骨外科基因治疗ppt课件

Table of Contents 1 基因治疗概述 2 骨科基因治疗现状 3 动物实验研究 4 临床研究 5 基因治疗在骨质疏松性骨折中的运用 （重点） 基因治疗概述 基因治疗 (gene therapy)是将某种形式的核 酸转入患者体细胞内以减轻疾病的过程。就 是把由一个或几个基因及其调控序列转移 (gene transfer)到靶细胞并发挥遗传物质 的作用以治疗疾病。 步骤： 基因治疗概述 基因载体 基因治疗概述 基因治疗目的： (1)替代缺损基因； (2)加强常规基因的功能； (3)在 DNA或 RNA水平阻断致病基因的作用。 基因治疗的根本点是使内源细胞产生特殊蛋白 其包含 4个关键步骤： 转导、转录、翻译、表达 。 骨科基因治疗现状 骨科基因治疗是分子生物学在骨科领域的 重要应用，是极有前途的一种治疗方法， 但目前仅限于实验室阶段，距离临床大量 应用尚有一段距离（仅个别疾病开始了局 部基因治疗的初期临床研究）。 本小组成员阅读大量有 关文献，从动物实验研究与 临床研究两方面进行简单介 绍， 重点叙述基因治疗在骨 质疏松性骨折中的运用 。 动物实验研究 一、骨愈合的基因治疗 目的基因只需在骨诱导早期数天或数周短期表 达以启动骨诱导即可。目前促进骨愈合基因治 疗的热点集中在 BMP-2 、 7 、 9 基因在脊柱融 合、长骨缺损中的应用。 将目的基因导入基质细胞 ,不仅可以提供目的 基因表达产物 ,自身还可被诱导分化为骨祖细 胞以弥补局部骨前体细胞的不足。BMP-2电泳 结果 经过转 导后结 果对比 二、椎间盘疾病的基因治疗 IVD 特有的解剖结构以及低氧、低营养、低 pH 值的生理环 境更适合活体直接转基因术的应用。（未来方向） 三、肌腱和韧带的基因治疗 腺病毒作为载体较为适宜。 Hart 等将重组了反义核心蛋白聚糖核苷酸的 HVJ / 脂质体 注入兔的内侧副韧带损伤处。 实验结果显示基因治疗有助于腱愈合和避免腱粘连 动物实验研究 四、关节和软骨的基因治疗 滑膜覆盖了关节囊的所有内表面 ,故滑膜内衬 细胞是较为理想的靶细胞。 Frisbie等将 Ad-EqIL-1Ra 注入马的 OA 关节内 ,术后关节评分显著增高 ,关节滑液渗出减少 ,关 节病变程度减轻。 基因转染治疗骨性关节炎 动物实验研究 五、脊髓和周围神经损伤的基因治疗 由于髓磷脂的抑制作用、神经胶质瘢痕形成 和细胞死亡 ,脊髓损伤后几乎没有自发性的 再生。 Ad-NGF、 Ad-FGF-2 注入损伤背根的神经胶 质中 FGF-2 或 NGF 的表达诱导了明显的局部 轴突生长 ,温度觉基本恢复正常。 临床研究 目前骨科基因治疗的临床研究仅限于 RA 的基 因治疗。在有效性和安全性试验的基础上 ,1996 年美国开展了第一例基因治疗 RA ,它不 仅是首例基因治疗的骨科疾病 , 也是首次应用 基因治疗非致命性疾病。 另有二个临床试验是在关节内转导单纯疱疹病 毒携带的胸苷激酶基因 ,表达产物促使滑膜细 胞凋亡 ,进行 “ 基因滑膜切除术 ” 。 基因治疗在骨质疏松性骨折 中的运用 40岁人群 骨质疏松症 男性 11.15 % 女性 19.19% 低骨量的患病率 男性 45.18% 女性 32.14% 一、骨质疏松性骨折的愈合能力较差 ： 老年人缺乏间充质干细胞 , 且功能低下；来自骨质疏 松症患者的细胞比正常细胞合成更少的 型胶原纤维。 二、促进骨质疏松性骨折愈合的必要性： 将大大降低由于内固定失败和长期制动而产生的并发 症的发生率。 骨折愈合中的重要基因产物 生长因子 大多数实验聚焦在转基因表达骨形成蛋白 ( BMP) 的使用上。 BMP-2 和 BMP-7 cDNA具有克 服调节屏障的优势而用于临床 ,最新研究显示 BMP - 6 和 BMP - 9 cDNA 是更有效的成骨性 因子 转录因子 LIM矿化蛋白 - 1 (LMP - 1) , 其在啮齿类动 物中 , 低浓度时促进成骨并能引起脊柱融合。 其它细胞因子 大多数细胞因子的作用在于增加骨形成 , 从而促进骨折的早期愈合。 实验研究显示 :给予 IL - 1 受体拮抗剂 ( IL - 1RA) 或一种可溶形式的 TNF - 1 受 体能引起去卵巢大鼠或小鼠的骨丢失。 基因治疗在骨质疏松性骨折 中的运用 三、基因治疗 骨质疏松性骨折的基因治疗正在探索 ,目前大 多数的研究都处在动物实验阶段 , 但却展示出 诱人的前景 , 主要采取的方式有两种 : 一种是 直接体内基因转移；另一种是先体外后体内的 基因转移方式。 直接体内基因转移 1、直接体内基因转移 体内基因转移包括通过转导局部的细胞将基因 转移到特定的解剖部位。 技术简单 , 易于临床应用 , 而且费用较低 ; 其 不足之处是靶向转导困难 , 转导效率较低 目前主要有两种体内转移方式 :一种是植入掺 在胶原海绵 ( 作为基因活化基质 ) 里的质粒 DNA; 另一种则直接注射病毒载体。 直接体内基因转移 包含编码 PTH1 - 34 和 BMP - 4 质粒的基因活 化基质技术 ( GAM) 能够修复愈合达 5 mm的大 鼠股骨缺损。 当这一技术用于狗的临界大小胫骨缺损上 , 含 有 PTH1 - 34 cDNA 的 GAM获得了 6 周的转基因 表达。（很有热点） 直接体内基因转移 重组腺病毒提供了一个可供选择的体内基 因转移载体。与体内基因传递相比 , 腺病 毒的一个优势是能够原位感染细胞。 但是病毒载体微粒引起的免疫反应 , 因为 这会抑制转基因的表达。 直接体内基因转移 第一代含编码 BMP - 2 (或 BMP - 2 前体 ) 的 cDNA 的腺病毒载体会通过注射诱导引 起异位骨化 ; 但是 ,在具有免疫活性的大 鼠 , 骨形成会被抑制。而在无胸腺大鼠模 型上 , 通过在缺损部位注射 Ad - BMP - 2 修复了临界大小的下颌骨缺损。 对于这一反应 , 可以通过注射环磷酰胺引 起暂时的免疫抑制从而预防对病毒载体的 炎症反应 , 增加骨形成。 直接体内基因转移 抗腺病毒载体的免疫反应 , 限制了其分泌蛋白 的生物活性。虽然实验性的暂时免疫抑制有一 定作用 , 但其临床应用变得更加困难。 骨内给药效果更好： 现在已证实 , 通过直接 体内应用 Ad - BMP - 2 可以治愈具有免疫活 性的大鼠的临界大小的骨缺损。 利用修饰基质策略将病毒与胶原基质结合 , 可 以进一步减轻对腺病毒的免疫反应。 先体外后体内的基因转移 方式 在大鼠临界大小骨缺损模型中 , Lieberman 的 团队应用第一代腺病毒重组体将人 BMP - 2cDNA 转导入来自骨髓的成骨性间质细胞。这 些细胞中可能包含有间充质干细胞。在人巨细 胞病毒早期转录子调节下 , 转录细胞表达高水 平的人 BMP - 2 。这些细胞种植在胶原基质和 精确植入临界大小骨缺损部位 , 接受了遗传修 饰细胞的部位获得了骨性愈合 , 而对照组未能 愈合。 先体外后体内的基因转移方 式 主要缺点是需要来自患者的自体细胞培养 。因此 , 要是能够使用同种异体细胞 , 那 将可以建立广泛的供体体。干细胞能够被 成功地同种异体移植将十分有助于解决这 一问题 , 而对此的努力十分有意义。但是 , 在大鼠部分缺损模型中 , 使用同种异体 间充质干细胞转导的 BMP - 2 只有在给于 免疫抑制剂 FK - 506下才能使缺损愈合 总结 间充质干细胞