sirna介导哺乳动物基因沉默1

siRNA 介导哺乳动物基因沉默 1 导言 在人类基因组（30 亿 bp）中，约有 34 万个编码蛋白的基因，但一半以上基因的功 能仍不清楚。一项全新的技术siRNA（small interfering RNAs）技术已用来系统研究数 以千计的基因功能及相互关系。SiRNA 是 RNAi 的介导者之一，它通过 dsRNA 使同源基 因沉默。用 siRNA 去沉默脊椎动物基因，尽管一年前才见报道，但对绝大多数脊椎动物基 因功能的分析仍显示出了强大生命力。 2 RNAi 的发现 2.1 基因功能的分析策略 经典的正向遗传学是依赖突变体而分析基因的功能，但随着基因组测序的巨大进展， 仍有数以千计的基因功能不为人们所知。反向遗传学是当今研究基因功能的最有效手段， 但目前还没有一项通用的反向遗传学技术，人们只是通过对目的基因进行同源重组来分析 其功能，实验周期长而且花费巨大。而最新的 RNAi 技术可使目的基因沉默，是反向遗传 学的一次伟大变革。 2.2 RNAi 的发现 1998 年，当时线虫基因组测序工作业已完成，Andrew Fire 和 Craig Mello 提出了一项 新技术：通过 dsRNA 诱导特异基因的沉默，即所谓 RNAi。这一发明与先前的 dsRNA 介 导植物体内的 PTGS 相似。Fire 和 Mello 等指出，在线虫体内，哪怕存在几个分子的 dsRNA，也足以使与其同源的基因的表达完全受阻。这一研究掀起了以 RNAi 介导线虫基 因沉默的热潮，不仅如此，该技术在哺乳动物中的应用正如火如荼。人们不仅用 RNAi 来 研究基因的功能，甚至还用它来治疗一些病毒引起的疾病。 3 SiRNA 简介 3.1 siRNA 的发现 在 1999 年，Andrew Hamilton 和 David Baulcombe 发现，在拟南芥的转基因株和病毒 诱导的 PTGS 中，存在 21 25nt RNAs，该 RNAs 与沉默基因序列互补，其来源是较长的 dsRNA 前体。还有研究表明，2123nt 的 dsRNA，携带 2nt 3突出末端。这些小 RNA 决 定了 RNAi 的特异性。在果蝇的基因沉默细胞中，提取到的小分子 RNA，足以使原初胚胎 胞容物及 S2 细胞的基因表达沉默。这些小分子 RNA 即称 siRNA。 3.2 人工合成的 siRNA 人工合成的 21nt 和 22nt dsRNA 也可高效诱导胞溶物中特异的 mRNA 的降解。人们一 直努力去合成一些具有活性的 siRNA。由于化学合成法造价昂贵，有人利用 T7 噬菌体聚 合酶在体外合成 siRNA：一种方法是用该酶分别转录 siRNA 的正义链和反义链，之后再退 火以形成 siRNA；另一种方法是用 T7 聚合酶直接转录顺式连接的 siRNA 的两条链，以形 成发夹结构。值得注意的是，T7 聚合酶体外合成的 siRNA 都具有 5三磷酸末端结构， 而在果蝇中，siRNA 活性必需的结构是 5一磷酸末端。因而，在哺乳动物中，要么其 5 三磷酸 需转化成 5一磷酸，要么其 5端的结构要求并不严格。还有人利用纯化的细菌 RNase，在体外加工较长的 dsRNA 以产生 siRNA。 4 stRNA 简介 4.1 stRNA 的发现 研究生物体内基因表达调控的一个新策略始自线虫中 lin-4 和 let-7 RNA 的发现。这两 种 RNA 均来自于 70nt 具发夹结构的前体 RNA，经加工形成 22nt 的 RNA。在线虫和蠕虫 中，lin-4 和 let-7 的基因均与发育的时序性有关，一旦突变，都会引起异时序性的发育缺 陷。如蠕虫的 lin-4 突变体停留在幼虫期而不再向前发育，而 let-7 突变体则滞留于幼虫的 最后一次蜕皮期。 4.2 lin-4 RNA lin-14 和 lin-28 mRNA 编码发育过程中的重要蛋白，而 lin-4 则对其进行负调控。lin-4 RNA 与 lin-14 和 lin-28 等重要的发育调控的 3UTR 的特定序列同源。一旦删除这些 mRNA 的 3UTR，会发生发育失控的表型。靶 mRNA 的 Northern blot 分析结果表明， 调控者（如 lin-4，很可能包括 let-7 RNA）可能稳定地与多核糖体结合，从而引起了靶 mRNA 在翻译水平的沉默。 4.3 let-7 RNA let-7 RNA 结合于 lin-41（另一种重要的发育调控基因） mRNA 3UTR 上并进行负 调控。let-7 RNA 的序列在两侧对称的哺乳动物中高度保守。 2000 年，Amy Pasquinelli 等将 lin-4 和 let-4 称作 stRNAs(small temporal RNAs),并指出，更 多的 stRNAs 仍有待发现。 5 stRNA 和 siRNA 的共同调控 5.1 Dicer 与 stRNA 和 siRNA stRNA 和 siRNA 有共同的大小，暗示它们在介导基因沉默过程中的可能联系。遗传学 的证据表明，Dicer 联系着这两个过程。有两个 RNase结构域，一个 RNA 解旋酶区和一 个 dsRNA 结合区。 Dicer 可催化长 dsRNA 分解成 2123nt 的，还能将的稳定发夹结构的 前体 RNA 分解成 2123nt 的 stRNA。当用 siRNA 将 Hela 细胞中的 Dicer 消除时，会发生 70nt2 未加工的 let-7 前体 RNA 的积累。同样，在蠕虫中去除 Dicer，会引起发育的异时性， 同时也发生未加工的 let-7 和 lin-4 前体 RNA 的积累。 5.2 EIF2C/Argonaute 族蛋白 EIF2C/Argonaute 族蛋白是 RNAi 和 stRNA 的又一联系者。这类蛋白有一个保守的 PAZ(Pawi-argonaute-zwille)区（也见于 Dicer 中） ，PAZ 区的功能仍不明确。这类蛋白在各 生物体的 RNAi 和 PTGS 中发挥至关重要的作用。最早发现 EIF2C 族蛋白是与核糖体相作 用而调控翻译的，现已证明 RNAi 可能与核糖体发生作用。蠕虫的两种 EIF2C 族蛋白缺陷 体（alg1 和 alg2） ，其发育呈异时性表型，同时积累未加工的 lin-4 前体 RNA。同样，在果 蝇中，两种与 Argonaute 同源的蛋白是 RNAi 必需的。实际上，人类的 EIF2C 蛋白是从 RISC 中纯化的。 5.3 其他的 2123nt RNA 最近，在不同的生物体中，已发现 90 多种可能的发夹结构的 RNA，其两侧序列可产生 2123nt RNA。并非所有这些 2123nt RNA 都象 lin-4 和 let-7 一样时序性表达，于是只 能统称为 miRNAs(micro-RNAs)。也就是说，lin-4 和 let-7 可被称作 miRNA，但因其具有 表达的时序性及特殊的功能，当属于 stRNA 类。当然，还有其它类型的 miRNA：如 sdRNAs(spatal develepment RNAs)，srRNAs(stess response RNAs)及 ccRNAs(cell cycle RNAs)等。通过对小 鼠组织中 miRNAs 分布的研究，发现许多 miRNA 都是组织特异性的。同样，植物中的 miRNA 的分布也有组织和器官特异性。最近， David Bartel 等指出，在植物体中，miRNA 可能直接作用 mRNA 的 ORFs 而使靶基因沉默，其作用机制与 siRNA 介导的 mRNA 降解 相似。看来在植物体内，绝大多数 miRNA 可与多个转录因子 mRNA 精确或近乎精确的互 补。 5.4 GEMIN3 和 GEMIN4 在哺乳动物中，许多 miRNA 的形成具有时空特异性，可能暗示其通过 stRNA 途径产 生。miRNA 的成批鉴定罕见相同者，足见其数量庞大。用 EIF2C 免疫沉淀法发现了两种 与 SMN 复合体（ survival of motor neurons complex）密切相关的蛋白，即 GEMIN3 和 GEMIN4。这两种复合体与各种核糖核蛋白复合体（RNP）的组装、重组和发挥功能密不 可分。重要的是，与 SMN 复合体不同，miRNA 和 GEMIN3/4 复合体包含与 Argonaute 同 源的 EIF2C 和 Dicer。GEMIN3/4 复合体是否与 RNAi 有关，仍不明确；但 GEMIN3 有解 旋酶区域，说明其可能与 miRNA 的加工有关。最近，Gyorgy Hutvagner 和 Phillip Zamore 指出，miRNA 和 siRNA 可能共存于同一复合体。他们发现，包含内源 let-7（与人类同源） 的复合体可直接引起外源 mRNA（包含与 let-7 精确互补序列者）的降解。 6 哺乳动物细胞中 siRNA 技术的应用 6.1 siRNA 技术应用概述 目前，应用 siRNA 技术研究哺乳动物基因功能日益普遍。表 1 概括了最近 siRNA 介 导的哺乳动物基因沉默的一些结果。显而易见，被 siRNA 沉默的基因种类繁多，既有编码 结构蛋白的，也有编码催化蛋白的。 6.2 siRNA 的转化 siRNA 的转化效率不仅取决于细胞的类型，还受继代次数以及细胞融合的影响。已发 现，许多转化介质具有细胞特异性，因而必须慎重选择最合适的一种以用于某种细胞的转 化。siRNA 也可以电穿孔法导入目的细胞（正常情况下不易转化者） ，其转化效率高达 95以上，但有 5以上的细胞在电击过程中死亡。死细胞可以很容易冲洗去除（附着力 下降） 。 在几种低等真核生物中，RDP(RNA dependent polynerase)可以使长 dsRNA 增加，从而 导致 siRNA 水平上升。在线虫中，许多 siRNA 在 mRNA 模板上延伸，形成了长 dsRNA； 长 dsRNA 在 Dicer 加工下产生更多的 siRNA。哺乳动物细胞很可能没有这种 siRNA 的放大 机制；而在植物和线虫中则依靠这一机制维持 RNAi 的活性和长寿命。事实如此。直觉上， 高度表达的哺乳动物基因比低表达的基因更难沉默。研究表明，中度表达的一些基因（如 核纤层蛋白基因）可被沉默到检测不到的水平；而高表达的肌动蛋白和波形蛋白基因被抑 制后的水平仍足以显示出表型。这很可能是因为细胞中的每个 RISC(RNA induced silencing complex)能够引发不同轮次的 mRNA 的降解。因为 siRNA 的活性、转化效率、细胞类型以 及蛋白的稳定性等方面的差异，均会影响 siRNA 介导的 RNAi 的效率，所以，不同基因的 沉默差异难以比较。 但是，若同时抑制两个或更多高表达的基因又当如何？Elbashir 等(2002)在 Hela 细胞 中实现了对 NUMA1(nuclear mitotic apparatus protein)和 lamin 的抑制。但 M.T.M 等报告， 同时抑制高表达的细胞表面分子 CD4 和 CD8 殊非易事，因为 CD4 siRNA 与 CD8 siRNA 在沉默实验中存在竞争性。这一结果验证了在哺乳动物和果蝇细胞中，RNAi 容量是可滴 定的或者说是有限的。因此，用 siRNA 研究某个途径或网络的不同基因时，务必要小心控 制 siRNA 的浓度。 在 siRNA 降低蛋白水平的实验中，建立准确的时间历程至关重要。通常，siRNA 引起 的 mRNA 水平的迅速下降会在 18h 以内观察到。然而，不同的蛋白有不同的周转速率。在 siRNA 存在的条件下，稳定的蛋白比不稳定的蛋白需要更长的时间才会被削减。绝大多数 情况下，siRNA 介导的 RNAi 可维持 35 次细胞分裂，即对大多数细胞而言是 35 天， 基因表达要恢复到正常水平则需 710 次细胞分裂。如果细胞处于饥饿或生长受阻状态， 则 siRNA 的作用实效可被延长，表明 siRNA 活性的丧失很可能是因为它被稀释到有效水 平以下，而不是因为它的降解。 7 siRNA 的靶 mRNA 7.1 靶 mRNA 序列的选择 在哺乳动物细胞中，用 siRNA 去沉默特定的基因，必须十分慎重的考虑二者序列的互 补性，以免影响到其他基因的表达。RNAi 可以允许 siRNA 与 mRNA 在一定程度上的错配： 12bp 的错配只会部分降低靶 mRNA 的剪切效率，尤其是当错配发生在配对双链的近端 位时，影响更小。Tuschl(2001)指出，在翻译起点下游 50100nt 的 DNA 序列，可以作用 于靶基因；而其 5或 3UTR 以及翻译起始点附近区域，因为含有调控蛋白结合位点，所 以应避免使用。至今还不清楚 mRNA 的哪个区域对 siRNA 最合适。表 1 的结果指出，RNAi 可以高效率的作用于整个的 mRNA，包括其 3UTR。然而，作用于靶 mRNA 的不同区域可能 会产生不同的结果。例如，在与小鼠 CD4 和 CD8 基因序列互补的 siRNA 中，只有约 1/5 的 siRNA 起作用；实际上，仅当 siRNA 与 CD4 和 CD8 的 3UTR 或附近区域互补时，才会表现 活性。在技术上，选择靶 mRNA 3UTR 有突出的优点：为了验证消除的症状，可以导入含 有不同 3UTR 的该基因序列，并观察其症状能否恢复。 7.2 靶 mRNA 的位置效应 到目前为止，结合在同一靶 mRNA 上的不同 siRNA 的相对效率如何，尚缺乏系统的研究。 实验结果指出，位置效应发生在密码子水平；也就是说，每次改变靶 mRNA 的一个三联体密 码子，就会引起不同程度的沉默。以上表明，RNA 结构可能控制着与 siRNA 的结合能力。 此外，siRNA 的序列也影响其在体外的活性。Michaelescherr 等（1998）发明了一项用于 选择最适的靶 mRNA 位点的技术，并且应用于 HIV(2002)。今后的研究将证明此项技术能否 被广泛应用。在实际工作中，如果某种 siRNA 未能沉默靶基因，则可以尝试另一个结合靶 mRNA 位点的 siRNA。 8 哺乳动物细胞的抗病毒感染 RNAi 的抗病毒作用，已见于植物和其他生物，但目前还未见到在脊椎动物中内源 RNAi 的抗病毒现象。Vira Bitko 和 Sailen Barik(2001)报道，用 siRNA 直接作用于 RSV(respiratory syncytical vurus)mRNA，可抑制 RSV mRNA 的翻译。在培养细胞和人类 原初 T 细胞中，siRNA 已成功的抑制了 HIV，可使 HIV 的水平降低 3050 倍。然而也发现 了抗 siRNA 的病毒，这些具有抗性的病毒分子是早就存在的。因此应当采用几种不同的 siRNA，以防止病毒大量增殖后产生抗性。 82 siRNA 技术应用举例 最近向小鼠导入 siRNA 已获成功。向小鼠尾静脉注射 siRNA，在多个组织中观察到了 报告基因沉默，如在 liver,spleen,lung,pancreas,和 idney 中发现，报告基因表达水平 下降了 510 倍。但是这种转导技术具有有害副作用，故不能简单用于人类。因此发明一 种适用于人类的 siRNA 转导技术是当务之急。也许有一天 siRNA 技术真的可以用于人类疾 病的治疗。 83 RNAi 的抑制物 在植物体内 RNAi 介导了抗病毒反应，而病毒也会产生强烈的 RNAi 抑制物。这些 RNAi 的抑制物序列各异，而且不同的抑制物阻抑 RNAi 途径的不同步骤。尽管目前发现的所有 RNAi 抑制物均为蛋白质，但不难想象，有些 RNAi 的抑制物可能是 RNA。比如病毒可以编码 自己的 miRNA，作用于宿主细胞中的 RNAi 途径。哺乳动物病毒编码 RNAi 的抑制物到底是 蛋白质还是 RNA，仍不清楚。最近的报告（Li.H 等 2002）发现，一种昆虫和植物的双宿主 病毒能产生一种蛋白质，这种蛋白质可以对两种宿主的 RNAi 途径进行抑制。 9 内源沉默效应 RNAs 的结构 绝大多数的 miRNA 是从前体 dsRNA 发夹结构的臂上经不对称加工而来，也就是说，只 从前体 dsRNA 的臂上产生一段 2124nt 的 miRNA，有时这些 2124nt 的 miRNA 会形成精 确配对双链的发夹结构，但更多的难以形成这种发夹结构（有太多的不配对突出部分） 。和 其他 RNase一样，Dicer 能够加工这种发夹结构（在臂上可以有几个错配碱基） 。何种必 须结构的 stRNA 或 miRNA 才能加工成 21nt RNA，至今几乎一无所知。 当 lin-4 和 let-7 作用其靶 mRNA 时，只有 5085的碱基与靶 mRNA 3-UTR 互补配 对。然而 Sayda Elbashir 等（2001）指出：siRNA 的反义链与靶 mRNA 形成精确互补的双 链结构，是 RNAi 介导 mRNA 降解所必须的。由于 stRNA 不能与靶 mRNA 形成精确互补的双链 结构，故不能介导 mRNA 的降解。在果蝇中有两个 3-UTR 结构，即 K-box(cUGUGAUa)和 Brd box(AGCUUUA)，可能作为 miRNA 的有效作用位点。K-box 和 Brd box 可以与 miRNA 的 5端互补配对，一旦删除，转录的抑制作用即被解除。许多 miRNA 的 5端可以与抑制子 的 3-UTR 精确互补，暗示 miRNA 可以用来调控已知的基因。 10、发夹结构 RNA 诱导基因沉默 通过在低等生物体内表达长的发夹结构 dsRNA(500-1000nt)，进而分析基因功能的技术 已大获成功。在哺乳动物中，这种技术已在小鼠的胚胎干细胞中取得进展。然而，在不同 的哺乳动物体细胞中，试图用如此长的发夹结构 dsRNA 以介导基因沉默，目前尚未成功。 可能是因为长的发夹结构 dsRNA 活化了干扰素（IFN ）相关途径，对基因表达缺乏特异性。 为避免 IFN 反应，人们正试图用小的 dsRNA 结构以沉默基因。 在哺乳动物细胞中，利用 siRNA 相关的加工途径以使靶基因稳定地保持沉默，技术上 已经成熟，短短的 3 个月内已有 9 篇文章报告。利用 DNA 模板表达 siRNA，可以取得与 合成的 siRNA 相同的效果，即都能够使基因沉默。这些报告表明，siRNA 的两个值得关注 的问题，即转导效率和沉默状态的时效，终于被一并解决。表 2 列出了这些实验结果。在 最早一篇报告（Brummel Kamp 等 2001）中，通过向培养细胞中导入人工合成的完整基因， 以表达经特殊设计的发夹 RNA，实现了对胞内 TP53 的表达抑制；而且在继代培养两个月 后，抑制效果丝毫不减。由于 Pol可以转录小分子 RNA(如 tRNA)，这些报告中，Pol 用来转录 siRNA 或 RNA 发夹。Pol的应用有一大优点，即新生 RNA 3末端总有 1-4 个 U, 这与 siRNA 相同。 在前述报告中形成的 RNA 发夹结构，是直接以 stRNA /miRNA 做为模板的，发夹中包含 突出、错配碱基对甚至环结构。在另一些实验中，siRNA 双链只