁解剖 。 2018/8/26 培养特性 l需氧或兼性厌氧。 l营养要求不高， 普通培养基上生长良好 。 2018/8/26 菌落特征 l普通琼脂平板：菌落扁平、粗糙，不透明灰白色 ，无光泽，边缘不整齐，在低倍镜下可见到菌落边 缘呈 卷发状 。 l血液琼脂平板：培养 12 15h， 菌落周围 无溶血环 ， 18 24h后可有 轻微溶血 ，而其他需氧芽胞杆菌大 多数溶血明显而快速。 l液体培养基中呈絮状生长 l明胶培养基中呈倒置的杉树 l有毒株在 NaHCO3培养基中形成荚膜，菌落呈粘液状 ，有拉丝。 2018/8/26 有毒株 在 NaHCO3血琼脂平板上置 5%CO2环 境中培养 18 24h， 可产生荚膜，菌落由粗糙 型变为 粘液型 ，而呈现半圆形，突起，有光 泽的菌落。以接种针挑取时 呈拉丝状 ，此为 鉴别菌落要点，而无毒株则形成粗糙型菌落 。 生化反应 分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖，产酸不产 气。不分解乳糖。触酶（ +）， VP（ ）， 吲 哚（ ），尿素（ ） 。 抗原结构 v炭疽毒素 ：由保护性抗原、致死因子、水肿因 子组成的蛋白质复合物，后两者单独不能发挥生 物活性作用，都必须与保护性抗原组合才能引起 实验动物的水肿致死。 具有抗吞噬作用和免疫原 性，故患炭疽后有免疫力。 v荚膜抗原 ：与细菌毒力有关，失去荚膜后毒力 也就消失。该抗原具有高度特异性，在临床诊断 中有鉴别诊断价值。 v菌体抗原 ： 耐热、耐腐败， 无毒性，有种特异性 。 v芽胞抗原 ：芽胞的外膜含有抗原决定簇，与皮质 层一起组成炭疽芽胞杆菌芽胞的特异性抗原，此 抗原具有免疫原性和血清学诊断价值。 Ascoli热沉淀反应 ：感染动物尸体组织浸出液 煮沸半小时后，耐热的菌体抗原不被破坏，能与 特异性抗体发生环状沉淀反应，称 Ascoli热沉淀 反应，对炭疽病具有一定的诊断价值。 2018/8/26 抵抗力 本菌繁殖体抵抗力与其它细菌相同， 芽胞抵 抗力很强 。在干燥的土壤或者皮毛中可存活 20余 年。 芽胞对碘和氧化剂敏感。 耐药性：本菌对磺胺类、青霉素、四环素、 环丙沙星敏感。 （二）致病性与免疫性 l致病物质：炭疽毒素、荚膜 l所致疾病 经多途径感染，引起炭疽病。 临床类型：肺炭疽、肠炭疽、皮肤炭疽、败血症 。 属人畜共患传染病，死亡率高。 l免疫性：病后可获得持久性免疫力，再次感染者 甚少。 （ 三 ）微生物学检验 l标本采集 l检验程序 l检验方法 标本采集 l标本采集 病人血液、痰、粪便、渗出液、脑脊液等。 死亡病畜标本： 死于败血症的动物，严禁宰杀 、解剖 ，可在消毒皮肤后割取耳朵、舌尖、采集 少量血液。 污染物品：皮革、兽毛、土壤等。 l标本处理 ：无杂菌污染标本直接接种，有杂菌 污染标本先加热杀死繁殖体和杂菌再接种。 已处理标本 直接涂片 增菌培养 分离培养 Ascoli试验 革兰染色 荚膜染色 初步报告 血平板 戊烷脒琼脂平板 可疑菌落 菌落涂片 染色镜检 鉴定试验 肉汤培养 动物实验 动物死亡 分离培养 噬菌体裂解 串珠试验 青霉素抑制试验 检验方法 l涂片染色镜检 革兰染色：涂片后升汞固定，革兰染色发现革 兰阳性粗大杆菌、有荚膜，呈竹节样排列可初步 报告。 l分离培养： 一般接种血平板， 37 培养 24h后观 察菌落特点。 污染的标本先加热处理再接种。 l动物试验：注射部位胶样水肿，肝脾肿大，出 血等。 在芽胞杆菌属中，除蜡样芽胞杆菌毒素对 动物有致病作用外，炭疽芽胞杆菌是唯一具有致 病力者。 鉴定试验 q青霉素抑制试验 炭疽芽胞杆菌在含 5 IU/ml的青霉素培养基 上能生长，而在含 10、 100 IU/ml的青霉素培养基 上受到抑制不生长。 鉴定试验 q串珠试验 与类炭疽芽胞杆菌鉴别 炭疽芽胞杆菌受低浓度青霉素作用后，在 形态上发生明显的变化。 如将本菌幼稚培养物接 种于含 0.05 0.5U/ml青霉素的培养基上， 376 h ， 菌体肿大呈圆珠状，称串珠反应。 此反应可能与青霉素抑制细菌胞壁的合成 作用有关，为炭疽杆菌所特有，可用于与其他 类 炭疽 芽胞杆菌的鉴别。 鉴定试验 q青霉素和串珠联合试验 q 噬菌体裂解试验 与类炭疽芽胞杆菌鉴别 q NaHCO3毒力试验 有毒力的炭疽杆菌形成荚膜，菌落呈粘液型， 无毒力的炭疽杆菌不形成荚膜，菌落呈粗糙型。 鉴定试验 v植物凝集素试验 根据炭疽芽胞杆菌菌体多糖是植物凝集素 受体的原理。 vAscoli热沉淀试验 用已知的抗炭疽杆菌抗体测定标本中未知 的抗原。炭疽杆菌沉淀原具有耐高热特征，在尸 体组织和皮毛中数年仍能检出，故可作追溯性诊 断。 2018/8/26 炭疽芽胞杆菌与其它需氧芽胞杆菌的 鉴别 鉴别项 目 炭疽芽胞杆菌 枯草芽胞杆菌 蜡 样 芽胞杆菌及其它需氧芽胞杆菌 形 态 菌体两端平整或凹陷 两端 钝圆 两端 钝圆 荚 膜 + - - 动 力 - + + 菌落 有小突起， 边缘 呈卷 发 状，粘稠菌落 锯齿 状粗糙菌落 蜡 样 或粗糙不粘稠 菌落 肉 汤 絮状沉淀，上 层 清晰 均匀混 浊 有菌膜 均匀混 浊 有菌膜 Ascoli + - - 溶血 不溶血或微溶血 + + 串珠 试验 + - - 二 蜡样芽胞杆菌 （一）生物学特性 l形态与染色 l培养特性 l菌落特征 l生化反应 l抵抗力 形态与染色 革兰阳性大杆菌，两端较钝、链杆状， 长短不一，有鞭毛，无荚膜，可形成芽胞。 培养特性 v 需氧或兼性厌氧，营养要求不高。 v 普通琼脂平板：可形成圆形、隆起、灰白 色、不透明、 R型 蜡滴样 大菌落。 v 血琼脂平板：菌落呈浅灰色，似毛玻璃状 ，菌落周围有 或 溶血 。 2018/8/26 乳光反应或卵黄反应： 在卵黄琼脂平板上生长迅速，培养 3h后，虽看不到菌落，但该菌可分解卵磷脂 而形成 白色的混浊环 ，即为乳光反应或卵黄 反应。 生化反应 分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖，产酸不产 气，不分解乳糖。 VP（ +）， 液化明胶。 抵抗力 耐热，抵抗力强 , 能耐受 10030min 。 （二） 致病性 条件致病菌，主要引起食物中毒。 q临床上分为两种类型： q 腹泻型：由不耐热的肠毒素引起。 q 呕吐型：由耐热的肠毒素引起。 （ 三 ）微生物学检验 l1标本采集 除进行本菌的分离培养外，必须作 活菌 计数 。因暴露于空气中的食物，在一定程度上都 受本菌污染，故 不能因分离出蜡样芽胞杆菌则认 为是引起食物中毒的病原菌 。 l2检验程序 3检验方法 l直接镜检 ： l活菌计数 ： 一般认为蜡样芽胞杆菌的活菌数 大于 105 /mL时，即有发生食物中毒的可能。 l分离培养 ： l鉴定 第三节 产单核李斯特菌 一 生物学特性 l形态与染色 l培养特性 l生化反应 l抗原结构 l抵抗力 （一）形态与染色 革兰阳性小杆菌，直或稍弯，常呈 V字形 成对排列，有时呈丝状，偶尔可见双球状。 多数菌体一端较大，似棒状，易误认为 是污染的类白喉棒状杆菌； 又因菌体短小，三、五成链，并有 溶 血性，易与链球菌混淆，用触酶试验加以区别 。 2018/8/26 在 22 25 环境中形成 4根鞭毛，故在 25 肉汤培养液中 运动活泼 ；而在 37 时仅 形成 1根鞭毛， 动力缓慢 。 （二）培养特性 v 需氧或兼性厌氧，营养要求不高。 4 45 均能生长，最适温度 30 37 。 因在 4 能生长， 故可进行 冷增菌 。 v 初时菌落极小似 露珠状 、光滑透明，通过侧 光微显蓝绿色， 37 培养数日，菌落增大变成灰 暗，血平板上的菌落有狭窄的 溶血环。 2018/8/26 （三）生化反应 l 1 2d内发酵葡萄糖、果糖、麦芽糖， 产酸不产气，在 3 10d内可发酵乳糖、蔗 糖、阿拉伯糖。触酶阳性， VP（ +）， MR（ +）。 （四）抗原结构 l 分为 4个血清型， 1型主要感染啮齿动物 ，各型对人类均可致病，但以 1a和 lb最为 多见。 l 本菌与葡萄球菌、链球菌、肺炎链球 菌及大肠埃希菌等具有共 同 抗原。 2018/8/26 （五）抵抗力 l在土壤、粪便、饲料中能长期存活。 l耐盐、耐碱、不耐酸。 l对热敏感，对 般消毒剂敏感， 70的 乙醇 5min即可杀死本菌。 二致病性 本菌常伴随 EB病毒引起传染性单核 细胞增多症。 三 微生物学检验 （一）标本采集 （二）检验程序 （三）检验方法 1分离培养 2鉴定要点 v形态染色：革兰阳性小杆菌。 v 溶血：本菌的 溶血环很窄，往往把 菌落刮去，方可见菌落下面的 溶血环。 v动力试验： 25 动力阳性。 v4 能生长 2018/8/26 第四节 红斑丹毒丝菌 一 生物学特性 l形态与染色 l培养特性 l生化反应 （一）形态与染色 革兰阳性杆菌，单个或形成短链状 ，粗糙型菌落形成长丝状。无鞭毛，无 荚膜，无芽胞。 2018/8/26 （二）培养特性 厌氧或微需氧菌。初次分离需在厌氧 环境中培养，传代后在有氧条件下也能生 长。 （三）生化反应 v 氧化酶（ ），触酶（ ），发酵葡 萄糖、乳糖，产酸不产气。 2018/8/26 二致病性 红斑丹毒牡菌为红斑丹毒丝菌病的病原 体。 主要发生在鱼类、家畜、家禽和兔类， 人类也感染发病。 人接触动物或其产品经皮肤损伤而引起 类丹毒。以局部感染为主，继而发展成淋巴 管炎，可转变成关节炎。也可引起急性败血 症或心内膜炎。 三微生物学检验 （一）标本采集 （二）检验程序 （三）检验方法 1直接镜检 2分离培养 3生化反应 4动物试验 2018/8/26 第五节 阴道加特纳菌 一 生物学特性 l形态与染色 l培养特性 l生化反应 l抵抗力 （一）形态与染色 本菌革兰染色视菌株和菌龄不同而异。 本菌具有多形性，两端钝圆，无鞭毛，无 荚膜，无芽胞。 （二）培养特性 v 兼性厌氧菌，营养要求较高，在一般 营养琼脂平板上不生长。 v 在含 5%人血琼脂平板上置 5%CO2， 35 37 培养 24h后，形成针尖大小菌落； 经 48h后形成 溶血、圆形、光滑不透明 的菌落。 2018/8/26 （三）生化反应 v 氧化酶（ ），触酶（ ），尿素酶 （ ）。发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖等， 产酸不产气。 2018/8/26 （四）抵抗力 所有菌株对氨苄青霉素、羧苄青霉素、 苯唑青霉素、青霉素、万古霉素和甲硝唑 敏感；对萘啶酸、新霉素、粘菌素和磺胺 嘧啶耐药。 二致病性 l 阴道加特纳菌和厌氧菌 在阴道内过度 生长，造成阴道正常菌群微生态平衡失调 ，而引起非特异细菌性阴道病（ BV） 。 l 可导致妇产科多种严重并发症。如子 宫全切术后感染、绒毛膜炎等。 l 本菌还能引起新生儿败血症和软组织 感染。 l 并非 GV阳性者都是 BV， 因为 20 40%的正常妇 女阴道也可检出此菌。 l BV诊断标准： v 阴道分泌物增多，稀薄均质灰白色，有恶臭味 。 v 分泌物 pH 4.5 4.7。 v 分泌物胺试验阳性。 v 镜检有线索细胞。 2018/8/26 三 微生物学检验 （一）标本采集 （二）检验程序 （三）检验方法 1阴道分泌物直接检查 v 直接湿片镜检：线索细胞 v 涂片染色镜检： v pH测定：阴道 pH 4.7， 提示细菌性阴道炎。 v 胺试验： 2分离培养 2018/8/26 分枝杆菌属及检验 分枝杆菌属主要特点 l是一类直或微弯曲、有分枝生长趋势的杆菌。 l细胞壁脂质含量高，主要为分枝菌酸。 l具有抗酸性，革兰染色不易着色，常用 抗酸染 色 。 l专性需氧，营养要求特殊，大多数生长缓慢。 l不产内、外毒素和侵袭性酶等致病物质， 其致 病性与菌体成分有密切关系， 所致疾病呈慢性。 分枝杆菌属种类 结核分枝杆菌复合群 结核分枝杆菌 牛分枝杆菌、 非洲分枝杆菌 田鼠分枝杆菌 非典型分枝杆菌 麻风分枝杆菌 光产色分枝杆菌 暗产色分枝杆菌 不产色分枝杆菌 迅速生长分枝杆菌 分枝杆菌属 第一节 结核分枝杆菌 一 生物学特性 l形态与染色 l培养特性 l生化反应 l抵抗力 l变异性 形态与染色 l细长略弯，分枝生 长趋势。 l无芽孢，无鞭毛， 部分菌株有荚膜。 l革兰染色阳性，不 易着色。 l抗酸染色阳性 ， 多 数菌体含有一至数 个 异染颗粒 。 结核分枝杆菌 （抗酸染色） 培养特性 l 生长条件： 细胞内寄生菌，专性需氧 ， 8% 12%CO2可刺激其 生长。 最适 pH6.5 6.8。 营养要求较高，必须在含有血清、卵黄、甘油、 马铃薯以及无机盐类的特殊培养基上才能生长。 l 生长现象： 生长缓慢 ，在一般的培养基中 每分裂一代的速 度为 18 24h。 改良罗氏培养基 菌落 特征：干燥、淡黄色、 质地较硬的 R型菌落 液体培养基：形成菌膜，有毒株呈索状生长。 结核分枝杆菌菌落 生化反应 l生化反应不活泼，不发酵糖类。 触酶阳性 。 l与非结核分枝杆菌鉴别： 耐热触酶试验；（非结核分枝杆菌 ） l与牛分枝杆菌鉴别 烟酸试验；（牛分枝杆菌） 抵抗力 l抵抗力特点： “ 三耐四敏 ” 耐干燥、耐酸碱、耐孔雀绿（ 1:13000） 对湿热、 70乙醇、紫外线、常用抗结 核药物（但长期使用易产生耐药性）敏感。 结核分枝杆菌细胞壁含有大量脂质，酒 精较易渗入细胞壁将其杀死，故对 70% 75%的 酒精敏感 。但脂质可防止菌体内水分丢失，故 对干燥的抵抗力特别强。 变异性 典型形态 多形性 R型菌落 S型菌落 有毒 无毒（用于制备疫苗） 抗结核药敏感 耐药 二致病性与免疫性 l致病物质 l所致疾病 l免疫性与变态反应 致病物质 l脂质 索状因子：与该菌毒力有密切关系 磷脂： 分枝菌酸：与抗酸性有关 蜡质 D：具有佐剂作用 硫酸脑苷脂： l蛋白质 l糖类 l结核杆菌不产生内、外毒素，不产生侵袭性酶。 所致疾病 l经多途径感染，引起结核病，以肺结核 多见 l类型：原发感染和继发感染 免疫性与变态反应 抗结核免疫以细胞免疫为主 抗结核免疫属带菌免疫 抗结核免疫与 型超敏反应同时出 现 结核菌素试验 l原理：用结核菌素进行皮肤试验，以检测受试者 对结核杆菌是否有细胞免疫及迟发型超敏反应的试 验。 l结果：根据注射部位是否出现红肿判断结果 5mm为阴性 5mm为阳性 15mm为强阳性 l应用：选择卡介苗接种对象；判断卡介苗接种效 果；