4第四章 病毒的遗传分析

第四章 病毒的遗传分析 教学基本要求： 1了解噬菌体的繁殖方式，掌握烈性噬菌体、温和型噬菌体、原噬菌体、溶源性等概念 2掌握噬菌体的突变型，快速溶菌突变体,寄主范围突变体,条件致死突变体(“温度敏感” 突变、 “抑制因子敏感”突变)、无义突变与无义抑制基因等概念 3理解并掌握噬菌体的重组实验、互补测验和缺失作图遗传分析的原理和方法。) 学时数： 2 学时 病毒(virus)既不同于原核生物，也不居于真核生物，因为它们没有一般的细胞结构在病 毒中没有合成蛋白质外壳所必需的核糖体，所以只能寄生在动物、植物和细菌的细胞内繁殖， 它能使宿主细胞的机构转而合成它自身新的病毒物质。尽管病毒能形成晶体自身不能进行代 谢等，但仍将病毒视为生物，因为它们能够繁殖。病毒离开宿主细胞虽然不能繁殖，但仍可以 存活。根据宿主细胞的不同而将病毒分为动物病毒、植物病毒和细菌茵病毒 3 种。细菌病毒又 称噬茵体(phage)。后来发现真菌及藻类中都有病毒这些病毒也都称为噬茵体。 在前面几章的学习中，我们知道，真核生物基因传递方式的主要特征是 ： 减数分裂。因 而产生分离、交换和重组现象。这是真核生物有性过程的反映。与真核生物相对的一种生物， 原核生物，它们没有明显的核膜，甚至没有细胞结构，他们的遗传方式又是怎样的呢? 第一节 噬菌体的繁殖和突变型 一、噬菌体的结构 二、噬菌体的繁殖 1烈性噬菌体（virulent phages） 概念：使宿主菌发生裂解的噬 菌体。 繁殖：吸附在特异的受体上 酶细胞壁形成微孔注入核酸停 止细菌的代谢合成 phage 的成分 裂解，释放。如下图： 2温和型噬菌体（temperate phage） 具有裂解和溶源两种途 径 ： (1)裂解途径：和烈 性噬菌体相同，如右图。 (2)溶源途径： 溶源周期经诱导进入裂 解周期 3、溶源性： 有些细菌带有某种噬菌体，但并不立即导致溶菌，这种现象称为溶源性，具有溶源性的细菌称 为溶源性细菌（lysogenic bacteria），受温和噬菌体感染的细菌，几乎都成为溶源菌。在细 菌中处于潜伏状态的噬菌体称为原噬菌体（prophage）或原病毒（provirus），带有原噬菌体 的细菌称溶源性细菌（lysogenic bacterium），失去原噬菌体的细菌和为非溶源性细菌 （nonlysogenic bacterium）。 溶源性细菌有两个重要特性: (1)免疫性： 原噬菌体产生一种阴遏蛋白，抑制同类噬菌体 DNA 的复制，因而能抵抗同 类噬菌体的超感染。 (2)可诱导性： 自发万分之一； 紫外线或丝裂霉素 90%。 三、噬菌体的突变型 噬菌斑（plaque）：由于噬菌体的侵染，使细菌细胞裂解，有菌落上出现的一些园形而清亮的 小洞。 1、快速溶菌突变体 (1)野生型 r+形成小的噬菌斑 1mm，周边有朦胧 的光环。 原因 ：有两个以上的噬菌体侵染一个细菌时， 出现溶菌阻碍现象，混有裂解和未裂解的细胞。 (2)快速溶菌突变体 r（rapid lysis）形成大的噬菌 斑 2mm，边缘清晰。 原因：无溶菌阻碍现象。 (3)鉴别：噬菌斑大小。 2、寄主范围突变体 (1)野生型 h+ 能感染野生型的大肠杆菌 Ttos，但不能感染 Ttor (2)突变型 h 对 Ttos 和 Ttor 都能感染。 (3)鉴别 ：混合 Ttor 和 Ttos，野生型 h+出现混浊噬菌斑，突变型出现清亮噬菌斑。 (4)噬菌体与细菌的关系侵染与抗性。 3、条件致死突变体 所谓条件致死突变型，就是在某些条件下，这些突变型是致死的，那么这些条件就称为限 制条件(restrictive condition)；而在另一些条件下仍可进行繁殖，从而得以扩增进行研究，所以 这些条件称为许可条件(permissive condition)。人们有可能在许可条件下繁殖突变型，在限制条 件下研究突变基因在发育过程中的效应。 常用的有两大类条件致死突变： （1） “温度敏感”突变(temperature sensitive mutation)： 野生型噬茵体能在很大的温度范围内感染宿主并进行繁殖。 热敏感突变型(heat sensitive mutants，ts)：通常在 30( 许可条件) 感染宿主进行繁殖，但 在 40 一 42(限制条件)条件下就是致死的，不能形成噬菌斑； 冷敏感突变型(cold sensitive mutation，cs)：在较低温度下就是致死的。 原因：温度敏感性几乎总是一种突变的结果，基因突变后所编码的蛋白质中有一个氨基酸 的替换，而这种蛋白质在“限制温度”下不稳定而丧失活性。 （2） “抑制因子敏感”突变(suppressor-sensitive mutation, sus)：实质是原来正常的密码子变 成了终止密码子，因而翻译提前终止，不能形成完整肽链而产生有活性的蛋白质，属于无义突 变（nonsence mautation） 。带有 sus 突变的噬菌体在感染一种带有抑制基因(suppressor, su )(许 可条件) 的宿主菌时能产生子代，但在感染另一种没有抑制基因 (su )(限制条件)的宿主菌时，不 能产生子代。野生型噬菌体在这两种宿主中都能产生子代。 sus 突变不像“ 宿主范围突变” 那样影响噬菌体对宿主的吸附，这种突变的噬菌体能正常 地吸附、注入自身的 DNA，杀死宿主细胞，但不产生子代。 sus 突变分为三类； 无义抑制基因（ su ）实质：tRNA 基因发生了突变，例如琥珀型抑制基因su3 在 UAG 密码 于上插入了一个酪氨酸，这是因为 tRNA 加基因的反密码子的一个突变，tRNA Try，正常的反密码 于是 GUA，它按摆动规则译读酪氨酸密码子 UAU(C)。su3 菌株的 tRNATry含有反密码子 CUA，它识读琥珀型密码子 UAG，并插入酪氨酸而防止终止。 第二节 噬菌体突变型的重组实验 一、T2 噬菌体突变型的两点测交 可望出现四种基因型 亲本型：h+r- h-r+ 重组型：h+r+ h-r- 实例不同的快速溶菌突变型，在表型上也不相同。记作 ra，r b，r c。确定 4 个基因 ra，r b，r c，h 的连锁图。 用不同快速溶菌突变型 rxh+与宿主范围突变型 r+h 杂交，结果见表。 根据每一杂交作一连锁图: 4 个基因的连锁关系有 4 种可能图示 进行 rcrb+rc+rb, 把得到的重组值与 rbh 比较, 知 rcr brbh， 所以是 rchr b 确定 ra 在 h 的哪一边，不能单是把 rarb rarc 来回答。因为资料得不出明确的答案。 只有当很多的 T2 品系发现后，进行广泛的遗传学作图。才发现两种排列顺序都是正确的。原 来 T2 噬菌体的连锁图也是环状的。 二、T4 噬菌体突变型的三点测交 突变型：小噬菌斑(m)、快速溶菌 、浑浊溶菌班(tu) 三、X174 突变型的二点、三点测交 1、二点测交 （1）杂交：感染 su+ （2）检测子代噬菌体总数：用带有合适的 su基因的宿主菌(指示菌)作噬菌斑检测 （3）野生型子代噬菌体总数：用 su指示菌作噬菌斑检测 2、三点测交 必须选择两个标记的野生型重组体。 现以 amAtsCamB(amAtsC 十 十十 amB)三因子杂交为例：在两点测交中已知 amA 与 amB 之间距离较近，而这两位点到 tsC 的距离较远。那么在许可温度下把杂交子代噬菌体倒在 su指示菌上，tsC 是一种非选择标记，因为在许可温度下，tsC 也可正常生长，在 su 上选择 的两个琥珀突变的野生型重组子，不论是带有 tsC 还是 ts5C 都会产生噬菌斑。然后在限制温 度下分析这些重组噬菌体 tsC 与 tsC 所占比例，从而确定这 3 个基因排列顺序： 运用间隔联结的非选择性标记 tsC 确定噬菌体三点测交中标记次序 基因顺序： tsCamAamB 四、烈性噬菌体的遗传体制 噬菌体在杂交中，每个亲代对子代所提供的遗传贡献取决于感染细菌时每种亲代噬萄体 的相对数量； 噬菌体的基因重组是发生在噬菌体的 DNA 复制以后，重组型和亲本型一起复制； 噬菌体不同基因型之间可以发生多次交换； 在噬菌体中基因重组频率可以随着宿主细胞裂解时间的延长而增加，直到 DNA 与外完 蛋白装配成为完整的噬菌体时，重组才停止。 因此噬菌体杂交时，应该注意： 控制每种亲代噬菌体基因型的投放量： 控制允许发生复制和重组的时间。只有控制这两个因素并在标准条件下进行杂交所得 重组频率才能用于绘制近似的遗传图。 五、Benzer 的重组测验 1955 年，美国的 S.Benzer（本泽）用大肠杆菌 T4 噬菌体作为材料，研究快速溶菌突变 型 r的基因精细结构，发现在一个基因内部的许多位点可以发生突变，并可以在这些位点之 间发生交换，从而说明一个基因是一个功能单位，但并不是一个突变单位和交换单位，因此， 一个基因可以包括许多突变单位和许多重组单位。 噬菌体 T4 感染 E.coli 引起溶菌，有一组 T4 突变型，产生大而边缘清楚的噬菌斑，叫做 快速溶菌（rapid lysis） 。而野生型噬菌体的噬菌斑小而边缘模糊。Benzer 对一组叫做 r的速 溶突变型进行详细而深入的研究。r 区中有 3000 多个突变型，它们都有相同的表型。利用菌 株 B 和很容易鉴别突变型和野生型。 表 4-1 T4 的突变型 r和野生型 r +在不同菌株上的噬菌斑 不同大肠杆菌菌斑平板上的表型 类 型 B K() S 野生型 rII+ 小噬菌斑 小噬菌斑 小噬菌斑 rII 大噬菌斑 无噬菌斑（致死） 小噬菌斑 重组测验：（recombination） ， Benzer 把 r突变型一对对地杂交，测 量每对突变位点间的重组频率。 如 rx+ry 在许可条件下双重感染 B 菌株，形成噬菌斑后收集菌液，稀 释后分成两份，一份再接种到 B 菌株， 这样，r x+，+r y，r xry，+都能生长， 另一份接种于 K()，在这里，只有+ 重组子才能生长，交互重组子 rxry 不能 生长。 图示 这种方法测定重组频率是极其敏感的，重组的检出率可达 1/106， 理论上可测得 0.002%的 重组值，但实际上所观察的最小重组频率为 0.02%。根据二点杂交的结果，可以作成连锁图 （图 4-3） 。 第三节 噬菌体突变型的互补测验 一、Benzer 的互补测验 Benzer 分析了 r区域大约 2000 个（有些不能重组）突变型，知道这些突变分布在 308 个（能重组）位点上。那么，这 308 个位点是属于一个基因还是几个基因?为了划分这种功能 单位界线，必须进行互补测验。 (1)互补作用：两个突变型细胞的两条同源染色体同处在一个杂合体细胞或局部合子时， 野生型基因补上偿突变基因的缺陷而使细胞的表型恢复正常的作用。否则，两种突变型一定具 有相同功能损伤。 (2)反式构型：两个突变分别位于两条同源染色体上的基因组合。 顺式构型：两个突变位于同一个染色体上的基因组合。 图示。 (3)互补测验（complementation Test） （顺反位置效应测验）:比较顺式和反式构型的细胞， 从而判断两个突变是否属于同一基因的测验测验基因间是否互补。 Benzer 用不同的 r突变型成对组合去 感染大肠杆菌 K（）菌株， 图示。他 发现:r突变型可分成 rA 和 rB 两 个互补群。所有 rA 突变型的突变位 点都在 r区的一头，是一个独立的功 能单位；所有 rB 突变型的突变位点 都在 r区的另一头，凡是属于 rA 互 补群的突变不能互补，同理属于 B 互补 群的突变也不能互补，只有 rA 的突 变和 rB 的突变可以互补。 二、顺反子、突变子与重组子的概念 1、顺反子（cistron ）：Benzer 把在反式构型中不能互补的各个突变位点在染色体上所占 的一个区域称为一个顺反子。 顺反测验结果表明，顺反子是一个必须保存完整才具胡正常生理功能的遗传物质最小单 位。实际上它是基因的同义词。是一个功能水平上的基因。r 区内，有两个基因，但可在许 多位点发生突变和重组。 2、突变子（muton）：是指一个顺反子内部能发生突变的最小单位。一个突变子可以小 到只有一对碱基。如镰形细胞贫血症:HbS 和 HbA。这对基因的差别只是 链第 6 位氨基酸谷 氨酸变为缬氨酸: DNA mRNA 蛋白质 正常 HbA: CTT GAA 谷氨酸 镰形 HbS: CAT GUA 缬氨酸 3、重组子（recon）是基因内不能由重组分开的遗传单位，即基因内出现重组的最小区 间。重组子的单位可以小到核苷酸对。 Benzer 的重组测验中最低的重组值为 0.01%。 总结：每个顺反子在染色体（DNA ）上的区域称为基因座（ locas） ，而每个基因座上有 许多突变位点（site） ，它是一个顺反子内部能发生突变的最小结构单位，称为突变子；一个突 变可以小到一对碱基，我们知道，DNA 中每一核苷酸对的改变都可引起肽链中氨基酸的改变， 从而影响顺反子的功能，但它本身没有独立的功能，它们之间可以重组，而重组的最小结构单 位称为重组子，重组子可以小到邻近碱基对间的重组。由此可见，顺反子既具有功能上的完整 性，又具有结构上的可分割性。 三、X174 条件致死突变型的互补测验 1X 174DNA 的体内合成 2温度敏感型的互补测验 在 42的限制条件下，用两种温度敏感型的突变型噬茵体同时感染细菌细胞，如果这种 双重感染细菌的“二倍体”细胞产生子代噬茵体，那么每种突变型噬菌体必定相互提供了另一 种噬茵体无法提供的功能，于是这两种突变就称为彼此互补，并分属于不同的顺反子。反之不 能互补的突变，那么就属于同一顺反子。 四、T4 突变型的互补测验 以上条件致死突变在基因组内似乎是随机发生的，已发现所有已知的 T4 基因都有这种突 变，通过这些突变就可以表明不同基因在发育过程中的功能。 T4 的条件致死突变型同样都可以用互补测验法把它们归属子特定的顺反子中。 RSsEdger 和 wWood 还进一步证明一些产生不同形态缺陷的突变型可在离体条件下互补。 第四节 缺失作图 一、点突变和缺失突变（point mutation） Benzer 在研究 r突变型中发现其中一些突变是由于核苷酸对的改变，称为点突变。而另 一些突变是由于缺失了相邻的许多核苷酸，因此称为缺失突变。尽管 r区这两种突变形成相 同的表现型效应，它们的区别 ： (1)点突变是单个位点的突变，缺失突变是多个位点的突变。 (2)点突变可以发生回复突