pcr技术的发展前景及特点——张影影

PCR技术的发展前景及特点 摘要：PCR技术是遗传与分子生物学分析的根本性基石，近年来基于常规PCR技术开发出了许多 新的用途。本文主要阐述PCR技术的发展扩展及特点。 关键词：PCR技术 引言 PCR即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延 伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。 现已被广泛应用于农学、植物病理学等领域的研究。最初的PCR技术相当不成熟,但在随后 的几十年里，PCR技术被不断改进。它从一种定性的分析方法发展到定量测定；从原先只能 扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片断到目前为止，PCR技术已有十几 种之多。本文对其近年来的主要扩展及应用进行综述。 1 .PCR技术的扩展 1.1 AP-PCR技术 1.1.1 AP-PCR技术的定义、来源及特点 AP-PCR技术，是指在对所扩增基因顺序一无所知的情况下，主观上随意地设计或选择 一个非特异引物进行PCR扩增，反应在不严格条件下扩增至数轮后，再于严格条件下进行。 通过比较扩增产物的指纹图，即可反映出待分析基因组的特征。AP-PCR技术由Williams等于 20世纪 90年代建立，它可以快速地从两个或更多的个体组织细胞中分离出差异基因或基因 差异表达产物，具有简单、灵敏、有效和重复性好等特点。 1.1.2 AP-PCR技术的应用 AP-PCR技术是常规PCR技术在差异基因分离方面的扩展，主要应用在：(1) 差异基因的 分离；(2)菌株鉴定； (3)遗传作图。 1.2 LP-PCR和彩色PCR 1.2.1 LP-PCR和彩色PCR的定义 LPPCR：即标记PCR，它是指利用同位素、荧光素等对PCR 引物5 端进行标记，通过 PCR反应扩增，来检测目的基因存在与否。 彩色PCR是指利用荧光染料标记引物的5端，不同荧光荧光染料 TAMRA呈红色荧光， JOE和FAM呈绿色荧光,COUM 呈蓝色荧光)标记的引物同时参加反应, 经PCR反应扩增后，根据 不同荧光的色泽来判断目标基因是否存在及扩增基因的类型。 1.2.2 LP-PCR和彩色PCR的比较 LP-PCR与彩色PCR由荧光PCR那发展而来，彩色PCR是LP-PCR的一种。与常规PCR相比， LP-PCR更为直观, 其省去了限制性内切酶酶解及分子杂交等繁琐步骤，并且一次可以同时分 析多种基因成分，但是LP-PCR 只能对产物进行定性鉴定。与 LP-PCR相比，彩色PCR 通常需要 2种不同颜色的引物：一种作为基因检测引物；另一种作为控制条件的内对照。但是在检测 多点突变时，彩色PCR需用更多的色彩。 1.2.3 LP-PCR和彩色PCR的应用 LP-PCR和彩色PCR是常规PCR技术与标记技术相结合的产物，LP-PCR常被用于大量临床 标本的基因诊断，同时可用于对PCR产物进行定性鉴定。彩色PCR常被用予检测基因的突变， 染色体重排或转位，基因缺失及微生物的型别鉴定等，如被用于检测多突变点的遗传病。 1.3免疫PCR技术 1.3.1免疫PCR技术的定义、来源及特点 免疫PCR是利用抗原抗体反应的特异性和PCR扩增反应的高灵敏性而建立的一种微量抗 原检测技术，它综合了同相免疫反应和PCR的特点。免疫PCR技术是1992年Sano 建立的一种 检测微量抗原的高灵敏度技术。与常规PCR及普通ELSA相比，免疫 PCR优势明显，具体表现 为：灵敏度增加，可以同时进行多种抗原/半抗原检测，有更宽的线性范围。 1.3.2免疫PCR技术的应用 免疫PCR技术是常规PCR技术在医学免疫学领域的主要扩展。它常被用于：(1)激素和细 胞因子的检测；(2)生化酶类的检测；(3) 致病微生物的检测； (4)寄生虫感染的检测；(5) 其他 毒素或蛋白的检测。 1.4原位PCR技术与原位反转录PCR技术 1.4.1原位PCR技术与原位反转录PCR技术的定义 原位PCR技术将PCR高效扩增与原位杂交的细胞定位相结合，在组织细胞水平。原位榆 测单拷贝的特定DNA或RNA 序列。原位反转录PCR技术，简称原位RTPCR它是指先将细 胞和组织进行处理(网定、酶消化 )，以获得适度的细胞通透性；再通过逆转录使 mRNA转录 成cDNA ；然后把载玻片放人热循环机，对靶 DNA等细胞内靶目标在原位进行 PCR扩增(扩增 反应中含有标记的单核苷酸) ；最后通过检测标记产物的方法检测扩增产物。 1.4.2原位PCR技术与原位反转录PCR技术的比较 原位PCR技术在进一步提高以单细胞底物进行PGD的效率的前提下，由Thornhill 提出， 它具有细胞定位能力和高度特异敏感。原位反转录PCR技术是原位PCR技术的一种，它检测 的靶序列为RNA。具有操作简单、流程短、省时等优点；同时具有特异性差、容易出现非 特异性DNA产物、造成假阳性、且扩增效率较低特别是石蜡切片等缺点。 1.4.3原位PCR技术与原位反转录PCR技术的应用 原位PCR技术是常规PCR在细胞学领域的扩展，它常被用于感染性外源基因的检测、内 源基因的检测与导入基因的检测等，如对HIV、结核杆菌等进行的检测。原位反转录 PCR技 术常被用于扩增和检测标本中罕见的mRNA，如定量细胞表达特殊 mRNA的丰度、检测扩增 产物的细胞起源及检测细胞群中基因表达的趋势等。 1.5定量PCR技术 1.5.1定量PCR技术的定义及特点 定量技术有广义和狭义两层含义。广义的定量PCR技术是指以外参或内参为标准，通 过对PCR 终产物的分析或PCR过程的监测，进行PCR起始模板量的定量。狭义的定量PCR技术， 又称为实时荧光定量PCR技术，它是严格意义上的定量PCR技术，指用外标法(荧光杂交探针 保证特异性)通过监测PCR过程 (监测扩增效率)达到精确定量起始模板数的目的，同时以内对 照有效排除假阴性结果(扩增效率为零 )。与常规PCR技术相比，定量 PCR技术不仅实现了对 DNA模板的定量，同时具有灵敏度更高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化 程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点。 1.5.2定量PCR技术的应用 定量PCR技术实现了PCR技术从定性分析到定量测定的发展，它常被应用于临床微生物、 食品微生物、临床肿瘤学的检测、肿瘤耐药基因表达的研究、细胞因子的表达分析等方面。 其中，临床微生物和食品微生物是定量PCR应用中最重要的两个方面。 1.6多重PCR技术 1.6.1 多重PCR技术的定义及特点 多重是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应， 它最明显的优点是省时、省力、能够快速检测和鉴别病原体，另外，多重PCR还可以精确 地估计一个样品中模板数量。 1.6.2多重PCR技术的应用 多重PCR技术将多个PCR反应放在同一个体系内，进一步提高了 PCR反应的效率，它被 广泛地用于病原体鉴别、性别鉴定、连锁分析、法医研究、模板检测和基因的疾病诊断等 方面。 1.7反向PCR技术 1.7.1反向PCR技术的定义及特点 反向，又称为染色体缓移，它是指利用在已知序列内部没有切点的限制性内切酶对此 段DNA进行酶切，在DNA 连接酶作用下自连形成环状DNA 分子，然后利用方向合适并与已知 序列两端互补的引物，以连接成环的DNA为模板，经PCR 扩增，得到已知序列的旁侧DNA 片 段。与常规PCR技术相比，反向PCR优势突出，但它需要从许多酶中选择限制酶，或者说必 须选择一种合适的酶进行酶切。另外，由于大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序 列，在YAC或Cosmid的未知功能序列中有时也会存在这些序列，从而导致反向PCR 得到的探 针与多个基因序列杂交，影响扩增效果。 1.7.2反向PCR技术的应用 反向PCR技术在检测病毒、转座子等在基因组中的整合位点，建立基因组步移文库及 研究基因的上游调控元件等方面较常规PCR技术优势明显。 1.8锚定PCR技术 1.8.1锚定PcR技术的定义及特点 锚定PCR，又称同定PCR它以基因组总DNA为模板，用一条基因特异性引物进行线性 PCR扩增，产生单链扩增产物；在末端转移酶的作用下，在单链DNA分子的3 末端加上多 聚胞嘧啶；用巢式基因特异性引物与多聚胞嘧啶配对的锚定引物对加尾的产物进行PCR扩 增，PCR 产物连入载体后进行测序鉴定。与常规PCR技术相比，锚定PCR技术特异性高、有 较长的步行距离，一次实验可以获得1.5 kb左右的目的片段，同时它无需对基因组总DNA进 行限制性内切酶消化段连接反应。另外，其操作过程较其他方法简单，大约2-3个工作日就 能完成。 1.8.2锚定PCR技术的应用 锚定PCR技术解决了常规PCR技术所不能完成的已知片段侧翼序列的克隆问题，是常规 PCR技术的又一重大扩展。 1.9兼并引物PCR技术 1.9.1兼并引物PCR技术的定义 兼并引物PCR是指针对由密码子的兼并性引起的。单以氨基酸顺序推测编码的DNA序列 的不精确性，设计成对兼并引物，通过PCR扩增所有编码已知顺序的核酸序列。 1.9.2兼并引物PCR技术的应用 兼并引物PCR技术是常规PCR技术在蛋白领域的应用，具体表现在两个方面：(1)寻找新 蛋白已被测定的一段氨基酸序列的相应基因；(2)寻找其有进化上保守结构域的蛋白质家族 新成员的基因。 1.10重组PCR技术及其应用 1.10.1重组PCR技术的定义 重组PCR是通过DNA重叠序列的衔接作用，使多个DNA分子融合在一起的体外扩增技术。 它包括三个阶段：(1)制备用于重组的DNA组件；(2)组件分子作为引物互为模板延伸； (3)克 隆和定向筛选重组产物。 1.10.2重组PCR技术的应用 重组PCR技术的应用主要表现在：(1)精确解析大分子功能和相互作用的结构基础，如 标定活性位点的关键残基、确认已知蛋白中未知功能的结构域、揭示配体一受体识别过程 中相互临近的区域等；(2)探索顺式作用元件的调控机理，揭示mRNA 的非翻译区的功能、 确定启动子和增强子成分的功能等；(3)嵌合受体在研究信号途径和胞内定位中具有独特的 “钓鱼”优势，用功能已知的分子和待研究对象嵌合来研究结合TGF之后的TGFR二聚化形 式和内向整流型钾通道的脂筏定位过程；(4)开发新型载体，比如通过DNA 重排来增强绿色 荧光蛋白(GFP)的荧光稳定性； (5)升级分子标记，通过DNA改组已经获得的重组拟南芥K+转 运蛋白可以使植株内的钾离子富集度提高261；(6)重组PCR在蛋白体外定向进化中的应 用最引人瞩目；(7)基于重组PCR 技术的分子育种在疫苗研发中有着广阔的应用前景。 2.PCR技术的特性 2.1操作简便 应用PCR方法的早期阶段操作繁琐，因为使用的聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶的大片段, 即 Klenow片段，而不是耐高温的TaqDNA聚合酶,而且操作也未实现自动化。目前使用的是耐 高温的TaqDNA 聚合酶，其操作也实行了电脑控制的DNA扩增仪的自动化，只要将扩增反应 所需要的特定程序输入DNA自动扩增仪，把反应所需要的全部材料混合均匀，置入仪器内， 反应就会按照所输入的正确程序进行。如果需要，还可随时予以调整。 2.2灵敏度高 PCR产物的生成是以指数方式增加的，所以欲扩增pg量级的起始物到此水平成放大真 核细胞单拷贝基因，通过PCR方法都是不难完成的。PCR方法还可用单一双倍体细胞，一根 头发，甚至单一精子进行DNA定型。 2.3特异性强 作为引物的寡聚核苷酸与模板结合的正确性是决定反应产物是否特异的关键。TaqDNA 聚合酶耐高温的性质，使得反应中引物与模板退火的步骤可以在较高的温度下进行，结合 的特异性大大增加，被扩增的目的DNA片段也能保持很高的正确程度。 2.4对原始材料的质量要求低 由于PCR技术有高灵敏度和较强的特异性，故仅含目的基因的DNA，就可以作为反应起 始材料来获取目的DNA扩增产物。 3.PCR技术的应用 3.1PCR在食品行业检测 PCR技术在食品科学中主要用于对食品中微生物含量的检测。物种特异性 PCR 技术可 以用于清真食品的鉴定，是一种可以信赖和合适的技术。以物种间基因差异为基础的分子 学鉴定方法成为研究的热点，而采用PCR方法有特异性强、灵敏度高和可鉴别性的特点， 已经成为肉质品种鉴别最常用的方法。 3.2PCR在医学中的应用 在临床医学方面也经常使用PCR技术，如对乙肝病毒、肿瘤、病原体等的检测。如人 类许多常见的肿瘤疾病与某些病毒病因及肿瘤相关基因的遗传学改变有着密切的关系。 PCR技术在肿瘤病毒病因、肿瘤相关基因、肿瘤相关抑癌基因等研究方面已取得可喜成果。 同时也被用于多点突变的遗传病。 PCR在法学中应用于亲子鉴定、血型鉴别以及指纹鉴别等。对某些犯罪现场的生物材 料的检定将为法医提供可靠有效的依据及直接、高效率的数据。 3.3PCR在应用水中的检测 运用PCR技术可对水体进行直接检测,缩短检测时间，扩大检测范围，并且具有较高的 精确度，同时也