色谱法的基本原理

一教学内容 1.色谱分离的基本概念和基本原 理 2.色谱分离的理论基础 3.简单的色谱定性和定量分析的方 法 2.1 色谱法概述 2.1.1 色谱法的起源和发展 胡萝卜素 (黄色 ) 石油醚 +植物色素 石油醚 CaCO3固定相 叶绿素 (绿色 ) 叶黄素 (黄色 ) 液液分配色谱 硅胶 水 乙醇氯仿 (流动 相 ) 各种氨基酸 硅胶为载体 水为固定相 年代 发明者 发明的色谱方法或重要应用 1906 Tswett 用碳酸钙作吸附剂分离植物色素。最先提出色谱概念。 1931 Kuhn, Lederer 用氧化铝和碳酸钙分离 a-、 b-和 g-胡萝卜素。使色谱法开 始为人们所重视。 1938 Izmailov, Shraiber 最先使用薄层色谱法。 1938 Taylor, Uray 用离子交换色谱法分离了锂和钾的同位素。 1941 Martin, Synge 提出色谱塔板理论；发明液 -液分配色谱；预言了气体可 作为流动相（即气相色谱）。 1944 Consden等 发明了纸色谱。 1949 Macllean 在氧化铝中加入淀粉黏合剂制作薄层板使薄层色谱进入 实用阶段。 1952 Martin, James 从理论和实践方面完善了气 -液分配色谱法。 1956 Van Deemter等 提出色谱速率理论，并应用于气相色谱。 1957 基于离子交换色谱的氨基酸分析专用仪器问世。 1958 Golay 发明毛细管柱气相色谱。 1959 Porath, Flodin 发表凝胶过滤色谱的报告。 1964 Moore 发明凝胶渗透色谱。 1965 Giddings 发展了色谱理论，为色谱学的发展奠定了理论基础。 1975 Small 发明了以离子交换剂为固定相、强电解质为流动相，采 用抑制型电导检测的新型离子色谱法。 1981 Jorgenson等 创立了毛细管电泳法。 一、色谱法的定义 2.1.2 色谱法定义和分类 定义： 利用不同溶质（样品）与固定相和流动相之 间的作用力（分配、吸附、离子交换等）的差别 ，当两相做相对移动时，各溶质在两相间进行多 次平衡，使各溶质达到相互分离。 特点： 高超的分离能力， 是一种物理化学分析方法 具体优 点： （ 1）分离效率高。 （ 2）应用范围广。 （ 3）分析速度快。 （ 4）样品用量少。 （ 5）灵敏度高。 （ 6） 分离和测定一次完成 。 （ 7）易于自动化，可在工业流程中使用。 定性能力较差。 色谱法的缺点 二、色谱法的重要概念 固定相 流动相 色谱柱 1、按流动相所处的状态分类 气相色谱 - 用气体作流动相 液相色谱 - 用液体作流动相 气 固色谱 气 液色谱 液 固色谱 液 液色谱 三、色谱法的分类 超临界流体色谱 2、按固定相使用的形状分类 柱色谱：固定相装在柱管内。 纸色谱 薄层色谱 (纸色谱和薄层色谱又统称作平板色谱 ) 3、按分离过程的物理化学原理分类 吸附色谱 (L S， G S) 分配色谱 (L L， G L) 离子交换色谱 (L S) 空间排阻色谱 (L S) 吸附色谱 (L S， G S) 分配色谱 (L L， G L) Conditioned sorbent Good transport between sample and sorbent 硅胶 水 离子交换色谱 (L S) OH Electrostatic attraction Silica base CO2H CO2- OCON(CH3)2 +N NH3+ SO3- 空间排阻色谱 (L S) 2.2 色谱分离原 理 1. 分配系数（ K） Cs： 被测组分在固定相中的浓度 Cm： 被测组分在 流动相中的浓度 2.2.1 分配系数和分配比 分配系数意义： K是热力学常数， K值除了与温度、压力有关外 ，还与被测物、固定相和流动相的性质有关。 K值大 Cs大 tR长 移动速度慢。 若两组分的 K值相等 两个组分分离开。 2. 分配比（ k） ： 相比 分配比的意义： k随 K和 的变化而变化； k值越大 ms越多 柱的容量大 k又称作 容量因子 。 k是表征色谱柱对被测组分保留能力的主要参 数。 2.2.2 色谱法分离原理 色谱分离过程的特点：不同组分在通过色谱柱时移动速度不等 。 流动相 B B A 空气B A+B A 检测和记录A+B+空气进样 固定相 流动相 1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0.031 0.001 6 0.078 0.004 7 0.118 0.008 8 0.138 0.014 9 0.138 0.021 10 0.125 0.03 11 0.105 0.04 12 0.083 0.045 13 0.063 0.05 2.3 色谱流出曲线 五种磺胺的色谱图 气相色谱分离多环芳烃色谱 图 一、色谱流出曲线或色谱图 以检测器对组分的响应信号为纵坐标，流出时间 (或流出体 积 )为横坐标作图所得的曲线。 Rf (t, V) 二、色谱流出曲线构成： 由基线和色谱峰组成。 基线： 指仅有流动相通过而没有待测物，检测器响应信号 随流 出时间 的变化。 色谱峰： 在基线上突起的部分，它是由引入流动相中被测物引 起的。 色谱图或色谱流出曲 线 描述色谱峰三种参数 峰高 (或峰面积 ) 峰的大小 区域宽度 峰的形状 保留值 (时间 t、体积 v) 峰的位置 2.3.1 色谱峰 高斯分布曲线 1峰高 h 2标准偏差 ， 0.607h处，拐点处，峰宽正好为 2 3峰面积 A A 1.065hY1/2 4半峰宽 Y1/2 Y1/2=2.354 5峰底宽 Y=4，拐点作切线与基线相交，相交两点间 距离为峰底宽 Y。 Y1/2、 Y统称为区域宽度 通常用将各组分带出色谱柱所需的载气体积 或时间表示。 2.3.2 保留值 定义： 在一定的 固定相 和 操作条件 下，任何一种物质都 有一个固定的保留值，故组分的保留值可用于该 组分的定性鉴定 。 特点： 1死时间 tM 说明： 实际上就是流动相通过色谱柱所需要的 时间。或是组分在流动相中所消耗的时间。 tM由色谱柱中流动相体积 Vm与流动相流速 决定，与被测组分和固定相无关。 2. 保留时间 tR 定义： 从进样开始到柱后 , 组分出现响应信号极大值 时所需时间。 说明： 组分的保留时间就是组分通过色谱柱所需的时 间。即组分在色谱柱内运行的时间。 影响因素： 流 动 相 性质、在色谱柱中的体积 Vm和流速 固 定 相 性质、在色谱柱中的体积 Vs； 被测组分 性质 3. 调整保留时间 （ ） 定义： 扣除死时间后的保留时间。 说明： 组分在固定相中停留的时间 。 = 注意： 4. 流动相的流速 定义： 单位时间流动相所通过的距离 -线流速， u 单位时间通过流动相的体积 -体积流速， F 单位时间通过流动相的量 -质量流速， Fm和摩尔流 速， Fn) F、 Fm和 Fn常称作流量。 线流速 l/t (m/min) 体积流速 v/t (ml/min) 质量流速 m/t (g/min) F 说明： 在流路的任何一点， 质量流速或摩尔流速相等。 Fm=Fn 对于气相色谱，线流速和体积流速可能各处不同； 对于液相色谱，线流速可能不一样，但体积流速可视为 各处相同。 气体状态方程 不同位置处，线流速不同 气相色谱中柱内平均体积流速的确定 c点处的平均体积流速 为柱内气体的平均摩尔流速 为流量计内 r处气体的摩尔流速 Fc很难测，且为柱内平均值， Fr易测，求 Fr与 Fc的关系即可 。 柱内平均压力 Pc r点处载气的压力 Pr Pr = Po Pw 压力校正项 湿度校正项 温度校正项 5. 死体积 VM 定义：不被固定相保留的组分，通过色谱柱时所需 流动相的体积。 计算： VM = tM 6. 保留体积 VR 定义：从进样开始到柱后出现待测组分响应信号 极大值时所通过的载气体积。 计算： VR = tR 注意：各种保留时间受流动相流速的影响，各种 保留体积与流动相流速无关。 7. 调整保留体积 定义： 保留体积扣除死体积后的体积 计 算 公 式 ： = = V R V M 计算公式： 8. 相对保留值 r2,1 （选择性因子 ） 定义：相对保留值 r2,1是指组分 2的 调整保留值 与组分 1的 调整保留值 之比 公式 ： 越大 两组分容易分离； = 1时 两组分不能分开。 说明： 只与 柱温和固定相性质 有关 9. 保留值与分配比的关系 被测物在色谱柱内的平均线流速 x为 流动相在色谱柱内的平均线流速 为 L为色谱柱长 被测物出现在流动相中的几率为 x 与 的关系为 色谱柱长是一定的，所以 色谱过程方程： 表达了 保留时间 与 分配系数或容量因子 两个重要 参数的关系。 容量因子越大，溶质的保留时间也越长。 对于混合物，分配系数不等是分离的前提。 例 2.1 已知 Vs = 2.0 mL， Fc = 50 mLmin -1， tR = 5 min， tM = 1 min。 求 VM， VR， ， k， K 。 色谱流出曲线可以解决的 问题 1样品所含最少组分个数 2可以进行定性分析 3可以进行定量分析 4可对色谱柱效能进行评价 5. 色谱过程的 热力学问题 6. 色谱过程的 动力学问题 总结 色谱理论 色谱理论需要解决的问题： 影响分离及柱效的因素与提高柱效 的途径，柱效与分离度的评价指标及其 关系 色谱分离过程的热力学和动力学问题。 。 2.4 塔板理论 2.4.1 塔板理论的假设 1. 柱分成 n段， n为理论塔板数，每段高为 H， H为塔板高 度，柱长为 L，则 n=L/H 2. 所有组分开始都加在第零号塔板上。 3. 在每块塔板上被测物在两相间平衡是瞬间建立的。 4. 流动相是以脉冲式 (塞子式 )进入色谱柱进行冲洗的，每 次恰好为一个塔板体积 V。 5. 在所有塔板上，同一组分的分配系数为常数，即和组 分的量无关。 6. 沿色谱柱方向不存在塔板与塔板间被测物的纵向扩散 。 假定： K=1 Vs/Vm=1 k=1 n=5 进样量 m=1mg 板体积数 （ V ） 0 1 2 3 4 0 0.5 0.5 1V 0.25 0.25 0.25 0.25 2V 0.125 0.25 0.125 0.125 0.25 0.125 3V 0.0625 0.188 0.188 0.0625 0.0625 0.188 0.188 0.0625 4V 0.0312 0.125 0.188 0.125 0.0312 0.0312 0.125 0.188 0.125 0.0312 检测器 这一理论得到结果 1分布有一最大，两边逐渐减小 2色谱流出曲线的形状类似于数 学上的正态分布曲线 正态分布方程为： C：不同流出体积时的组分浓度 m：进样量 VR：保留体积 n：塔板数 V ：流出体积 将正态分布方程用于色谱流出曲线方程的数学表达 式，也称 塔板理论方程 ： 令： 为标准偏差 令： m = 1 当 V VR时， 当 则 则 ： 将 代入 由 Y1/2 = 2.354 和 Y = 4 可证明 Y1/2=0.5885Y 为了准确评价色谱柱效能，宜采用有效塔板数 neff和有效塔板高度 Heff 理论塔板数和有效塔板数关系 说明： 对于 n和 neff以及 H和 Heff，用同一色谱柱时 对不同物质是不一样的；同一物质，对不同柱 子也不一样。 塔板理论的成功与不足 成功： 1、导出了色谱流出曲线的数学表达式； 2、说明了色谱峰的形状呈正态分布； 3、解释了浓度极大点； 4、提出了评价柱效的参数 (n)及其计算式 不足： 1、仅考虑了热力学因素，没有考虑动力学因素； 2、不能说明影响柱效的因素及谱带扩张的原因； 3、不能说明流动相流速对柱效的影响，而实验事实 是流速不同时测得的 n (或 H)不同 2.5 速率理论 2.5.1 气相色谱法 色谱过程的动力学理论 塔板高度 H 与载气线速度的关系 A 为涡流扩散项， B 为分子扩散项系数， C 为传质阻力项系数， 为载气的平均线流速 范弟姆特方程 1涡流扩散项 A A = 2dP ：填充不规则因子 dP：填充物颗粒的平均直径 影响： 填充物颗粒的大小、分布以及填充均匀的程度； 不受影响： 载气性质、线速度和组分无关。 减小涡流扩散提高柱效的有效途径： 使用适当小的颗粒，且颗粒均匀的填充物，并尽 量填充均匀。对于空心毛细管柱， A = 0。 A = 2dP 1 2 与颗粒的均匀程度有关及填充的均匀程度有关 2分子扩散项 分子扩散项的系数 B ： B = 2Dg ： 弯曲因子 Dg：组分在气相中的扩散系数 (cm2s-1) 与填充物有关： 对于填充柱， = 0.5 0.7； 对于毛细管柱， = 1.0。 Dg与组分的性质、载气的性质、柱温和柱压等因素有关： 分子量大的组分 Dg小； Dg反比于载气分子量的平方根 , 故采用分子量较大的载气 可使 B项降低； Dg随柱温升高而增大，而随柱压增大而减小 。 B = 2Dg 3传质阻力项 C 传质： 物质因浓度不均匀而发生的迁移过程称为传质 传质阻力： 影响此迁移过程速度的阻力称为传质阻力 传质阻力种类： 包括气相和液相传质阻力，而传质阻 力系数也包括气相传质 阻力系数 Cg和液相传质阻力 系数 Cl C = Cg + Cl 气相传质过程 气相传质过程是待测组分从气液界面移动到气相内 部而后又移动到液相表面的过程。 影 响： Cg与填充物粒度 dp的平方成正比，与组 分在载气流中的扩散系数 Dg成反比。 解决方法： 因此采用粒度小的填充物和分子量小的 气体作载气可使 Cg减小 ,从而提高柱效。 对于填充柱： 气相传质阻力系数 液相传质过程 液相传质过程是指待测组分从气液界面移动到液相内部，发生 质量交换以达到分配平衡，然后又返回气液界面的传质过程。 影 响： 固定相液膜厚度（ df） 和组分在液相 中的扩散系数（ Dl ）。 解决方法： 减小液膜厚度 df，增大组分在液相中的 扩散系数 Dl，均可提高柱效。 液相传质阻力系数 速率理论方程 填料性质： 填料颗粒均匀程度、填料颗粒大小 填充情况 ： 填料在色谱柱中填充均匀程度 流动相 ： 流动相种类和流速 固定相 ： 固定液厚度 公式说明影响 n或 H的因素 结论：范弟姆特方程对色谱分离条件的选择具有指导意义 2.6 分离度 (Rs) 2.6.1 定义 Rs是相邻两组分色谱峰保留值 和 之差与两个组分色 谱峰峰底宽 Y1和 Y2总和的一半的比值 衡量色谱图中相