第二章 基因工程主要技术原理-dna序列分析

基因工程 第二章 基因工程技术原理 第五节 DNA核酸序列分析 返回目录 返回第二章 基因工程 第二章 基因工程技术原理 目的与要求 掌握 DNA测序的一般原理和方法，通过学 习，分析 DNA策序与蛋白质策序的区别。 重点： Sanger双脱氧链终止法策序原理和方法 难点： 如何根据凝胶电泳直接读出 DNA序列 学时： 2学时 学习方法： 课堂讲授与讨论相结合 基因工程 第二章 基因工程技术原理 2.3.1 Sanger双脱氧链终止法 2.3.2 Maxam Gilbert化学修饰法 2.3.3 序列分析自动化 2.3.4 杂交测序 2.3.5 DNA策序的商业运作及存在问题 2.3.6 思考问题 基因工程 第二章 基因工程技术原理 2.5.1 Sanger双脱氧链终止法 60年代末就已掌握了充分的理论知识，只是当时在某些技术能力上和研 究思路上，存在着弱点，阻碍了从理论转变为现实。第一， 如何分离寡 核苷酸片段 ；另一方面，在 研究思路 上都没有摆脱蛋白质序列分析的束 缚。 1965， Cornall大学以 S W Holle， 为首的科学家小组，首次完成 75个核苷酸的酵母丙氨酸 tRNA的全序列测定。即利用各种 RNA酶把 tRNA降解成寡核苷酸，经分离纯化后，再分别测定短片段顺序。 返回 DNA核酸序列分析历程 基因工程 第二章 基因工程技术原理 1968年华裔生物化学 、 生物学家吴瑞博士（ Dr Ray Wu） 独创性地 设计出一种崭新的 引物一延伸测序策略 ，并于 1971年首次成功地测定了 噬菌体两个 COS末端的完整序列； 1977， F.Sanger在该策略的基础上，发展出了快速测定 DNA序列的末 端中止法； K. Mullis采纳他的方法，完善了 PCR扩增 DNA的方法； M Smith发明了碱基定点突变技术。这三位科学家全都获得了诺贝尔 奖。 引物 延伸测序策略 基因工程 第二章 基因工程技术原理 2.5.1 .1 Sanger双脱氧链终止法原理 利用 DNA聚合酶的两种酶 催反应特性： 1、 利用单链 DNA模板，合成 DNA互补 链； 2、 利用 2， 3双脱氧 核苷三磷酸作底物，参入 到寡核酸链的末端，从而 终止 DNA链的生长 。有时 也 称引物合成法 ，或 酶催 引物合成法 。 基因工程 第二章 基因工程技术原理 q反应： 同时加入 引物和 模板、 DNA聚合酶 1、一 种 ddNTP、 以及 四种 dNTP（ 有一种带放射性 标记）。 q变性胶电泳 分离反应混 合物。 q放射自显影术 ，检测单 链 DNA片段的放射性带 。 q结果判读 ，从放射性 X 光底片上，直接读出 DNA的核酸顺序。 考考你：考考你： 反应混合物中，标记什么最方便？ 基因工程 第二章 基因工程技术原理 G T A C G T T G A C G C C ddATPddTTPddGTP ddCTP ddCTP ddATP ddGTP ddTTP A G T C A G G A T C A C C 考考你 基因工程 第二章 基因工程技术原理 酶、原料比例 在实际的 DNA合成反应中，使用 失去了 5 3 核酸外切酶 活性 的 DNA聚合酶 I的 Klenow大片段。适当地调整 ddNTP 和 dNTP的比例，便能够获得良好的电泳谱带模式。 dNTP ddNTP=1： 100时 ，谱带分离效果较佳，可读出多于 200个以上的核苷酸顺序。 降低 ddNTP对 dNTP浓度比 ，会产生逐渐加长的片段，再配 合使用长胶和低浓度的聚丙烯酰氨凝胶，分辨能力可提高到 能判读出 300个左右的核苷酸顺序。 dNTP ddNTP与良好的电泳谱带模式的关系如何？ 基因工程 第二章 基因工程技术原理 2.5.1.2 Sanger双脱氧 -M13体系 DNA序列分析法 引物合成 DNA序列测定法的特点及缺陷 分析 ：这样处理后，能 策得高分子量 DNA 吗？ 为了将这些降解的 DNA片段，按其原来的顺序 “拼排 ” 起来，至少还需要用一种或数种其它内切限制酶，对 同种 DNA作酶切消化，并进行电泳纯化和序列分析。 实际上可行吗？ 高分子量 DNA分子消化降解成一组具一定长度的限制 片段，然后再用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶作电泳 分离纯化，从胶中抽取 DNA片段，供进一步分析。 基因工程 第二章 基因工程技术原理 这些供作序列测定的 DNA片段绝大多数都仅 为数百个核酸 。因此需要用物理方法分离大量的 DNA片段。 费时费钱 ， 因为商品提供的核酸内切限制酶的价格是十分昂贵。为了 保证能够获得所有的限制片段，就需要制备足多数量的 DNA， 而其中有许多步骤都要用不同浓度的凝胶进行电泳 再纯化。在这种纯化过程中，会加剧 DNA的损伤和丢失。 基因工程 第二章 基因工程技术原理 克服缺点的一种途径 DNA分子克隆 将不同限制酶消化切割的 DNA限制片段，随机地克隆到载 体分子上。选用天然的单链 DNA噬菌体，例如 M13作为载 体，重组体噬菌体的 DNA分子，可直接用作模板。 引物 ： 合成的特定的寡核苷酸，或者是从亲本单链噬菌体 DNA 中分离出来的一种限制片段。其 特点是能够特异性地同载体分 子上与克隆位点相连的单链 DNA区段杂交 。称做 “通用引物 ” 。 基因工程 第二章 基因工程技术原理 M13载体克隆 DNA片段 将 DNA片段克隆在 M13mp载体特定位点上，即位于 Lac 区段中含有多克隆位点的多聚衔接物（ polylinker） 内。 重组体噬菌体，在含有 IPTG和 Xgal的培养基平板上形成 白色 的噬菌斑，而非重组体的噬菌体则形成 蓝色 的噬菌斑 。从白色的噬菌班中分离重组体噬菌体，并制备出单链 DNA， 就可以直接按双脱氧链终止法进行序列分析。 基因工程 第二章 基因工程技术原理 当然这种随机的方法，也需要通过顺序的测定将派生的序列拼连起来，恢复成原来结构形式的总 DNA 序列。 基因工程 第二章 基因工程技术原理 使用 M13载体 系列的 优点 所有的待测定的 DNA片段，都可以共用一种引物。这样，就避免了合成 和分离各种不同引物的许多麻烦。 最初使用的引物，是克隆在 PBR322质粒载体上的一种短的限制片段。以 后 J Messing等人（ 1981）发展出了一种更加适用的长度为 15bp的合成 引物，这段引物同 M13的其它位点之间有 低度的同源性 ，后来又合成出了 改进的同 M13其它任何位点 均无同源性 的引物。 现在，应用 M13mp载体系列的双脱氧链终止法，已经成为一种 最普遍采 用的快速 的 DNA序列分析法。 基因工程 第二章 基因工程技术原理 2.5.1.3 Sanger 双脱氧一 pUC体系 DNA序列分析法 自引入 M13载体系列， DNA序列分析又有了 新的改良和发展 。 起初 是使用 Klenow片段， 现在 则可以使用反转录酶或 T7DNA聚合酶。 以往 都是把待测 DNA片段克隆到 M13mp载体上，得到单链模板后，再按 双脱氧链终止法进行序列分析。 现在 ，可以将待测 DNA片段克隆到 质粒 载体上，直接用 闭合环形的双链质粒 DNA按双脱氧链终止法作 DNA序列 分析。这种方法特称为 利用双链质粒 DNA模板的双脱氧 DNA序列分析法 。 由于通常使用的质粒多是 pUC载体系列，所以又称之为 Sanger双脱氧链 终止 -pUC体系 DNA序列分析法。 基因工程 第二章 基因工程技术原理 Sanger 双脱氧一 pUC体系 DNA序列分析法基本步骤 待测 DNA与 pBR322或 pUC分子 重组 ； 转化 ：转化反应物涂布在补加有 Xgal-IPTG选择性培养基平板上， 经 37 过夜培养； 挑选白色菌落， 制备质粒 NA。 碱变性处理 ，与引物一起退火， 然后按双脱氧法作序列分析。 优点 ：无需将 DNA克隆到 M13载 体上，更为简单快速，现已被许 多研究工作者采用。 返回目录 基因工程 第二章 基因工程技术原理 2.5.2 Maxam Gilbert化学修饰法 是 1977年由美国哈佛大学的 A M Maxam和 W Gilbert 发 明的，所以又叫做 Maxam Gilbert DNA序列分析法 虽然说对于大分子量的 DNA片段的序列测定而言，化学修饰 法并不如双脱氧法方便有效，其发展速度也不及后者迅速，但 是至今在相当多的研究工作中仍被采用。 返回目录 基因工程 第二章 基因工程技术原理 2.5.2.1 Maxam Gilbert化学修饰法的原理 化学试剂处理 末端标记 DNA片段 ， 碱基的特异性切割 产生的 DNA片段混合物 ,电泳分离显影后显现谱带，直接读出待测 DNA 片段的核苷酸顺序。 基因工程 第二章 基因工程技术原理 出发材料 ： 局部消化的 DNA分子群体中纯化出特 定的 末端 带有放射性标记的 DNA片段 (双链或单链 ） 关键： 4种核苷酸碱基中，有 1 2种发生特异性的 化学切割仅应，包括 碱基的修饰 、 修饰的碱基从 其糖环上转移出去 以及 在失去碱基的部位发生 DNA链的断裂 三个主要的内容。由于化学切割反 应特异性是由碱基的修饰作用决定的，显然，随 后的切割反应必定是定量的，而且同副反应无关 。 基因工程 第二章 基因工程技术原理 碱基特异的化学切割反应 肼 专用试剂有 硫酸二甲脂 和 肼 。 肼 又叫做 联氨 （ NH2NH2）， 在碱性的条 件下，它能够从 C4和或 C6原子位置作 用于 T和 C两种碱基，并用 C4-C5-C6环化 形成一种新的 5原子环。联氨的进一步作 用释放出吡唑琳酮环 ， 留下的嘧啶碱基的 N1 C2 N3片段则仍然连接在糖环上。 在具有 六氢吡啶 的条件下，通过 -消除反 应 ， 2个磷酸分子便会从糖片段上释放出 来，从而导致在这个核苷酸位置上发生 DNA链的断裂。 反应体系中加入 lmol/L浓度的盐， 肼 同 T 的反应速率便会逐渐下降，以确保发生 C 特异的化学切割反应。根据这一特点区别 C和 C+T之间的降解产物。 基因工程 第二章 基因工程技术原理 硫酸二甲酯（ CH3O） 2SO2 在 硫酸二甲酯 的作用下， DNA碱基环 中的氮原子发生 甲基化反应 （ G N7原 子和 A N3原子）。 中性 PH，甲基化导致配糖键 水解 ，留 下失去碱基的糖片段作为糖一磷酸骨 架上的键。这种键十分微弱，易于通 过碱催化的消除反应使围绕在糖片段 两翼的 磷酸脱落，造成 DNA断裂 。由 于 A N3原子的甲基化比 G N7原子慢， 故 3-甲基 A的配糖键比 7-甲基 G脆弱。 所以前者的水解速率比后者快 4 6倍 。速率上的差别，是早期分析辨别 DNA中的 G和 A的基本依据。最近采 用六氢吡啶同 DNA甲基化反应，而这 种反应对甲基化的 G是特异的。因此 ， DNA链的断裂只在 G发生。 基因工程 第二章 基因工程技术原理 基因工程 第二章 基因工程技术原理 2.5.2.2 化学修饰法测序图解 基因工程 第二章 基因工程技术原理 C T+C G+A A A A C A G T C C T A C C G C T G A A G C A G+A T+C C 试试看 你作对了吗？ 基因工程 第二章 基因工程技术原理 2.5.2.3 Maxam Gilbert化学修饰法优点 不需要体外酶催合成反应 单双链都可以 需要末端标记 两端采用不同的标记，测序可从两端进行 返回目录 基因工程 第二章 基因工程技术原理 2.5.3 序列分析的自动化 返回目录 基因工程 第二章 基因工程技术原理 2.5.4 DNA杂交测序 原理 返回目录 基因工程 第二章 基因工程技术原理 基因工程 第二章 基因工程技术原理 杂交的检测 基因工程 第二章 基因工程技术原理 杂交测序的应用 q检测单碱基的变化 q序列比较分析 q基因的表达状况 q验证其他测序 返回目录