apob基因多态性研究的意义

1.材料和方法 1.1 材料 EcoRI、 PCR 扩增引物序列均参照 Gajra B 等 1，MspI 位点的 PCR 扩增引物序列参照 Soria LF2，3VNTR 的 PCR 扩增引物序列参照罗超权等 3，引物的序列如下（由上海铂尚 生物技术公司合成）： EcoRI 5primer：CTGAGAGAAGTGTCTTCGAAG 3primer：CTCGAAAGGAAGTGTAATCAC MspI 5primer：CTGAGAGAAGTGTCTTCGAAG 3primer：CTCGAAAGGAAGTGTAATCAC 3VNTR 5primer：CTGAGAGAAGTGTCTTCGAAG 3primer：CTCGAAAGGAAGTGTAATCAC 模板 DNA:健康人口腔黏膜上皮细胞 16 份(来源随机抽取健康.) PCR MIX（Taq1.25U,dNTP 各 0.4mM,2PCR Buffer） EcoRI 酶切体系（10 l PCR 产物、18 l 双蒸水、2l EcoRI 酶切 Buffer、1 l EcoRI 限制内 切酶（10U/l） ） MspI 酶切体系（10 l PCR 产物、 18l 双蒸水、2l Msp I 酶切 Buffer、1 l MspI 限制内切 酶（10U/l） ） dNTP、抽提缓冲液（100mM Tris，50mM EDTA，200mM NaCl，0.5% SDS，200ug/ml 蛋 白酶 K，pH 8.0)、酚：氯仿( 1：1) 、氯仿：异戊醇( 24：1)、乙醇、70%乙醇、TE 缓冲液 仪器：凝胶成像系统、BG-Power300 电泳仪、ZD-600 标准水箱、小型台式告诉冷冻离心机、 Hema3200 基因扩增仪、0826 微型离心机 1.2 方法 1.2.1 口腔粘膜上皮细胞基因组 DNA 的提取 将生理盐水漱口液 10ml 转移至 15ml 离心管，8000rpm 离心 10min。倒出上清，管内 白色沉淀即为口腔粘膜上皮细胞。用酚/氯仿提取法从外周白细胞提取基因组 DNA：将口 腔粘膜上皮细胞细胞重悬于 0.5 ml 抽提缓冲液, 65水浴 30 分钟, 依次加入等体积的酚： 氯仿( 1：1) 和氯仿：异戊醇( 24：1) , 分别抽提 1 次。DNA 用乙醇洗淀并经 70%乙醇洗 涤后室温干燥, 加入适量 TE 缓冲液溶解，-20保存备用。 1.2.2PCR 扩增 PCR 扩增反应体系如上，扩增程序分别如下： EcoRI ：94预变性 7 min ； 94 变性 1 min, 58 复性与延伸 3 min, 进行 30 个循 环；最后 72 再延伸 5min。 MspI：94预变性 7min；94 变性 1 min, 60 复性 1 min, 72 延伸 1 min，进 行 30 个循环；最后 72 再延伸 5min。 3VNTR：94预变性 7 min，94变性 1 min，60退火及延伸共 4 min，进行 30 个 循环，最后 60再延伸 10min。 1.2.3 基因多态性的检测与分型 EcoRI 酶切位点：通过 PCR-RFLP 技术检测，先建立 31 l 酶切体系，混匀后 37酶切 12 小时，65 加热 20min 终止反应。2%琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，凝胶成像仪拍照 电泳结果。 MspI 酶切位点：通过 PCR-RFLP 技术检测，先建立 31 l 酶切体系，混匀后 37酶切 12 小时，80 加热 20min 终止反应。2%琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，凝胶成像仪拍照 电泳结果。 3VNTR：PCR 产物经 2%琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像仪拍照电泳结果，然后通过软 件计算 PCR 产物的分子量。apoB 3VNTR 序列由两端 152 个保守序列和中间以 15bp 核心序 列多次重复组成，核心序列重复次数由以下公式估算获得：（扩增片段 bp 数152 bp）/ 15bp 。 2.结果 2.1 apoB 3VNTR 多态性 16 个样本 DNA 经扩增后均出现 1-2 条带（纯合子为 1 条带，杂合子为 2 条带） ，其中 11 个样本为杂合子，5 个样本为纯合子。共检出片段大小不同的 21 条带（如图 1） 。以 15bp 为一重复单位，重复次数为 31-57 次。其中以 35-36 次较多，占 40.7%（见图 2） 。而 38 次以上和 32 次以下出现频率较低。 图 1.apoB 基因 VNTR 电泳图 图 2.apoB 基因 VNTR 重复次数频数分布表 2.2 酶切位点多态性 2.2.1 EcoR I 酶切位点多态性 apoB PCR 产物酶切后可见两种基因型：12 个样本有 253 bp、227 bp 两条碱基片段，是 E+ E+型纯合子； 4 个样本有 480bp、253 bp、227 bp 三条碱基片段，是 E+ E-型杂合子；未 见有 480 bp 一条碱基片段的 E- E-纯合子。 （见图 3） 图 3.apoB 基因 EcoR I 酶切电泳图 注：2、5 、8、10、11、12 、 13、16、17、18、20、21 泳道为 E+ E+型，3、4 、9、19 泳道 为 E+ E-型，6 、14 、22 泳道为 PCR 产物未酶切的对照。 2.2.2 MspI 酶切位点多态性 apoB PCR 产物酶切后可见两种基因型： 12 个样本有 395 bp、85 bp 两条碱基片段，是 M+ M+型纯合子；3 个样本有 480 bp、395 bp、85bp 三条碱基片段的是 M+ M-型杂合子， 未见有 480 bp 一条碱基片段的 M- M-型纯合子（见图 4） 。其中有一样本未见条带。 图 4.apoB 基因 MspI 酶切电泳图 注：2、5 、6、9、10、11、12、13、16、17、18 、19 泳道为 M+ M+型，3 、4、20 泳道为 M+ M-型， 7、14、22 泳道为 PCR 产物未酶切的对照，21 泳道未见条带。 3.讨论 apoB 是人类重要的载脂蛋白，其基因独立位于 2 号染色体短臂末端（2p23） ，单拷贝。基 因全长 43kb，含 28 个内含子和 29 个外显子。本次实验主要探究了人群当中 apoB 基因 3端 VNTR 的多态性，以及 EcoR I、MspI 两种酶切位点的多态性。 本次实验中 PCR 法检测 apoB 基因的多态性有以下特点: 时间短,一天内可获得结果;反应 灵敏, 使用的样本量极小;实验操作简单方便; 实验要求条件低和设备易得.从实验结果看, VNTR 基因的多态性不仅由短重复序列的数量形成, 还由同一等位基因中多种核苷酸排列顺 序造成.而本实验中,不同样本的酶切位点多态性提示 apoB 基因的多态性由多个等位基因构 成.有相关研究证明 apoB 基因多态性遗传遵循孟德尔定律 10.故本次实验的方法是一种可 靠的有应用前景的个体识别和亲权鉴定的方法. 有相关研究表明，携带长段 apoB 基因 3端 VNTR 的人群相较于携带中段或小段 apoB 基 因 3端 VNTR 的人群拥有更高的胆固醇含量，LDL 和 apoB 的浓度也更高。 【1】脂代谢的 平衡又与多种疾病相关，有研究就表明拥有长片段 apoB 基因 3端 VNTR 的人群换上胆石 症的几率更高， 【2】也有更大的可能性换上冠心病。 【3 】 (伟哥的参考文献) 另外, 它有明显的人群和地域性差异14. 自从 1989 年 Ludwig2首先检测到 14 种等位基 因以来，国际上已发现了 20 多种等位基因，其中 7 种仅见于黑种人，分别是 HVE21，HVE24，HVE25，HVE27，HVE29，HVE31 和 HVE33。其余的可在白种人和黄种人中 发现。Hixson 等7分析结果表明，黑种人 apoB3VNTR 等位基因的分布形式不同于白种 人，其特点是，小于 HVE33 或大于 HVE37 的等位基因频率而高于白种人 (P0.001)。但是， 不同地区白种人的相对分布和频率极为相似8 。瑞典人和高加索人 HVE36 最高，而南亚 人则以 HVE34 最高。相比之下，本次实验中汉族人群 HVE36 的基因频率较低。 以上研究 证明 apoB 基因 3VNTR 等位基因的多态性分布可为人类起源/进化/迁徙等人类学研究提供 资料. 10畲族人群载脂蛋白 B（apoB）基因多态性遗传规律的研究 11ApoB 基因多态性与北京房山地区汉族人群脑卒中相关性分析 12载脂蛋白 BEcoRI 基因多态性与中青年人颈动脉粥样硬化的关系 13ApoB 基因多态性与乳腺癌的相关性研究 14血浆载脂蛋白 B 基因 3_端可变数目串联重复序列的结构研究_杜珙 2 Ludwig EH, McCarthy BJ. High resolution analysis of a hypervariable region in the human apolipoprotein B gene. Am J Hum Genet, 1989, 45:458-464 7 Hixson JE,