pcr扩增失败的原因分析

PCR扩增失败的原因分析 2010-12-13 16:48:31| 分类： 默认分类 |字号 订阅 PCR 扩增失败原因分析，PCR 产物电泳 2010-05-15 16:07 一 模板质量问题： 1）模板提取不完整，其中不含你的目的基因，或目的基因含量太低。 可以跑个电泳看看提取的 DNA，PCR 阳性样品与阴性样品是否有明显差别。如果 确定是这种问题，可以增加模板量试试，但不一定行得通。 2）模板里面残留某种试剂成份，可能抑制 Taq 聚合酶的活性，如果是这种情况， 可以用试剂盒把模板再纯化一下，或将模板做个梯度稀释以确定最佳的模板量。 3） 为什么跑电泳会出现拖带呢？ 1. 有可能的因为你的电压调的太高了。电泳跟很多因素有关，其 中就有一个是电压，在适当的电压范围内增加是可以加快迁移速率，但是要是 超到一个临界值反而有害。你可以适当的调低点看看。 2.有时候发现上样量太多的话会有拖带。你看能否回收之后 ，按 1:50 或 1:100 等稀释后，再当成模板扩一次怎么样。 二 引物问题 1）样品自身的基因型差异导致扩增失败。也就是说你的引物与某些基 因型的样品结合的好，而和另一些基因型结合不好。可以换一对更保守的引物 试试。祝顺利！ 2）普通 PCR 所用的一对引物中有一个引物加多了，为正常的三倍只 要引物特异性比较好，那么不会产生大的影响。如果恰巧是加多的这条引物不 是很特异的话，也许会扩出来非特异带。 在制备单链探针时候就采取这样的不对称 pcr，没关系的 三 Taq 酶处于失活状态。因为活性降低了能出现二聚体。 tap 酶种类 高特异性 Taq 酶 高度特异性地扩增所需的片段是 PCR 最基本的要求，影响 PCR 特异性的因 素很多，包括模板、引物性质及质量、反应条件的控制等等，而高特异性 Taq 酶的出现大大减少了摸条件这一繁琐的实验过程，也为 PCR 产物快速有效的纯 化（PCR 产物直接纯化）打下了基础。这类酶最典型的代表是热启动 Taq 酶。大 家都知道，在 PCR 第一个循环变性之前，有一个升温的过程，引物和模板会有 一些非特异性配对，如果这时 Taq 酶发挥活性，就很容易产生非特异性扩增， 由于循环初期模板量非常少，产生的非特异性条带经过后面的指数扩增，就会 严重干扰目的片段的扩增，甚至导致特异性条带不能扩出。而热启动 Taq 酶是 必需经过高温才能激活的酶，因此在初始循环的变性之前它没有活性，不会产 生非特异性扩增，这就大大提高了 PCR 扩增的特异性。第一代热启动 Taq 酶往 往直接在 Taq 酶上做一些修饰，比如用抗体抑制，蜡封等，如 Clontech、Stratagen、Gibcol-LTI 的一些产品，由于抗体、蜡等异物的掺入， 对实验造成一定的影响，也给试验者带来一些不便。新一代的热启动 Taq 酶是 通过内部改造的重组酶，真正实现便利的热启动，代表产品如 QIAGEN 公司的 HotStar 系列，无需别的辅助抑制物，也不用担心抑制不稳定，使用起来方便、 高效。此外，由于几乎所有的 Taq 酶产品都带有相应的反应缓冲液，缓冲液的 品质也对保证 Taq 酶特异性扩增起着不可忽视的作用，一般的缓冲液中调节 H 键作用的盐只有 KCl，QIAGEN 公司的缓冲体系通过 KCl、(NH4)SO4 盐离子体系 的平衡调节也提高了酶作用的特异性。 此外，热启动的 Taq 酶也是实现一步法 RT-PCR 的基础。如 QIAGEN 公司 的 OneStep RT-PCR 试剂盒，在 RT 反应较低温度下，Taq 酶没有活性，逆转录酶 发挥活性；RT 反应结束，高温灭活逆转录酶的同时，激活 Taq 酶，进行 PCR 反 应。另一家公司 Epicentre 有一种 MasterAmpTM Tth DNA 聚合酶，本身就具有 逆转录酶活性，也可用作 RT-PCR。 高保真 Taq 酶 下游应用为基因筛选、测序、突变检测，分子诊断等等的用户，往往对 PCR 保真性要求很高，保真性的一个通用标准是错配率，错配率越低保真性越好。 普通 Taq 酶的错配率在 2-5X10-5 碱基/循环数，而高保真 Taq 酶错配率可达 10- 6 数量级，大大降低了出错的可能。其原理主要是因为高保真 Taq 酶具有 3到 5核酸外切酶（Proofreading）的活性，扩增途中如果产生了错配的碱基，它 可以将其切掉，从而保证了扩增的准确性。需要提醒用户的是由于此酶具有核 酸外切酶功能，往往扩增效率低一些，有的还容易降解引物，且产物一般不宜 用 TA 或 UA 克隆法克隆。目前市面上主要有两类产品，一类是混合型的高保真 酶，将带有 Proofreading 活性的酶与普通 Taq 酶（用于提高扩增效率）混合起 来，错配率在 8-9 X10-6 碱基/循环数。Clontech、LTI 等公司都有此类产品。 如果要求更高的保真度，就要选择单一型的高保真酶，如 Stratagene 的 Pfu，NEB 公司的 Vent DNA 聚合酶，错配率 5.7 X10-5 碱基/循环数；QIAGEN 公 司新推出的 ProofStart DNA 聚合酶，兼特异性与保真性于一体，其聚合酶及 Proofreading 活性都为热启动，可避免引物降解，错配率达 2-410-6 碱基/循 环数，加上优化的反应体系，可在室温下配置反应液，可进行复杂模板（高 GC 含量、二级结构）及长片段的扩增，的确是这类酶中的佼佼者。 高耐热性 Taq 酶 对于有些模板变性温度较高，需要时间较长的用户，可能要求高耐热性 Taq 酶，这里介绍 NEB 公司的 Vent 和 Deep Vent DNA 聚合酶系列，两者都是从海底 火山口分离出来后克隆的，是普通 Taq 酶耐热性的三倍以上，前者在 95半衰 期近 7 小时，100近 2 小时；后者更甚，分别为 23 小时和 8 小时。 超长片段扩增 Taq 酶 对于作基因组图谱、测序及分子遗传学研究的用户，可能会用到超长片段的 扩增，Clontech 公司的 Advantage Genomic 系列混有 Tth DNA 聚合酶， Proofreading 酶和热启动抗体，对复杂模板可扩增 10kb 片段，简单模板可达 40kb。 关于复杂模板的扩增 对于模板结构复杂，如 GC 含量高（60%），有二级结构等，普通的 Taq 酶 可能难以延伸下去，加入 DMSO 等助熔剂可帮助扩增顺利进行，但 DMSO 有毒， 而且用量需要优化。QIAGEN 公司的任何一种 Taq 酶都附有特制的 Q-溶液，操作 方便、安全，对复杂模板的扩增特别有效。 关于条件的优化 现下很多著名的生物试剂公司都提供优化的缓冲液，如 QIAGEN 公司的缓冲 体系，对温度和 Mg2+的耐受性很强，随试剂盒有推荐的操作手册，大大减少了 反应条件的优化，如果结合好的引物设计软件和高质量的模板引物，一次成功 率极高。但任何东西都不是万能的，如果碰到比较特殊的情况，还需要仔细分 析，优化调整。 以上就 Taq 酶的一些基本分类分别进行了介绍，具体选购时要根据实验 需要择其重点，再参照其他参数，才能选到最合适的 Taq 酶。我们会及时将最 新的技术和产品推荐给大家，希望能帮助大家更快更好的达到实验目的。 四.模板浓度过低。 五、.退火温度过高。有可能，可以做个梯度 PCR 试一下。 六、循环次数过少或延伸时间过短以致目的基因扩增量不够。这个可能性 不大。 七、dNTP 浓度 低时 PCR 产率及特异性均增高，适合于用扩增掺入法标记生物素及放 射性元素。当 100l PCR 液中含 dNTP 各 40mol/L 时就足以合成 2.6g 的 DNA（dNTP 消耗一半）,所以,你不小心多加了 4 倍的量,会很影响 PCR 结果,即 Taq 酶活力要降低 2030%，即底物抑制。 八、PCR 产物电泳 1.电泳图不清晰，可能电泳缓冲液和制胶缓冲液浓度不准或者脏了吧。换 新的电泳缓冲液和制胶缓冲液试试。 marker 都出问题说明是你的胶的问题，或者电泳操作的问题。 2. PCR 扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶 量过多或酶的质量差，dNTP 浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次 数过多引起。 如下图： 其对策有： 减少酶量，或调换另一来源的酶。 减少 dNTP 的浓度。 适当降低 Mg2+浓度。 增加模板量，减少循环次数。 3.如何获得亮的电泳条带 PCR 反应前 5 个循环可以降低退火温度 5，后面 30-35 个循环恢复 正常退火温度。也可以以第一次 PCR 的产物作为二次 PCR 的模板。 DNA 测序常见问题分析及解决办法总结 常 见问题 具 体情况 可能 的原因 处理办法 备 注 抗性 不对或菌 已死 核对抗性，尽可能提供载 体信息。 菌 培养不 好或失 败 或菌 培养条件 特殊 重新提供菌液，或提供 2ug 纯化质粒。 质粒 拷贝数极 低或 质 粒提不 出 培养 方式不当 客户自己采取大量提取的 方法提供 2ug 纯化质粒。 低拷 贝数质粒 或 质 粒产量 很低 培养 方式不当 客户自己采取大量提取的 方法提供 2ug 纯化质粒。 是否 为电泳法 定量， 质粒：电泳检测浓度大于 100ng/ul，体积大于 20ul。 样 品准备 问题 自 带质粒 或已纯 化 PCR 产物量 极低 总量 是否足够 已纯化 PCR 产物：根据片 段长度提供足够量的模板，一 般要求是 100ng/反应/Kb，进行 多个反应的应相应增加量。 测 OD 值法 不可靠, 电泳检 测 重复 序列，如 polyT、p olyA 或 几个碱基 重复 用反向引物测互补链。 测 序出现 双峰或 信号中 断 双 峰 质粒 测序在插 入序列中 出现套峰 可能是样品非单克隆，挑 其他克隆测序。 此 类问题 主要与 样品有 关 PCR 产物测序 中，某一 点后序列 变乱 可能是存在移码突变，这 是正常的，也可以克隆后测序。 PCR 产物中一 个或多个 位置有套 峰 序列中存在突变，这是正 常的，也可以克隆后进行测序。 PCR 产物测序 前部分双 峰 引物二聚体污染或产物不 纯，克隆后测序。 质粒 测序时整 个结果双 峰 引物特异性不好，序列中 存在通用引物的同源序列；改 用其他引物测序。 质粒 和 PCR 产 物测序出 现双峰 引物不纯，测序时只要单 一引物，请不要将双向 PCR 引 物混合；合成的引物没有纯化， 或纯化不好。重新合成引物测 序。 模板 GC 二级 结构区后 难以得到好的测序结果， 亚克隆成较小的片段进行测序 模板 GT 二级 结构区后 测反向互补序列，AC 结构 不影响测序 严重 的重复结 构 测反向互补序列 信 号迅速 衰减或 中断 模板 根据具体情况决定 特性决定 的 模板 质量差 重新提供菌液或纯化 PCR 产物 质粒 样品：引 物不符 尽量提供载体详细信息， 核查引物 引物 不适宜测 序 测序引物比 PCR 引物要求 高，随机引物和简并引物不能 用于测序，较长的 PCR 引物也 不能用于测序。重新设计引物 测序，对 PCR 产物而言建议克 隆到载体上用通用引物进行测 序 质粒 产量极低 客户自己提供 2ug 纯化好 的质粒 信 号极弱 或无信 号 PCR 产物定量 极低 重新电泳检测已纯化的 PCR 产物，确认有足够的量，或提 供 PCR 原液由公司进行纯化 质粒 模板 检测是否为空载体，从其 互补链上寻找，克隆位点离测 序引物太近，长插入片段未测 通。 找 不到引 物 PCR 模板 不可能找到所用的测序引 物，短片段可以从互补链上找 到另一段的引物，长片段由于 测不通，无法找到相应序列想 得到全序列，短片段可以从两 端进行测序，长片段需要经克 隆后进行测序。 测 序结果 正常， 与预期 不符 结 果完全 不对 请提供详细资料我们会根据结果具体 分析。 测序常见问题分析 序列中出现 N 值的常见原因： 通常有以下几种情况将造成测序结果中 N 值较多： PCR 产物直接进行测序，在 PCR 产物长度以后将无反应信号，机器将产生 许多 N 值。通常我们很容易辨别 PCR 产物结束的位点，PCR 产物测序一般 末端的一个碱基为 A（绿色峰），这是由于 Taq 酶能够在 PCR 反应的末端 非特异性地加上一个 A 碱基，我们用 T 载体克隆 PCR 产物就是根据该原理 的。在最后一个碱基 A 后，信号会迅速减弱。因此我们要根据序列正确判 断出 PCR 产物的末端序列，在此序列以外就不是我们所要的序列了。 在序列的起始端有时会有一些 N 值。该种情况主要是有未去除的染料单体 造成的干扰峰。该干扰峰和正常序列峰重叠在一起，有时机器将无法正确 判断出为何碱基。有时，在序列的起始端的小片段容易丢失，导致起始区 信号过低，机器有时也无法正确判读。现在公司已采取了有效措施，序列 起始区的信号已大为改善，有时几乎第一个碱基就可以正确读出，染料的 干扰问题基本解决。但是客户提供的 PCR 引物用于测序时，有时会产生引 物二聚体，对测序的起始区造成干扰。 在序列的 3端容易产生 N 值。一个测序反应一般可以读出 900bp 以上的 碱基，但是，只有 550bp 以前的碱基是可靠的，理想条件下，多至 700bp 的碱基都是可以用的。一般在 650bp 以后的序列，由于测序胶的分辩率问 题，会有许多碱基分不开，就会产生 N 值，这种情况下产生的 N 值是无法 避免的。现在我们只承诺正常情况下每个测序反应至少读出 500 个碱基的 有效序列。 测序模板本身含有杂和序列，该种情况主要发生在 PCR 产物直接测序上。 由于 PCR 产物本身有突变或含有等位基因，就会造成在某些位置上有重叠 峰，产生 N 值。可以很容易判断该种情况，那就是整个测序信号都非常好， 只有在个别位置有明显的重叠峰，视杂和度不同 N 值可能有多有少。该种 情况明显是客户的样品问题。通过将 PCR 产物克隆后进行测序，可以解决 该种情况的 N 值问题。 由于模板质量问题或测序不好，所得的序列结果较差，也会产生许多 N 值。 一般情况测序结果不好的，我们都会根据具体原因尽量加以解决。有些实 在无法解决的也就没有办法了。 针对有 N 值的情况，我们一定要根据具体情况具体分析。很多情况下 是客户自己的模板原因造成 N 值，在这种情况下我们没有必要为客户承担 测序失败的损失。有许多情况下由于客户的原因造成的测序失败，我们至 少要让客户知道是客户本身的原因而不是我们的技术问题。 我为什么找不到我的 PCR 引物？ 以下几种情况，我们将无法找到做 PCR 时的引物序列： 用 PCR 引物作为测序引物进行测序时，所测序列是从引物 3末端后第一 个碱基开始的，所以自然就找不到您的引物序列了。有两种方法可以得到 您的引物序列。对于较短的 PCR 产物（600bp），可以用另一端的引物进 行测序，从另一端测序可以一直测到序列的末端，就可以在序列的末端得 到您的引物的反向互补序列。对于较长的序列，一个测序反应测不到头， 因此就只能将您的 PCR 产物片段克隆到适当的载体中，用载体上的通用引 物进行测序。由于载体上的通用引物与您的插入序列之间还有一段距离， 因此就可以得到您的完整的引物序列。由于在测序的起始端总会有一些碱 基无法准确读出，因此，您如果想得到您的 PCR 产物的完整序列，最好克 隆后进行测序。 PCR 产物用 T 载体克隆后，由于克隆的方向是随机的，因此，当您在一条 链上找不到您的引物序列时，试图在互补链上寻找您的引物序列。 当测序引物离您的插入片段很近时，有时可能也无法找到您的引物的全序 列。这主要是因为有时测序的起始端由于未去除的染料或引物二聚体的干 扰，造成起始区的序列不好，可能无法找到您的引物完整序列。 有时，质粒做模板进行测序时，由于某些原因，质粒上没有插入外援片段， 为空载体，所测的序列完全为载体序列，此时自然也找不到引物序列。 我的基因序列与标准序列为什么有差别？ 一段基因序列经扩增后，克隆到载体中进行测序。在两个层次上可能 导致序列发生变化。首先在 PCR 扩增过程中就可能产生错误。将片段克隆 到载体中也有可能发生突变。其次，测序的准确率问题。ABI 公司承诺其 仪器的测序精度在一定范围内可以达到 98.5%以上。由于仪器准确率的限 制，在一个较长的序列中发生碱基序列错误是难以避免的。在确认克隆无 误的情况下，通过双向测序可以最大限度减少测序的错误。您如果想得到 您的最准确的序列，进行双向测序是很有必要的。只进行简单的单向测序， 我们无法保证所测序列的完全准确性，这是由仪器的精度决定的。 过短的 PCR 产物为什么不适于直接测序？ 首先过短的 PCR 产物纯化困难，一般的 PCR 产物纯化试剂盒都要求 PCR 产物片段大于 200bp，过短的 PCR 产物纯化和准确定量都非常困难。 因此我们要求用于测序的 PCR 产物一般不低于 200bp 长度。 其次，由于测序本身的限制，以一个 100bp 的 PCR 产物用于测序为例， 去掉两个引物的序列大约 40 到 50bp，再加上测序起始端的一些读不出的 碱基，真正能够得到的有用序列不过 3040 碱基。这么少的序列很难向 客户收费。上面是在最理想的条件下的假设，稍不顺利，测序就失败了。 因此，过短的 PCR 产物，只能克隆后进行测序。 用测序的方法检测点突变可靠吗？ 有的客户想用测序的方法检测点突变体，我认为该方法可靠性不高。 主要有以下两个原因。首先，我们并不清楚突变的序列与正常的序列的比 例是多少。测序反应的信号强度直接与模板的量有关，如果突变的模板所 占的比例很少，将直接作为背景噪音了，很难检测出来。只有当测序反应 体系中正常的和突变的模板量比较接近时，才能较可靠地检测到突变体的 存在。其次，在同一位置，不同碱基的信号强渡一般是不一样的。这样即 使突变的模板所占的比较较高时，也不一定能准确检测到突变的存在。另 外，测序仪是设计用来测序正常的碱基序列的，软件在对扫描的结果进行 处理时，会尽量提高主峰而将背景信号尽量压低，以得到尽可能好的结果。 因此，当某处出现双峰时，测序仪一般会认为信号弱的峰为背景信号，在 处理过程中，将弱的峰进一步压低，这样根部不立于突变体的检测。因此 认为，用测序的方法检测突变体的存在不是一个好的方法。 与测序引物有关的问题： 对于通用测序引物，只要正确使用，一般不会有太大问题，测序引物 问题主要发生在客户自己提供的 PCR 引物上。应该明确的一点是并不是所 用的用于 PCR 的引物都可以用来作测序，以下几种 PCR 引物将是不适合用 作测序引物的： 简并引物， 简并引物必然要在测序模板上有多个结合位点，直接影响测序结果。 随机引物，如 RAPD 引物， 随机引物一般都比较短，所用退火温度低，在测序反应的条件下，不 能很好地与模板结合。 过长的引物，一般要求测序引物不大于 24bp，最长不能超过 30bp。 过长的引物在测序反应的较低的条件下容易在测序模板上有多个结合 位点，导致测序结果背景增高。另外，较长的引物纯度也将难以保证。通 常用于测序的引物纯度要在 90%以上，引物纯度低时，测序反应的背景将 明显增大，直接影响到测序结果。 有特殊标记的引物， 该情况主要指荧光标记的引物。我们测序反应的四种碱基都是荧光标 记的，这样，荧光标记的引物将产生干扰。另外，其他一些有大的标记基 团的引物也最好不要用于测序。引物上大的标记基团将直接影响到 DNA