hcv 结构的介绍

Questions 1 对 HCV 的初步理解 1、其基因结构：HCV 是正链 RNA 病毒，传播的途径为血液传播。基因全长为 9.6kb 包括 5-NCR、一个长的开放阅读框（0RF ） ，编码组成约 3000 个氨基酸的 多蛋白前体，和 3-NCR. 2、目前 hcv 研究的现状：患者多，治疗方法不彻底，再感染几率大，潜伏期长，大部分患 者会造成慢性肝炎，肝硬化，肝癌等疾病。研究其感染机制，病毒与宿主细胞的相互作用， 一方面能够为制出特异性药物提供思路，另一方面是研发有效疫苗的必经之路。 目前病毒性肝炎的治疗多以聚二乙醇干扰素和利巴韦林，蛋白酶抑制剂联合用药，但是 机体对干扰素应答的副作用大，再感染几率高。在研究方面 HCV 感染后血清中病毒含量极 低，同时目前缺乏有效的体外培养系统及合适的动物模型繁殖病毒，无法获得大量的天然 病毒抗原，目前只能通过合成肽或基因重组的方法，获得 HCV 包膜蛋白抗原。同时还缺乏 有效的疫苗。 3、感染后缺乏有效的免疫的可能原因（1 ）HCV 高度变异，逃避机体的免疫清除；（2） HCV 在肝组织及血液中含量低及诱导机体产生保护性的抗原性弱；（3 ）病毒颗粒与低密度 脂蛋白或免疫球蛋白紧密联接，导致抗原决定簇被掩盖；（4）外周血淋巴细胞可能有 HCV 储存库的作用。 4、研究点：对于以上问题决定我们研究 HCV 的方向为编码蛋白和宿主因子在 HCV 复制、 组装过程中相互作用，治病机制、疫苗的开发等。 Questions 2 该病毒蛋白的结构和功能（功能机构，与宿主细胞相互作用，引发疾病） 1、 HCV 的 RNA 及其翻译加工 HCV 含有 9.6 kb 的正链 RNA 基因组 5-NCR，一个长的开放阅读框，编码组成约 3000 个氨 基酸的多蛋白前体，和 3-NCR5-NCR 高度保守，有 1-4 个域，域一不是 IERS 起始必须的， 但是域一和二是 RNA 复制所必须的。每一个 HCV 都有一个 IERS 序列，是翻译起始必须的 序列。3-NCR 由一个 80 个核苷酸序列组成的多聚 U 的可变区和一个由 98 个核苷酸组成的 X-尾巴的不变区组成。3-NCR 是一个顺势作用原件，编码 NS5B 蛋白。在细胞培养和体内 时 3-NCR.和 5-NCR 都是必须的。 5-NCR 的域二，三，四和核心基因的 20-40 个核苷酸构成 IRES 序列。 RNA 的翻译起始：IERS 序列和 40S 核糖体结合形成一个 48S 的二元复合物，然后在真 核生物起始因子 eLF3 的帮助下与 RNA 上的 AUG 序列结合，形成 eIF2Met-tRNAiGTP 三元 复合物，最后的限速步骤是依赖于 GTP 的与 60S 核糖体结合成 80S 的复合物。 HCV 的 ORF 翻译产生了蛋白前体是共翻译后通过细胞和病毒蛋白酶处理为成熟的结构 与非结构蛋白。结构蛋白和 p7 多肽是由内质网处理（ER ）信号肽酶处理而非结构蛋白由 两种病毒 NS2-3 蛋白酶和 NS3-4A 丝氨酸蛋白酶处理。 2、 核心蛋白 core HCV 的 ORF 翻译的第一个蛋白，其由功能区转入内质网腔的信号在内质网膜上 C 与 E1 之间。 信号序列被信号肽酶裂解。最终成为分子量为 21 道尔顿的核心蛋白 .其 N 端是高比例的碱性氨 基酸，称为 D1，可以使两个同源 RNA 聚合在一起。核心蛋白发现与内质网膜上的脂滴中，为 高度螺旋蛋白。脂滴是一个相对疏水的环境，这不仅确保蛋白质的折叠还有利于病毒蛋白的复 制，形态发生。核心蛋白与脂滴可能相互作用影响脂质代谢，促进肝脏的脂肪变性，这是经常 出现在 C 型肝炎，特别是患者感染基因型 3。 3、 包膜糖蛋白 E1 和 E2。 包膜蛋白 E1 和 E2 是糖基化形成的非共价复合物，给病毒形成一个保护囊。丙型肝炎病毒 糖蛋白的成熟和折叠是一个复杂的过程，涉及 ER 机械伴侣和取决于二硫键形成以及糖基 化。跨膜结构域 E1 和 E2，位于其 C 末端的异源二聚体并具有 ER 滞留性能。都由两个可延 伸的疏水性氨基酸通过短极性键连接。第二疏水片段为 E2 下游和 p7 中内部信号肽蛋白质。 内信号序列断裂前，E1 和 E2 的跨膜结构以发夹结构与易位子相连。信号肽裂解之后，信 号序列被重新定位，偏向胞质溶胶，最终形成单一的跨膜通道。E1 和 E2 的三维结构的测 定将是为阐明由这些蛋白质介导受体结合和融合过程的关键。 4、 P7。 P7 是一个 63 个氨基酸的多肽与 E2 常不完全切割。它的两个跨膜通过一个的胞质环连接， 并且 N 端和 C 端被定向向 ER 内腔。在体外， HCVRNA 复制中 p7 不需要，但在体内生产 性感染中必不可少。据报道，根据其低聚物和阳离子通道活性，这表明它属于的体内蛋白 质家族，并在病毒颗粒的成熟和释放中有重要的作用。因此可用于对抗病毒药物干预。 5、 NS2-3 蛋白酶。 NS2-3 蛋白酶也被称为该 autoprotease，是丙型肝炎病毒难以研究的蛋白质之一。对于 HCV 在体 RNA 复制是可有可无的，但无论在体外还是体内其对复制的周期所必需的。NS2- 3 蛋白酶催化活性在 NS2 的 C-末端半和 NS3N 端三分之一处。定点诱变表明，氨基酸 His143， Glu163 和 Cys184 是蛋白水解活性所必须的。NS2 是与细胞膜有关的蛋白。其 N- 末端域包含至少一个（可能是三个）跨膜段，缺乏该域重组蛋白名保留该酶的活性。NS2 的蛋白酶晶体结构域的结构（氨基酸残基 94-217，NS2pro）得以解剖。NS2pro 形成的二 聚体具有两个复合活性中心。每个活性中心都是由两种残基单体组成，一种单体是残基 His143 和 Glu163，另一种单体是 Cys184 残基。 这种结构改变了 HCV 的蛋白加工的看法，如以前认为 NS2-3 裂解发生在顺单分子反应 （因此指定 autoprotease） 。但是，对于二聚化以形成活性 NS 2-3 蛋白酶要求表明 NS2-3 裂 解和络合物形成可以由 NS2 的浓度来调节。 了解 N 末端膜结构可能会 NS2 额外的功能如 最近发现的生产感染病毒必需影响病毒生命周期的一步。有趣的是，高效的 HCV 嵌合体的 融合位点在 NS2 构建。 6、 NS3-4A 复合物。 NS3 是一种多功能蛋白，位于 N-末端的三分之一处是一种丝氨酸蛋白酶位于 C 末端三分之二 的蛋白质具有 RNA 解旋酶/ NTPase 活性。这两种酶的活性已经充分表征，以及高分辨率结构 具有已经得到。该 NS4A 多肽的 NS3 丝氨酸蛋白酶用作辅因子。其中心部分被合并为一个整体 组分掺入酶核心，和其 N-末端部分与膜形成 NS3-4A 复合物。 该 NS3-4A 丝氨酸蛋白酶已经成为制定特定抑制剂作为抗病毒药物的对象。其催化中心为 His57，Asp81 形 Ser139。底物特异性的决定因素包括：酸性氨基酸残基在 P6 处的位置，到 P1 半胱氨酸（包括反式切割位点）或苏氨酸（ciscleavageNS3 和 NS4A）和氨基酸之间用小 侧链连接的残余物，即，丙氨酸或丝氨酸，在 P1位置（一致切割序列 D / EXXXXC / TS / AXXX） 。 NS34A 丝氨酸蛋白酶有一个不同寻常的浅底物结合的口袋里，因此需要长期的与表面底物互 动。最近已经表明在先天性免疫中，NS3-4A 丝氨酸蛋白酶切割两个无活性的重要接头蛋白， 即 Trif77（也称为 TICAM-1）和 Cardif（也称为 MAVS79，IPS-1 和 VISA） 。Cardif 蛋白是线 粒体外膜上蛋白，以前观察到一个 NS3-4A 的小部分定位于线粒体上。这些发现对于 HCV 发 病原理的研究将产生极大的影响。 NS3 解旋酶是 2DExH/ D 盒解旋酶家族的成员。它结合双链 RNA 使其解螺旋，或结合单链 RNA 具有广泛的二级结构的区域，利用对 ATP 水解螺旋。 7、 NS4-B。 NS4B 是相对分子质量为 27-kDa 的蛋白质。其功能之一是诱导形成膜状结构，所述特异性 膜 改变在 HCV 复制复合物中作为支架。它被预测含有 4 个跨膜片段和最近一直报道两个 C 端半 胱氨酸被棕榈酰化残基且以形成低聚物。但是，详细膜拓扑和低聚中的作 NS4B 功能仍有待澄 清。 8、 NS5-A。 NS5-A 是磷酸化蛋白质，发现有底部磷酸化 56KDa 的和过磷酸化 58KDa 的蛋白质。最近的生化 和功能研究表明，-同种型蛋白激酶 CKI 的可负责 NS5A 的过磷酸化。NS5A 的磷酸化是丙型 肝炎病毒属和瘟病毒中的保守特征，并且还发现，在黄病毒 NS5 蛋白，认为它在 HCV 生命周 期中发挥重要作用。细胞培养适应性突变往往会影响位于中心的丝氨酸所需要的超磷酸残基， 这表明这 NS5A 磷酸化状态调制 HCV RNA 复制的效率。根据一种模式，NS5A 的过度磷酸化减 少与人小泡相关膜蛋白相关蛋白 A（HVAP-A）的相互作用。此囊泡分拣蛋白包括在脂滴中非结 构蛋白和参与病毒 RNA 复制的相关蛋白。NS5A 是通过 N 端的两亲性 螺旋嵌入膜双层的胞 质小叶锚定于膜一个蛋白。这个螺旋具有被嵌入在胞质膜界面的疏水性，富色氨酸面，而极性， 带电面暴露于胞质溶胶和可能是参与特定蛋白质 - 蛋白质相互作用，这对功能性的 HCV 的形 成复制至关重要 对重组 NS5A 进行序列分析和同时比较三个蛋白质水解域（翻译可能错误）该晶体的保守 结构域一的结构膜 - 锚定 螺旋透出二聚结构和限定的表面特性可能涉及与病毒 RNA 和细胞 膜蛋白的相互作用事实上， 假设背向从该膜产生爪状“二聚体槽，可以容纳任单链或双链 RNA。深，高碱性凹槽部 分可以用有利于接触 RNA，延伸出来的部分酸性强，有助于防止 RNA 的退出槽。 NS5A 的 RNA 结合性质已被生物化学证实。根据一种假说，多个 NS5A 二聚体可以形成对 细胞内的膜的二维阵列，从而产生一个“基本铁路将允许 RNA 的滑动。 NS5A 的其他区域将 保护其免受细胞 RNA 酶降解，或从识别由双链 RNA 诱导的抗病毒防御机制。根据这个模型， NS5A 将系绳病毒 RNA 到细胞内膜和协调其不同。根据一种假说，多个 NS5A 二聚体可以在细 胞膜形成二维阵列，从而产生一个“基本通道允许 RNA 的滑动。 NS5A 的其他区域将保护其 免受细胞 RNA 酶降解，或识别由双链 RNA 诱导的抗病毒防御机制。根据这个模型，NS5A 将病 毒 RNA 束缚在细胞内膜并协调不同丙型肝炎病毒复制过程中的命运。 在受感染的细胞中，许 多核心蛋白分子需要以基因组 RNA 复制产生掺入大量过量非结构蛋白。这些非结构蛋白在膜 上的形成的格或列可能有其他的功能。在 HCV 复制中只有一小部分的非结构蛋白参与 RNA 的 复制。如上所述，过量的非结构蛋白的积累也可能是用于启动 RNA 复制之前拮抗宿主细胞的 重要先天抗病毒途径。 9、 NS5B。 HCV 是正链 RNA 病毒。无论是利用病毒 RNA 作为模板，利用宿主细胞的复制系统复制出负 链 RNA 或者随后形成的正链 RNA 的复制都依赖 NS5B RDNP 酶。该酶被广泛的描述，NS5B 也成为研制抗病毒药物的对象。HCV NS5B 蛋白中含有所有 RdRps 基序，包括标志 GDD 内 基序、C 序列，并基于所述相似性酶结构的右手的形状的，经典的手指，手掌和拇指子域。 丙型肝炎病毒的 RdRp 的一个特点是，广泛手指和拇指子域之间的相互作用导致一个完全 封闭活性位点。此功能和其他 RdRps 酶相同。类似的脊髓灰质炎病毒的 RdRp，已报道 HCV NS5B 的低聚为 RNA 合成的活性重要条件。丙肝病毒 RdRp 是所谓的“尾锚定蛋白” 。膜联 系是由 C 末端 21 个氨基酸残基，在体外这是可有可无的聚合酶，但在细胞内是 RNA 复制 不可缺少的。膜定位发生由翻译后机制并造成 NS5B 的完整的膜关联。 10、 ARFP /F 蛋白 另一种阅读框（ARF）在 HCV 核心编码区被确定的是，作为在基因型 1a -2 / + 1 核糖体 移码的结果，有的电位，以高达 160 个氨基酸的蛋白质进行编码，指定 ARFP（替代阅读 框蛋白）或 F（移）蛋白质（见参考文献 109） 。氨基酸测序表明，移码可能发生在，或接 近，核心蛋白序列的 11 密码子。然而，多个，并且部分分离物依赖性的，移码的事件， 以及内部翻译起始，也有报道。检测抗体的和 T 细胞所特有的 ARFP / F 中的蛋白质丙型 肝炎患者表明，这些蛋白质是丙型肝炎病毒感染期间表达。然而，ARFP /F 蛋白不需要用 于体外 HCV RNA 复制或体内最近的证据表明，一个或多个保守和功能的重要元素 RNA 存在于核心基因/ ARF。然而，这些功能，如果有的话， ARFP 的/在生命周期F 蛋白质和 丙型肝炎病毒的发病机制仍有待澄清 Questions 3 病毒复制复合物 病毒复制复合物包括病毒蛋白，复制 RNA 和改变细胞膜组成的相关复合物 ，到目前为 止的文献综述以上是所有正性的标志链 RNA 病毒复制复合物。根据病毒，复制可能发生在 从派生改变膜 ER，高尔基体，线粒体或溶酶体连。膜在病毒 RNA 合成的作用还不是很清楚。 它可能包括：实物支持和组织的 RNA 复制复合物;条块分割和病毒产品的局部浓度;退绕时 的病毒 RNA 的束缚;提供脂质成分的复制很重要的;和从双链 RNA 介导宿主防御或 RNA 干扰 保护病毒 RNA 的膜质网是一种特别的膜改变，在 Huh-7 细胞含有 HCV 复制亚基因组是 RNA 复制的部位膜状纤维网的形成是诱导由 NS4B 单独和非常相似的“海绵状夹杂物“用电子 显微镜观察以前在 HCV 感染的黑猩猩的肝。它是目前推测膜质幅源自 ER 膜。正在进行的 研究旨在表征的宿主因素与涉及细胞过程形成 HCV 复制复合物。 最近的研究显示 HCV RNA 复制和细胞脂质代谢，推测通过交换和病毒及宿主蛋白质与 细胞内膜的关联之间的复杂的相互作用。在细胞培养物中，HCV RNA 复制是由饱和的和单 不饱和脂肪酸的刺激，以及由多不饱和脂肪酸或抑制脂肪酸合成抑制。这些结果表明，膜 的流动性是在复制复合物的功能是重要的。此外，我们发现的一种或多种宿主蛋白质的那 前期所需的 HCV RNA 复制。一种这样的蛋白质是 FBL-2，其包含一个 F-box 基序，并可能参 与靶蛋白降解，虽然自然底物是目前未知。这样的观察表明，药理操纵脂质代谢可能具有 治疗潜力的丙型肝炎感染。 最近的研究已经确定参与 HCV RNA 复制的其他宿主因素。利用敏感的环孢素 A（CSA）在体外观察抑制 HCV RNA 复制，亲环素 B 的确定为环孢素 A 的靶细胞。结果表明， 亲环 b 与 NS5B 相互作用，从而刺激其 RNA 结合活性。亲环 B 是肽基 - 脯氨酰 cistrans 异 构酶。这种酶的活性具有 AS-yetundefined 丙型肝炎病毒 RNA 复制的作用。基于这些发现， 非免疫抑制性环孢素 A 类似物目前正在更多最近开发作为对丙型肝炎的抗病毒药物，它表 明，FKBP8（的 FK506 结合蛋白家族的一个成员）和 Hsp90 的形成具有 NS5A 一个复杂的， 并有一个重要的角色 HCV RNA 复制。然而，FK506 （他克莫司）不结合 FKBP8 和不抑制丙 型肝炎病毒 RNA 复制 包装，组装，粒子释放 关于病毒生命周期的步骤是鲜为人知的，近期才开始进行研究。NS2 和可能的其它非结构 蛋白，如以及尚未将要定义的 RNA 的结构，涉及在生命周期过程中。病毒颗粒大概是由出 芽形成进入内质网，或 ER 衍生的隔室，并退出该细胞通过分泌途径。一个可能的链接 脂蛋白代谢和病毒装配和之间释放已提议。 、 影响药物开发 原则上，所述 HCV 生命周期（图 1）的各步骤是用于抗病毒干预的靶。生物化学和结构上 良好表征 NS3-4A 丝氨酸蛋白酶和 NS5B RdRp 进行的特异性抑制剂目前正在开发作为抗病毒 剂，以及第一方案已经在临床试验中进行了评估。丝氨酸蛋白酶抑制剂似乎特别有前途， 因为它们不仅阻断病毒蛋白加工，但也可能是由丙型肝炎病毒反向先天免疫传感的抑制。 此外，新的目标已经被发现上面强调了最近的研究，包括除其他外，HCV 5-NCR，病毒进 入和融合，在 P7 的离子通道，NS2-3 蛋白酶和 NS5A。此外，影响宿主因素药物参与 HCV 复制正在探索作为抗病毒剂。在这个早期阶段就已经是明显的是，HCV 遗传变异性，这有 利于抗病毒抗性的快速发展，是一个重大的挑战，以特定抑制剂的临床发展及的是，在共 同与 HIV 感染的联合治疗将是必要的治疗成功。 Questions 4 侵入宿主细胞时，与宿主细胞的联系（切断联系可研制抗病毒药物） 1、 GAG。 葡萄糖胺聚糖(glycosaminoglycans，GAGs)GAGs 是由氨基己糖和糖醛酸两 种己糖衍生物 组成的直链高分子化合物，广泛存在于细胞表面，并可作为多种病毒的结合位点，包括黄 病毒属的登革病毒 j。GAGs 有硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、硫酸类肝素、肝磷 脂和透明质烷几种类型，但只有高度硫酸化的 GAGs，如硫化肝素 (HS)参与多种病毒的结合 和内化，同样也观测到 HCV 和 GAGs 的结合 引。通过对 sE2、HCVpp 、HCVcc 以及患者血 清中分离出的 HCV 的研究表明，GAGs 中肝磷脂(HS 类似物) 和肝素酶( 可降解细胞表面的 HS)抑 制了 HCV 与靶细胞的结合，糖苷酶处理 HCV 敏感细胞后，对 HCV 易感性降低 。病毒附着 到 Hs 可能在 HCV 感染的早期起到重要作用，但是其在 HCV 的入胞机制中作用尚不明确。 sE2 在细胞内对肝磷脂有高度的亲和力，但是通过对 HCVpp 的研究(表面有 E1E2 异二聚体) 并没有类似效应 ，提示 HS 的结合位点在功能性 E1E2 异二聚体不容易获得或真实的 HCV 吸附到细胞表面的 GAGs 是病毒颗粒与脂蛋白结合 。而最近的研究表明，脂蛋白脂酶介导 的病毒黏附作用在一定程度上促进了 HCV 人胞 2、 DCSIGN、LSIGN 和 ASGPR DCSIGN、LSIGN 和 ASGPR 均为 3 型钙依赖性植物凝集素，胞外区 C-末端包含一个糖结 合位点，可通过钙离子依赖方式与病毒糖基结合。DCSIGN 表达于枯否细胞、树突状细胞 和淋巴细胞，LSIGN 表达于肝窦内皮细胞。 DCSIGN 和 LSIGN 通过高甘露糖寡糖对 sE 有高度亲和力，同样也可和 HCVpp 以及患者血清中分离出的 HCV 病毒颗粒结合 。由于 DCSIGN 和 LSIGN 均不在肝细胞上表达， 而两者表达的细胞均与肝细胞相邻，推测在 HCV 的感染过程中两者作为捕获和转移人肝细胞的受体 。ASGPR 则直接存在于肝细胞的表 面，能同昆虫细胞中产生的 El、E2 蛋白结合，HCV 类似颗粒 (HCVLPs)能通过 ASGPR 内化 入肝细胞 。但关于 ASGPR 的资料不多，有待于进一步研究。 3、 CD81 CD81 是分子量为 26 kD 的非糖基化膜蛋白，属于四跨膜(tetraspanin)蛋白超家族，广泛分布 于多种组织和细胞表面，以非共价结合方式与多种分子形成复合物，参与细胞的黏附、激 活、信号转导，增殖和分化等多种功能 。CD81 有四个跨膜区、一大一小两个细胞外环 (small extracellular loop，SEL 和 large extracellular loop，LEL)和 2 个胞质内的 N 一末端及 C 一 末端。1998 年 Pileri 等首先发现 sE2 可以与细胞表面蛋白 CD81 LEL 相结合，从而推断 CD81 可能是 HCV 入胞的受体 而这种结合具有种属特异性，sE2 不与鼠细胞表面的 CD81 结合 。 此后多个实验证实 CD81 参与 HCV 感染，抗 CD81 单克隆抗体以及可溶型 CD81 一 LEL 均可 抑制 HCVcc 和 HCVpp 在体外及体内感染 。 。不表达 CD81 的肝癌细胞株 HepG2 和 HH29， 通过转染易位表达 CD81 后，获得对 HCVcc 和 HCVpp 的易感性 舭 。而通过 siRNA 下调 CD81 的表达或 CD81 的特异性抗体则可抑制患者血清中分离出的 HCV 的感染 。一些研究 提示 CD81 是在 HCV 与细胞的黏附之后发挥作用的 1 J。HCV 仅感染表达 CD81 的肝细胞， 但是在非肝细胞株的易位 CD81 表达并不能表现易感性，这提示 HCV 入胞尚需要其他分子 。另外，EWI-2wintCD81 的分子伴侣可抑制 HCV 人胞，而这种天然抑制物在肝细胞表面的 表达缺失可能是导致 HCV 嗜肝性的另一因素。 4、 SRB I SR B I是一个由509个氨基酸组成的细胞表面糖蛋白，属于清道夫受体家族，由2 个短的胞 质区、2个跨膜区和1个大的细胞外环结构组成。SRB I可在大部分哺乳动物细胞中表达， 但在肝细胞和类固醇生成组织中的表达水平明显高于其他细胞。与CD81类似，SRB I可与 sE2相互作用，推测SRB I是HCV入胞的假定受体 J，而通过HCVpp和HCVcc的研究表明， SR B I参与HCV 入胞 驯。用抗 SRB I多克隆抗体预培养Huh-细胞能够降低HCVpp的感染。 而采用siRNA的方法使SR B I的表达下调至5时，HCVpp的人胞减少90 。SRB I的主要天 然配体是高密度脂蛋白(HDL)，SR B I的主要生物学功能是介导 HDL的胆固醇脂的选择性吸 收，研究发现HDL并非是HCV人胞的竞争者，而是能促进HCVpp 和HCVee的入胞 川。但这一 作用与SRB I的表达有极大的关系，因为当通过RNA干扰引起靶细胞不表达SRB I时，这 一效应大大降低。HDL可以易化HCV人胞是通过激活sR-B I或HDL 与脂质细胞膜相互作用。血 清淀粉样蛋白A(semi amyloidA，SAA)是肝脏发生感染、损伤、炎症后生成的一种急性相蛋 白 ，SRB I可以结合并内化SAA ，研究表明SAA可抑制HCV的入胞 ，而HDL可以降低SAA的 抗病毒作用，HDL和SAA之间可能为竞争关系。具体机制需要进一步研究。SRB在HCV 人胞 中的作用尚不明确，可能是通过病毒颗粒直接与SRB I作用 C29,34，但是也有研究提示 HCV通过SRBI相关的脂蛋白作用 。抗SR-B I抗体的动力学抑制研究表明HCV入胞需要CD81 和SR B I同时表达 。最近研究IFN的抗病毒作用与降低细胞表面SRB I的表达有关 ，这 些研究表明SRB I在HCV入胞中的作用。 5、紧密连接整合蛋白CLDN1和Occludin 紧密连接是细胞连接的主要成分，对维持表皮和内皮细胞的选择渗透性屏障功能是非常 关键的。紧密连接有两个重要的功能，一是封闭细胞间的空隙使表皮与内皮细胞的顶端和 基底液体腔室分割开来，另一是作用是维持细胞极性。紧密连接复合物由 occludins、Claudins、JAMs(junctionassociated molecules)和CARs(the coxsackie vires B adenovirus receptors)四种跨膜蛋白组成 。紧密连接的CLDN1和Occludin是新近发现的与HCV 入胞相关的蛋白质。1CLDN1：CLDN1是Claudin家族之一，是一种在肝细胞高表达的胞间 紧密连接组分 。该分子由211个氨基酸组成，形成2个细胞外环、3 个细胞内结构域和4个跨 膜结构，外环分子1(first extracellular loop，EL1)上含有1段高度保守序列，是该家族分子的 特征性结构，与HCV人胞有关的区域可能位于该序列上 J。CLDN1是目前惟一一个通过异位 表达于非肝源细胞而使该细胞对HCV 易感的分子：在293T和SW13 细胞表面表达CLDN1后， HCVpp对该细胞的易感性增加。而Huh-7细胞CLDN1的沉默表达降低对 HCV易感性 。动力学 研究表明 CLDN1参与晚期HCV人胞的过程 ，在HCV 和CD81结合或SR B I结合后发挥作用。Claudin家族 成员CLDN6 、CLDN9同样介导HCV 入胞 J，CLDN6、CLDN9具有高度保守的EL1，并和CLDN1 明显的序列同源性。不同于CLDN1，CLDN6、CLDN9同时还在HCV可能的肝外复制场所外周 血单核细胞中表达。CLDN6、CLDN9在CD81 阳性的内皮细胞表达可使不同基因型的 HCVpp入 胞。这提示Claudin蛋白在HCV的生活周期中的重要作用。 2 Occludin：OCLN与CLDN1同为紧密连接整合蛋白，定位于细胞侧膜的近顶面处，相对分 子质量6O kD，由4 个跨膜区，2 个细胞外区和胞质内N一末端、 c一末端组成 。OCLN 是紧密 连接中最重要的结构蛋白，不仅能通过外环以拉链式结合产生严密的细胞旁封闭，还与不 同分子结合，参与紧密连接形成的信号调节。目前认为CLDN1是HCV感染人肝源细胞系所必 需的，但同时在人非肝源细胞系HeLa 和HepH细胞( 天然表达CD81和SRB I)中过表达 CLDN1，并不能是细胞对HCV 易感，提示HCV 的入胞还需要其他受体参与 。Liu 等 通过 siRNA和shRNA干扰降低CLDN1和OCLN在细胞表面的表达可抑制HCVcc和HCVpp入胞，共聚焦 显微观察发现OCLN和E2 蛋白结合后在内质网处聚集 ，免疫沉淀法和 pulldown assay进一 步证实E2和Occludin和结合 。Ploss等 将HCV两种易感细胞Huh75和Hep3B细胞OCLN 分子 表达沉默后观察