松果菊苷对db-db小鼠肝脏脂质代谢的影响

-精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 1 松果菊苷对 db/db 小鼠肝脏脂质代谢 的影响 摘要 目的 探 松果菊苷 （ECH）对 db/db 小鼠肝脏脂质代谢的 影响及其作用机制。 方法 采用随机数 字表法将 21 只 8 周龄体重 4048 g 的 健康雄性 db/db 小鼠分为 db/db+ECH 组 n = 11，ECH 灌胃 300 mg/（kg d） 和 db/db 组（n = 10，给予相应体积的 生理盐水灌胃） 。以同窝出生的 db/m 小 鼠为正常对照组，即 db/m 组（n = 9， 给予相应体积的生理盐水灌胃） 。每周 检测小鼠的体重。连续干预 10 周后处 死小鼠，留取肝脏组织标本，检测小鼠 肝湿重、睾丸周围脂肪重量，提取肝脏 总 RNA 用实时定量 PCR 检测三组小鼠 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 2 肝脏中过氧化物酶体增殖物激活受体 （PPAR- ）和脂肪酸氧化的限速酶肉 毒碱棕榈酰转移酶-1（CPT-1）的 mRNA 表达水平，肝组织苏木精-伊红 （HE） 、油红 O 染色评价病理学变化。 处死三组小鼠前 1 d 禁食 12 h 后经眼眶 后取血，利用全自动生化检测仪检测谷 丙转氨酶（ALT ） 、天门冬氨酸氨基转 移酶（AST） 、三酰甘油（TG） 、总胆固 醇（TC） 、高密度脂蛋白胆固醇（HDL- C） 、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的 水平。 结果 与 db/m 组比较， db/db 组 小鼠体重、肝湿重、睾丸周围脂肪重量 增加，血清中 ALT、AST 、TG 、TC、LDL-C 升高， HDL-C 降低（P 中国论文网 /6/view- 12954879.htm 关键词 非酒精性脂肪肝； db/db 小鼠；松果菊苷；过氧化物酶体 增殖物激活受体 中图分类号 RR285.5；R589.2 文献标识码 A 文章编号 1673- -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 3 7210（2017）10（b）-0019-05 Effects of echinacoside on liver lipid metabolism in db/db mice TANG Fengjuan1 HAO Yarong1 ZHANG Xue1 QIN Jian2 1.Department of Geriatrics， Renmin Hospital of Wuhan University， Hubei Province， Wuhan 430060， China； 2.Central Laboratory， Renmin Hospital of Wuhan University， Hubei Province， Wuhan 430060， China Abstract Objective To investigate the effect of echinacoside （ECH） on liver lipid metabolism in db/db mice and its mechanism. Methods Twenty-one healthy male db/db mice aged 8 weeks and weighing from 40 to 48 g were divided into db/db+ECH group n = 11， ECH， 300 mg/（kg d） and db/db group （n = 10， given the corresponding volume of saline） by random number table， db/m mice born with same -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 4 littermates were served as normal control group， that was db/m group （n = 9， given corresponding volume of normal saline） . The weight of the mice was measured weekly. The mice were sacrificed 10 weeks after the intervention. The liver tissues were sacrificed and the wet weight of the liver and the weight of the fat around the testes were measured. The total RNA of the liver was extracted and the mRNA of peroxisome proliferator- activated receptor （PPAR- ） and carnitine palmitoyl transterase-1 （CPT- 1） were detected by real-time quantitative PCR. Liver tissue hematoxylin-eosin （HE） ， oil red O staining were used to evaluate pathologic changes. The levels of alanine aminotransferase （ALT） ， aspartate transaminase （AST ） ， triglyceride （TG） ， serum total cholesterol （TC） ， high density lipoprotein cholesterol -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 5 （HDL-C） and low density lipoprotein cholesterol （LDL-C） were measured by automatic biochemical analyzer after fasting for 12 hours and 1 d before the rats were sacrificed. Results Compared with db/m group， the body weight， wet weight of liver and testicular fat around the weight in the db/db group were increased， and the levels of ALT， AST， TG， TC， LDL-C in serum were increased and HDL-C in serum was decreased （P 0.05 or P 0.01） ， liver tissue showed liver cell swelling， vacuolar degeneration， a lot of lipid deposition； ECH intervention could reduce body weight， liver wet weight and testicular fat around the weight of db/db mice， decrease the levels of ALT， AST， TG， TC， LDL-C and increase the level of HDL-C （P 0.05 or P 0.01） ， improve the pathological changes of liver tissue and lipid -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 6 deposition， and up-regulate the expression of PPAR- and CPT-1 in liver tissue （P 0.05）. Conclusion Echinacoside has protective effect on liver of db/db mice， and its mechanism may be related to up-regulating the expression of PPAR- and CPT-1 in liver tissue and improving lipid metabolism. Key words Nonalcoholic fatty liver disease； db/db mice； Echinacoside； Peroxisome proliferator-activated receptor 非酒精性脂肪性肝病是除酒精和 其他明_损肝因素所致的以肝实质细 胞脂肪堆积为主要特征的一系列疾病， 包括肝细胞的脂肪沉积、脂肪性肝炎、 肝纤维化和肝硬化1。近年来随着人们 生活水平的提高，非酒精性脂肪性肝病 已成为最常见的慢性肝病，非酒精性脂 肪性肝病也是肝硬化与肝癌发生的一个 重要原因2-3。非酒精性脂肪性肝病的 有效防治可阻止和改善疾病的进程及预 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 7 后。但对于该病至今尚缺乏有效的治疗 方法，因此，非酒精性脂肪性肝病早期 的发现、诊断和预防工作显得尤为重要。 目前为止，非酒精性脂肪肝尚无 理想的治疗药物，临床上主要使用调血 脂药如他汀类对其进行治疗，但其一方 面毒副作用明显，另一方面会加重脂质 在肝脏中的沉积，容易引起和加重肝损 伤。因此，近年来从植物资源中寻找高 效、安全的天然产物来改善和治疗非酒 精性脂肪性肝病及代谢综合征已成为研 究的一大热点。松果菊苷 （echinacoside，ECH）是从管花肉苁蓉 根部提取分离得到，为管花肉苁蓉的活 性部位苁蓉总苷中含量最高的苯乙醇苷 类化合物4。近年， ECH 在对保护肝 脏、抗炎的药理作用已得到证实5-6。 但鲜有关于 ECH 抗非酒精性脂肪性肝 病的药理作用及其机制研究。本研究通 过给予 db/db 小鼠 ECH 治疗，观察 ECH 对 db/db 小鼠脂质代谢的影响及作 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 8 用机制。 1 材料与方法 1.1 实验动物 遗传背景为 C57BLKS/J 的雄性 db/db 小鼠和 db/m 小鼠由南京大学-南 京生物医药研究院提供SCXK（苏） 2015-0001，分笼饲养于武汉大学人民 医院动物中心（SPF 级） ，每笼 45 只， 室温 1824，相对湿度 60%，每日 光照 12 h，实验期间自由摄食、饮水， 喂养普通饲料，不运用任何降糖药物。 1.2 仪器与试剂 电子天平（METTER TOLEDO 公司） ；全自动显微镜 BX63（日本 Olympus 公司） ；基因扩增仪（美国 ABI 公司） ；实时荧光定量 PCR 检测仪 （7500 序列检测系统） （美国 ABI 公司） ；全自动生化检测仪 AU2700、Image Pro Plus 图像分析系统。 ECH（上海融禾医药科技发展有 限公司，批号 150623） 、4%多聚甲醛 （谷歌生物科技有限公司，批号 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 9 WB1101） 、TRIZOL 试剂（美国 Invitrogen 公司，批号 15596-026） ；油 红 O 染液（上海晶都生物技术有限公司， 批号 JD-0699） ；苏木精染液（深圳市康 初源有限公司，批号 H1328） ；伊红染 液（北京索莱宝科技有限公司，批号 G11002） ；RT-PCR 逆转录试剂盒（日 本 Takara 公司，批号 047A） ；荧光定量 PCR 试剂盒（日本 Takara 公司，批号 820A） 。 1.3 实验动物分组 同窝出生 6 周龄小鼠经检疫 1 周 及适应饲养 1 周。随机编号将 db/db 小 鼠分为两组：令 110 号为糖尿病对照 组（db/db 组，n = 10） ，1121 号为 ECH 治疗组（db/db+ECH 组，n = 11） 。 选取 db/m 小鼠 9 只作为正常对照组 （db/m 组，n = 9） ，于 8 周龄时分别作 如下干预：db/m 组和 db/db 组每日按照 0.05 mL/10 g 体重进行生理盐水灌胃 10 周。db/db+ECH 组按松果菊 300 mg/（kg d）灌胃，共 10 周。每周检 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 10 测三组小鼠体重，观察小鼠的摄食、饮 水以及活动等情况。干预 10 周后用 2% 戊巴比妥钠 0.1 mL/10 g 体重腹腔注射 麻醉小鼠，眼眶后采血，迅速分离血清， 于-80 冰箱保存待测。心脏灌流后， 分离小鼠肝脏，称取肝脏湿重、腹部及 睾丸周围脂肪重量。留取肝脏组织，一 部分用 4%多聚甲醛固定，用于做石蜡 切片病理检查，一部分新鲜组织做冰冻 切边后用于油红 O 染色，剩余的肝脏组 织置于液氮 1 h 后保存在 -80，用于实 时荧光定量 PCR。 1.4 小鼠的一般情况 观察并记录实验期间小鼠的摄食、 饮水、体重、行为和皮毛等一般情况。 1.5 肝功能与血脂水平 用全自动生化检测仪检测血清中 谷丙转氨酶（ALT ） 、天门冬氨酸氨基 转移酶（AST） 、三酰甘油（TG） 、总胆 固醇（TC） 、高密度脂蛋白胆固醇 （HDL-C） 、低密度脂蛋白胆固醇 （LDL-C） 。 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 11 1.6 肝脏 HE 染色和油红 O 染色 HE 染色：处死小鼠后立即分离 肝脏，4% 多聚甲醛中固定 24 h 后，脱 水，石蜡包埋，切片厚度 4 m，进行 HE 染色，在 200光镜下观察肝组织脂 肪变及炎症情况，并行 NASH 评分。评 分标准参照非酒精性脂肪性肝病诊疗 指南7制订的标准。油红 O 染色： 肝脏组织有 OCT 包埋后，行冰冻切片， 切片厚度为 5 m。用 60%异丙醇洗后 再水洗，然后采用油红 O 工作液染色 1 min，60%异丙醇分化 30 s，水洗后以苏 木精染色 30 s，水洗至显微镜下观察清 晰颜色，风干后用中性树脂封片。 1.7 RT-PCR 检测 取各组小鼠肝脏组织 100 mg，Trizol 法提取总 RNA。逆转录成 cDNA 后用 SYBR Green 扩增 cDNA， 每个样本加入 3 个复孔。扩增条件： 预变性 95 30 s；PCR 反应 95 5 s、60 40 s，总共 40 个循环；溶解 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 12 95 15 s、60 60 s、95 15 s。选取 管家基因 -actin 作为内参照，使用 ABI7500 软件 2-CT 法处理数据8 ， 引物序列见表 1。 1.8 统计学方法 研究数据采用 SPSS 20.0 软件进 行统计分析。计量资料数据以均数标 准差（xs）表示，多组资料间比较采 用单因素方差分析，两两比较，方差齐 采用 LSD 法，方差不齐采用 Dunnett-t 检验。以 P 0.05 为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 小鼠的一般情况及 ECH 对小 鼠体重、肝湿重以及睾丸周围脂肪重量 的影响 实验过程中 db/m 组小鼠摄食与 饮水正常，皮毛光滑。与 db/m 组比较， db/db 组和 db/db+ECH 组小鼠水与食物 摄入量增加，活动度降低，皮毛颜色变 黑。db/db 组小鼠在第 8 周时体重是 db/m 组小鼠的近 2 倍（43.341.70）g -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 13 比（21.511.71）g，P 0.01。干预 10 周后，db/db 组小鼠体重明显高于 db/m 组（P 0.01） ，而 db/db+ECH 组小鼠体 重较 db/db 组明显下降（P 0.01） （图 1） 。三组小鼠干预 10 周后肝脏湿重、 睾丸周围脂肪重量差异有高度统计学意 义（P 0.01） ，与 db/m 组比较，db/db 组小鼠肝脏湿重、睾丸周围脂肪重量明 显升高（P 0.01） ，与 db/db 组比较， db/db+ECH 组小鼠肝脏湿重、睾丸周围 脂肪明显下降（P 0.05） （表 2） 。实验 过程中 ECH 治疗组小鼠死亡 1 只（被 咬死） 。 与 db/m 组比较，*P 0.01；与 db/db 组比较，#P 0.05，#P 0.01；ECH：松果菊苷 图 1 ECH 对 db/db 小鼠体重的影 响 2.2 ECH 对 db/db 小鼠血脂水平 以及肝功能的影响 与 db/m 组比较，db/db 组小鼠 TC、TG、LDL 、ALT 、AST 和明显升 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 14 高（P 0.05） ，而 HDL-C 明显降低（P 0.01） 。与 db/db 组比较，db/db+ECH 组小鼠 TC、TG、ALT 、AST 明显降低 （P 0.01） ，HDL-C 显著升高（P 0.01） （图 2） 。 2.3 ECH 对 db/db 小鼠肝脏形态 学的影响 HE 染色显示，db/m 组小鼠肝组 织染色正常，肝细胞排列整齐，胞浆分 布均匀。db/db 组肝细胞体积增大，表 现为肿胀和大小不等的脂滴。中肝叶是 可见炎性细胞浸润的，在肝门区有病灶 性坏死，非酒精性脂肪性肝病活动度评 分 37 分，60%达到非酒精性脂肪性 肝炎的诊断标准（图 3A） 。与 db/db 组 比较，db/db+ECH 组小鼠肝细胞体积减 小，细胞内脂滴减少，炎性浸润减轻 （图 3A） 。油红染色显示，db/m 组小鼠 肝细胞脂滴少，无脂质变性。db/db 组 小鼠肝细胞发生严重脂质变性，观察到 不同大小的脂质空泡，在门静脉区 有显著意义。经 ECH 治疗后小鼠肝细 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 15 胞内脂质沉积明显减轻（P 0.01，图 3B） 。 2.4 ECH 对 db/db 小鼠肝脏组织 中 PPAR-和 CPT-1 的 mRNA 表达水 平的影响 应用 Takara RT-PCR 反应体系进 行 mRNA 定量检测发现：db/db 组小鼠 肝脏组织 PPAR-和 CPT-1 水平显著低 于 db/m 组小鼠（P 0.01） ；经 ECH 治 疗 10 周后，小鼠肝脏组织 PPAR-和 CPT-1 表达水平较 db/db 组明显升高（P 0.05） 。见图 4。 3 讨论 非酒精性脂肪性肝病是代谢综合 征的肝脏表现，与肥胖、高脂血症、2 型糖尿病等多种因素密切相关9。非酒 精性脂肪性肝病与高尿酸血症以及痛风 也密切相关10 。本研究所研究的动物 db/db 小鼠是由于在瘦素受体基因中发 生异常的剪接导致瘦素受体发生缺失突 变而产生肥胖、高血糖、高胰岛素、脂 肪肝等表现，常用于非酒精性脂肪性肝 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 16 病的实验研究11 。 本研究利用 ECH 给予 db/db 小鼠 灌胃治疗，观察 ECH 对糖尿病小鼠肝 脂质代谢的影响，结果显示，db/db 组 小鼠血清中 TC、TG、LDL- C、ALT、AST 显著高于 db/m 组，血 清 HDL-C 显著低于 db/m 组；病理检查 显示，db/db 组小鼠肝脏组织出现细胞 肿胀、空泡变性、脂质沉积和炎症细胞 浸润。与 db/db 组小鼠比较， db/db+ECH 组小鼠血清 TC、TG、LDL- C、ALT