6 中药缓控释给药系统的质量综合评价

6 中药缓控释给药系统的质量综合评价 中药缓控释给药系统的质量评价体系包括制剂体外质量评价、体内评价及 体内外释药的相关性考查。体外质量评价包括制剂学常规项目的检查，如片剂 的外观、片重差异等，小丸的水分、圆整度、重量差异等，微球的外观特性、 粒度分布、流动性等；定性检查，包括化学特征反应检识、薄层色谱检识等； 指标成分的定量测定；体外释放度的测定。体内评价包括药代动力学、药效动 力学、生物利用度。 体外质量评价除体外释放度的测定外，其余检测项目与普通制剂相同，在 此不再累述。 6.1 体外释放度的测定 释放度（releasing rate）是缓控释制剂中药物在规定介质中释放的速度和程 度。释放度与溶出度（dissolution rate）本质上是相同的，但在具体测定方法与 条件方面两者有一定的差别。缓控释制剂的体外释放度测定是模仿缓、控释制 剂在胃肠道内的运转状态及胃肠道环境制定的，是筛选缓、控释制剂处方和控 制其质量的重要手段。 6.1.1 体外释放度测定方法及判断标准 转篮法（stirring basket method）与浆法(stirring paddle method)是两种最基 本和最常用的释放度测定方法，对于大多数中药缓控释制剂，由于其有效成分 含量低，宜采用小杯法测定。各种方法的仪器装置、测定方法及结果判断可参 考中国药典 （二部）附录溶解度测定法。中国药典和美国药典 2000 年版释 放度测定方法及判断标准对比见表 6-1。美、日、德对缓控释制剂释放度测定的 具体规定对比见表 6-2 表 6-1 中美两国 2000 版药典中口服固体缓释制剂释放度测定对照表 中国（CP2000） 美国（USP24 ） 装置 1 转篮法 2 浆法 3 小杯法（相当于 USP24 中的方法 7，既 1 转篮法（stirring basket method） 2 浆法(stirring paddle method) 3 往复筒法（reciprocating cylinder） 2 可用于缓控释制剂也可用于透皮给药系 统） 4 流通池法（flow through cell、用于缓释制剂） 5、6 用于透皮给药系统 7 往复夹法（reciprocating holder 两者均适用） 释放介 质 介质：首选脱气的新鲜蒸馏水 温度：37 体积：250、500、750、900、1000mL 离子及离子强度： PH： 表面活性剂： 温度：37 取样时 间点及 各时间 点释药 量 释放全过程的时间不应低于给药的间隔时 间，且累积释放率要求达到 90% 至少三个取样点：第一点开始 0.5-2 小时， 用于考察药物是否有突释（累积释放量约 30%） ；第二点为中间取样时间 t（累积释 放约 50%） ，用于确定药物的释药特性；最 后取样点 t（累积释放约 75%） ，考察药量 是否基本释放完全。 至少三个时间点：最初时间点（early time point）,证 明药物没有完全释放，保证用药安全性;中间时间点 （middle time point） ，应能较好地反映释药特性；最 终时间点（final time point） ，应显示满意的释放量； 判断标 准 除另有规定外，应符合下列有关规定： 6 片（个）各时间测得的释放量按标示量计 算均应符合规定。如各时间测定值有 1 片 （个）不符合规定范围但其平均释药量均 符合规定范围，仍符合规定。如最后时间 释药量有 1 片（个）低于规定值 10%者， 则另取 6 片（个）复试。 初复试 12 片（个） ，其平均释药量均符合 各时间规定范围，且最后释药量低于规定 值 10%者不超过 2 片（个） ，亦符合规定。 6 片（个）中每片（个）各时间测得的释放量按标示 量计算均应符合规定；若有不符合规定者，另取 6 片（个）测定，两次测试的 12 片（个）平均释放量 均符合各时间规定范围，其中没有超出规定范围 10%和低于最终释放量规定值 10%的片（个） ，可判 为符合规定；12 片（个）测试仍不符合者，再取 12 片（个）测定，三次测定的 24 片（个）平均释放量 均符合各时间规定范围，其中超出规定范围 10%的 片（个）2，且没有超出规定范围 20%或低于最终 释放量规定值 20%的片（个） ，仍可判为符合规定。 表 6-2 美、日、德对缓控释制剂释放度测定的具体规定对照表 美国 日本 德国 3 在极端的生理条件下进行溶出实验 在尽可能多的不同条件下测定 3 种 PH 条件下测定 溶剂 PH 值 1.0-4.0-6.0-7.4 溶剂 PH 值 1.2-4.0-6.8 溶剂 PH 值 1.2-4.0-6.8 或 7.4 遇到难溶药物不用有机溶剂而 是加入表面活性刑 (SDS) 至少 2 种搅拌强度 (50100200rmin) 至少 2 种搅拌强度 至少 3 次取样 1h，t(50)，t(80 ) 考察药品润湿性和离子强度的影响 换用另种溶出方法测定 (桨法、篮法互换) 考察溶剂中加入表面活性剂或油 性成分( 如脂肪)的影响 考察其它成分如酒、酶等的影响 换用另种溶出方法测试 6.1.2 影响释放度的因素及其控制 影响释放度的主要因素除药物制剂本身固有的性质外还可由溶出仪、溶出 介质及取样引起，这些影响因素可分为流体动力学因素、溶出介质物理化学性 质及固液介面动力学因素，详见表 6-2。 表 6-2 影响释放度的因素 影响因素 流体动力学 溶出介质理化性质 固液介面动力学 制剂性质 药物与溶出介质的 反应 样品位置、制剂形状、药物 的 溶解及崩解、颗粒大小及比 重、处方辅料 仪器系统 搅拌装置的位置、搅拌速率、系统的 振动和扭动、密合度、偏心率 溶出介质 多余介质的返回、介质的换用及介质 的补充、介质中的气体 表面张力、温度、 PH 值、体积 介质中气体 取样 取样管位置 6.1.2.1 制剂性质的影响 制剂的固有性质主要是由制剂处方、工艺决定的，其中辅料的种类和用量 是影响释放度的主要因素。可根据缓控释制剂的释药要求选用不同的辅料（阻 4 滞剂、致孔剂、崩解剂等）来控制药物的释放，达到缓控释的目的。 6.1.2.2 仪器系统的影响 6.1.2.2.1 仪器系统的振动 系统振动是释放度测定中的常见影响因素，分为系统振动和偶然振动。系 统振动是由系统中交流电源产生的振动，系统振动难以消除，对于同一制剂， 最好采用同一型号的仪器，以减少系统误差。偶然振动是由于外界振动源通过 水浴或溶出仪框架传递给溶出杯，从而影响制剂释放度的振动，如环境中的空 调设备、风扇，同一工作台上的离心机、UV 分光光度计、泵等。偶然振动会 引起测定数据的不规则变化，应尽量避免，不容忽视。 6.1.2.2.2 偏心率 偏心率是系统中影响制剂释放度的又一因素，偏心率是搅拌轴的旋转轴线 与溶出杯的轴线之间偏离的程度，USP 规定不得大于 2mm，中国药典规定不得 大于 1mm。一般情况下，偏心率越大，释放越快，为避免偏心率引起的试验结 果重现性差、稳定性低，测定之前必须对每个溶出杯进行定位，校准搅拌器。 6.1.2.2.3 转动速度 转动速度对制剂的释放度也有较大的影响，研究表明，转速的变化与释放 速率基本上呈线性关系，搅拌速度一般在 50-100r/min，浆法 50r/min 相当于转 篮法 100r/min。转速的选择要根据制剂的剂型特性及所选用的方法来确定。 6.1.2.3 溶出介质的影响 6.1.2.3.1 溶出介质的种类 新鲜蒸馏水应作为首选溶出介质，在 USP 中近 500 个品种的溶出度试验 以水为溶出介质，其中只有一个出现了生物不等效性。 其次，在水中加入盐酸或醋酸使其与人体胃酸环境相似的介质，与生物利 用度也有较好的相关性。另一种是在水中加入缓冲剂，PH 值一般为 3.0-8.0， 多采用 PH7.4 的缓冲液，FDA 规定以 PH6.8 代替 PH7.4，此 PH 值与人体肠液相 似，更符合药物经口服后的体内环境。 对于水溶性较差的药物，可在介质中加入表面活性剂，如十二烷基磺酸钠 5 (0.5%以下)，也可选择适宜的有机溶媒(如异丙醇、乙醇（浓度 10%以下，不得 超过 30%）)与水的复合介质，最好不用氢醇类的溶出介质。选用表面活性剂或 有机溶媒作介质，可能存在体内外不相关，并不能客观地反映制剂的体内生物 利用度，要慎重选择这类介质的种类及其浓度范围。 6.1.2.3.2 溶出介质中的气体 在测定释放度时，溶出介质必须经脱气处理，以减少其中所溶解的气体对 药物释放产生物理和化学的干扰。 1 物理干扰 影响筛网的孔隙率 当介质中的气体受热逸出时，常常吸附于转篮、转 轴或旋浆等表面，从而在转篮上形成一层气体屏障，减少转篮孔隙率，阻碍药 物或小颗粒从转篮向杯中扩散。吸附在转轴或旋浆上的气体对药物的释放影响 较小。 影响介质流型 当温度升高时，气体在介质中的溶解度降低，气体以 小气泡的形式释放，从下向上逸出，改变了介质的流型。吸附在容器壁上的气 泡也能引起杯壁介质流型的改变。 2 化学干扰 改变介质 PH 值 当以蒸馏水为介质时，溶解在其中的 CO2 引起介质 PH 的改变，尤其对 PH 溶解曲线变化大的药物，更不能忽视。在缓冲液中，溶 入的气体对 PH 的影响较小。 氧化 一些易氧化的物质在释放度的测定过程中，溶解在介质中的 O2 会明显影响测定结果。对易氧化的药物，必须进行脱气操作，必要时可先通入 惰性气体排除 O2，再脱气处理。 6.1.2.3.3 溶出介质的温度 温度对释放度的影响大小取决于药物和制剂辅料的温度-溶解度曲线。人体 温表正常温度为 37，为了能更准确地反映体内的情况，各国药典均规定溶出 介质的温度为 37，中国药典规定溶出介质温度为 370.5，6 个溶出杯中 的溶出介质温度误差在0.5范围之内，以保证数据的重现性。 6.1.2.3.4 溶出介质的体积 选择释放介质体积的一个重要标准是漏槽状态（sink condition） ，即药物所 6 处释放介质的浓度远小于其饱和浓度，实际应用中，USP24 中规定为小于饱和 浓度的 1/3。目前各国药典采用的释放度测定方法（流通池法除外） ，溶出介质 体积一般为 500-1000ml，大多为 900 或 1000ml，对于一些剂量小，有效成分含 量低的药物，中国药典增加了小杯法，介质体积减少至 100-250ml。 6.1.2.4 取样的影响 取样的位置对释放度的测定也有一定影响，溶出杯内的药物浓度可能不相 同，中国药典规定的取样位置是在转篮或浆叶上端距液面中间，离溶出杯壁 10mm 处。小杯法取样点应在浆叶上端距液面中间，离杯壁 6mm 处。USP 对取 样点的要求与中国药典不相同，USP 仅规定取样点在转篮顶部到溶出介质液面 之间，距离杯壁不得低于 1cm，但各次取样必须在同一位置。USP 还规定取样 时间必须控制在2%误差之内。 6.2 药代动力学研究 中药药代动力学（Pharmaxokinetics, PK）是利用动力学原理及数学方法， 定量地描述中药有效成分、有效部位、单味中药或中药复方通过各种给药途径 进入机体后的吸收、分布、代谢和排泄等过程的动态变化规律。通过中药缓释 剂体内动力学研究，探讨制剂中有效物质在体内的释放规律、作用机理及药动 力参数，有利于指导中药缓释剂处方的设计、制备工艺的优化和辅料的筛选， 有利于拟定临床给药方案，确定给药剂量、给药间隔时间及疗程，从而提高中 药制剂的质量和疗效，对实现中药的现代化有着重要的作用。 对于中药缓释制剂的药代动力学研究，原则上应考虑：与普通制剂比较， 中药缓释制剂除在体外溶出试验中具有缓释特性外，在体内也应有缓释特性。 中药缓释制剂可选用药代动力学方法或药效动力学方法证明其在体内的缓释 特性。建议首选药代动力学的定量测定方法。对于确实无法建立符合生物样品 分析要求的体内药物测定方法的，可采用药效动力学方法进行研究，但必须充 分说明理由。用药效动力学方法进行研究时，必须严格遵循药理学试验设计的 要求。对于动物实验，建议采用交叉设计。药效指标应客观，能定量，有明确 7 的量效关系，能反映临床的主要适应证，并能确切地证实体内的缓释特性。 药代动力学研究时，可选择缓释制剂和对应的普通参比制剂中至少一个相同的 有效成分，该成分能够反映药物的主要药效。该成分的含量稳定，制剂中成分 可控。并能够建立符合生物样品分析要求的体内药物测定方法。以中药有效 成分制备的中药缓释制剂的体内药代动力学研究，应参照化学药缓释制剂的要 求进行。以中药有效部位制成的中药缓释制剂或以有效成分（或部位）组成 的复方制备的中药缓释制剂的体内药代动力学研究，应选择至少一种能够反映 主要药效的有效成分进行药代动力学研究，体内外试验应证明与普通参比制剂 比较，具有缓释特性。 6.2.1 中药缓释剂药代动力学的研究方法及评价 中药缓释剂药代动力学的研究方法与化学药品的药代动力学研究没有本质 的区别，其方法分为有效成分的药代动力学方法和生物效应法（药理效应法、 药物累积法、效量半衰期法） 。 6.2.1.1 有效成分的药代动力学法（体内药物浓度法） 本法适于化学成分比较明确的制剂，与化学药物的药代动力学研究原理类 似，常采用分光光度法、色谱法等测定中药已知成分在血、尿或其它组织的浓 度，研究其在体内的吸收、分布、代谢、排泄。 随着近年来分离分析检测方法的发展，血药浓度法具有简单、快速的特点, 被广泛使用。但如果认为某种有效成分的动力学特点即可反映整个中药制剂的 动力学特征，显然是过于简单化了。中药成分复杂，特别是复方中药，不同 于结构明确、成分单一的化学药品，即使是单味中药也是由多种成分组成的小 复方，有效成分难以确定。同一种有效成分在不同中药中所处环境不同，其 药代动力学参数各异，庞志功等证明牡丹皮和徐长卿中丹皮酚的药动学参数有 显著性差异。同种中药中的不同种有效成分，由于结构不同，其药代动力学 参数也不同。单一成分与其在药材或复方中的药动学参数不同，有人证明黄 连素单体与黄连药材中黄连素的药代动力学参数有显著性差异。所检测成分 并非是该制剂的唯一有效成分，并不能代表整个制剂的药动学。故在中药缓释 剂的药动学研究中，观测指标的选择应以该制剂的功能主治为指导，尽量多地 8 选用与功能主治直接相关的成分进行测定，以便更客观地反映制剂的整体药动 学过程。 6.2.1.2 生物效应法 生物效应法主要包括药理效应法、药物累积法(动物急性死亡率法)和微生 物法，对于有效成分不明，缺乏微量、定量检测方法的制剂可采用此法。在中 药缓释剂动力学研究中，应用最多的是药理效应法，由于缓释剂释药缓慢，其 本身的毒性较普通制剂小，再加上中药的毒性相对较低，在多数情况下难以测 得动物的急性死亡率，用药物累积法测定中药缓释剂的动力学参数存在一定的 难度；对于具有抗菌作用的中药，一般不要求制成缓释剂，故微生物法应用也 较少。 药理效应法符合中医药理论，体现了整体观念。虽然药理效应法从整体上 反映该制剂的动力学特征，但也存在着缺点：生物个体差异大，测定方法准 确度和精密度差，测定的参数具有一定的表观性。由于中药具有多作用的特 点，实际上以某种药理效应强度为指标也并非能反映该制剂的动力学特征，指 标不同，所得药动学参数可有较大差异，所以观察指标应是药物的主要作用， 尽可能与临床用药目的一致。 6.2.2 中药缓释剂药动学研究存在的难点 中药缓释剂药动学研究在不断向广度和深度发展，但在整个研究过程中存 在着普遍的问题：血样的处理 药物成分从血样中的提取（分离、纯化、富 集）是药动学（特别是用血药浓度法研究）的首要步骤，血样处理方法的选择 直接关系到测定结果的准确性。中药是多成分的复杂体系，各成分的化学性质 有较大的差异，如何将性质不同的化学成分同时分离、富集是首先要解决的问 题。作者认为对于中药缓释剂，在不同的时间，其释放的药物的量和质不一定 完全相同，同一种处理方法并非完全适于不同时间点的血清样品，这种观点有 待商榷。中药有效成分含量低，服用后在体内经过一系列的变化（肝脏代谢、 酶、细菌的分解、与血红蛋白结合等） ，使有效成分浓度进一步降低，由于缓释 剂的释放是限速过程，有效成分一旦释放，就很快在机体内发生各种变化，有 时即使用灵敏度高的仪器也难以检测出来。中药成分复杂，各成分间相互影 响，指标的选择存在一定的难点。 9 6.2.3 中药缓释剂药代动力学研究的发展趋势 中药缓释剂动力学的研究，应借鉴西药动力学原理和方法，吸取现代科学 知识，在中医药理论指导下，不断进行理论和技术创新，采用多学科相互交差、 相互渗透、集药理学、天然药物化学、分析化学各科所长，构建中药缓释剂动 力学研究的理论与技术体系。 随着现代科学技术的发展，中药缓释剂的药代动力学研究也取得了一些经 验。由于有效成分药代动力学法与药理效应法各自存在着优缺点，目前，中药 缓释剂的动力学研究正在向着药代动力学（Pharmaxokinetics, PK）-药效动力学 （Pharmacodynamics, PD）即 PK-PD 相结合的模型方向发展。从整体动物、组 织器官、细胞亚细胞和分子生物学四个水平进行药动学研究，阐明中药多成分、 多靶点、多途径、多环节整合调节的特色。 某些药中含有毒性成分，应分别针对有效成分和毒性成分进行动力学研究， 有效成分呈现的疗效与毒性成分呈现的毒效，二者相伴存在，在中药缓释剂的 研究中应引起重视。药代动力学-药效动力学相结合、有效成分-毒性成分动力 学相结合的研究，将进一步解决中药制剂的有效性、安全性、可控性问题,对推 动中药缓释剂的现代化、国际化起着举足轻重的作用。 6.3 药效动力学 中药复方成分复杂, 不同于结构明确、单一成分的西药,各成分之间相互影 响,同一种有效成分在不同中药中因所处环境不同,药代动力学参数各异,不同种 有效成分在同种中药中由于结构不同,药动学参数也不同。因此不能以单一成分 的血药浓度来表示该药的体内过程。药代动力学（Pharmaxokinetics,PK）-药 效动力学（Pharmacodynamics,PD） （PKPD）相结合是较理想的模型,更能有效 地解释中药多成分、多作用、多靶点发挥综合疗效的特征,体现药物在机体的作 用规律及药物的动态变化规律。 药效动力学（Pharmacodynamics,PD） 6.4 生物利用度与生物等效性 10 （缓控释制剂人体生物利用度及其申报要点） 生物利用度（bioavailability, BA）是指药物吸收进入血液循环的速度与程 度。生物利用度包括生物利用速度（extent of bioavailability, EBA）与生物利用 程度（rate of bioavailability, RBA）两方面的内容。生物利用速度是指药物吸收 进入体循环的快慢，可用吸收速率常数（K a）或平均吸收时间（ MAT）表示， 常用达峰时间（t max）比较制剂间吸收的快慢；生物利用程度指药物吸收进入体 循环的多少，可用血药浓度-时间曲线下的面积（AUC）表示。生物利用度是衡 量制剂疗效差异的重要指标，不同制剂 、不同药厂生产的同一制剂、同一药厂 生产的同一制剂的不同批号间的临床疗效都有可能不一样，大量研究表明，制 剂的处方、制备工艺、给药途径等是影响制剂生物利用度的主要因素。 生物利用度分为绝对生物利用度（F）和相对生物利用度（F r） ，前者指同 一药物经静脉注射与血管外给药进行比较，假定静脉注射的生物利用度为 100%，后者指同种药物的不同制剂，在同一给药途径下进行比较。 6.4.1 缓控释制剂生物利用度研究实验设计 缓控释制剂生物利用度研究是证明研究的缓控释制剂是否与普通制剂生物 利用程度相等。考察缓控释特点，检查药物有无突释现象。缓控释制剂的生物 利用度研究需进行单剂量试验与多剂量试验。 6.4.1.1 单剂量试验 单剂量试验考察缓控释制剂体内药物释放行为，评价与参比制剂吸收速率 与吸收程度的差异，考察体内吸收与体外释放的相关性。一般采用二处理（two treatment） 、二周期 (two period)、二顺序随机交叉试验。二处理也称处方间，即 指受试制剂与参比制剂，二周期又称二阶段，二周期间称为洗净期（washout period） ，应大于药物的 7-10 个半衰期，通常为一周。二顺序指一组先服用受试 制剂，后服用参比制剂，另一组先服用参比制剂而后服用受试制剂。 6.4.1.2 多剂量试验 多剂量稳态研究用于考察在连续给药的条件下，受试制剂药物吸收速率、 吸收程度及血药浓度波动情况，并与参比制剂进行比较，试验采用二处理、二 周期、二顺序随机交叉试验，缓控释制剂按设计要求给药（如每天 1 次或 2 次） ， 若参比制剂为普通速释制剂、则按临床常规方法给药（如每天 2 次或 3 次） ，但 11 两种制剂一天服药总剂量应相等，一般连服一定时间（不得少于待测药物 7 个 半衰期）后，开始测定谷浓度，至少测 3 次，以确证达到稳态。连续 3 次谷浓 度的采样时间应固定在每天同一时间，一般为每天早上给药前， 6.4.1.3 高脂饮食的影响试验 高脂饮食影响试验是考察食用高脂饮食后服用受试制剂与参比制剂，比较 其吸收速度与程度是否等效，评价食物对制剂生物利用度的影响。采用三处理、 三周期、三顺序随机交叉试验，将受试者随机分为 3 组，第一、二组在食用高 脂饮食后服用受试制剂与参比制剂，第三组空腹服用受试制剂。给药时，受试 者至少禁食 10 小时，再食用高脂早餐，立即用 250ml 水送服受试制剂或参比制 剂，空腹组一般禁食 10 小时以上后，早上服药，4 小时后统一进标准餐。 6.4.2 生物利用度的研究方法 6.4.2.1 血药浓度法 6.4.2.2 尿药数据法 6.4.2.3 药理效应法 6.4.3 影响生物利用度的因素 生物利用度不仅受剂型因素的影响，也受生物因素的影响， 6.5 实例 肝苏缓释胶囊是由单味药赶黄草研制而成的，具有降酶、保肝、抗病毒的 作用，其所含有效物质为有机酸类和黄酮类，没食子酸及槲皮素分别为其代表 成分，动物试验表明没食子酸及槲皮素均有明显的药理活性，下面以肝苏缓释 胶囊为例来探讨中药缓释剂的质量评价方法。 6.5.1 肝苏缓释胶囊的体外质量评价 6.5.1.1 体外释放度的测定 溶出介质的选择 赶黄草中的有机酸类、黄酮类在蒸馏水和酸性介质中的溶解 度较小，达不到漏槽条件（投入药量不得超过溶解度的 10%-20%）,而在 PH=7.4 磷酸盐缓冲液中能达到漏槽条件，故选择了 PH=7.4 磷酸盐缓冲液作为 溶出介质。 释放度测定方法的选择 在实验中曾对转篮法和浆法进行比较，用转篮法测定 12 释放度的重现性较浆法好，又因样品较粘，用浆法样品易于粘杯底，搅拌效果 不好，故选用转篮法测定其释放度。 溶出条件： 转速： 100rpm 温度：370.5 释放介质：经脱气处理的 PH=7.4 磷酸盐缓冲液 900ml 体外释放度中没食酸、槲皮素的含量测定方法 测定波长的选择：将没食子酸、槲皮素的标准品甲醇液在 TU1001 紫外分光 光度仪上扫描测定其最大吸收波长，见图 6-1、6-2： 图 6-1 没食子酸紫外吸收光谱图 图 6-2 槲皮素紫外吸收光谱图 方法：将肝苏缓释胶囊投入转篮中，分别于 1、2、4、6、8、10、12 小时取样 5ml(同时补加等量的溶出介质)，加乙酸乙酯萃取三次，每次 10ml，合并萃取 液，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解成 10ml，在分光光度仪上于 275nm、370nm 处 分别测定其吸光度，计算其累积释放量。 没食子酸标准曲线的绘制 精密称取没食子酸对照品 0.0021 g，加甲醇溶解成 25ml，分别精密吸取 0.5、1.5、2.5、3.5、4.5ml 于 5 个 10ml 的量瓶中，加甲醇 稀释至刻度，分别于 275nm 处测定其吸光度，以浓度 X 为横坐标，吸光度 Y 为纵坐标绘制标准曲线。 表 6-4 没食子酸对照品的标准曲线数据 试验号 1 2 3 4 5 浓度 （mg/ml ） 0.0042 0.0126 0.0210 0.0294 0.0378 吸光度 0.058 0.151 0.246 0.361 0.448 直线回归方程为：Y=-0.00516+12.0958X r=0.9998，表明没食子酸对照 品浓度在 0.00420.0378mg/ml 中线性关系较好。 没食子酸稳定性的考查 将浓度为 0.0378mg/ml 的对照品溶液于不同时间测定其吸光度,计算 RSD， 13 结果见表 6-5： 表 6-5 没食子酸稳定性考查结果 时间(h) 0 6 12 24 48 RSD(%) 吸光度 0.448 0.450 0.453 0.451 0.450 0.4 没食子酸标准品溶液在 48 小时内吸光度 RSD 为 0.4%,表明没食子酸标准品 在 48 小时内较稳定。 精密度考查 将浓度为 0.0378mg/ml 的没食子酸标准品溶液在 7530G 分光光度计上连续 测 5 次,计算吸光度的 RSD。 表 6-6 没食子酸精密度考查结果 试验号 1 2 3 4 5 RSD（% ） 吸光度 0.451 0.449 0.449 0.450 0.448 0.25 从上表可知，RSD 为 0.25%，表明该仪器有较好的精密度。 重现性考查 没食子酸回收率试验: 取溶出介质 5ml，分别加入 3 个不同浓度的没食子酸对照品溶液 1ml，加 乙酸乙酯萃取 3 次，每次 10ml，合并乙酸乙酯，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解成 5ml，于 275nm 处测定其吸光度，计算回收率，结果如下： 表 6-7 没食子酸回收率试验结果 试验号 加入量(mg) 测得量(mg) 回收率(%) 平均回收率(%) RSD(%) 1 0.08 0.0803 100.4 2 0.08 0.0794 99.2 3 0.16 0.1590 99.4 99.76 0.7 4 0.16 0.1613 100.8 5 0.32 0.3165 99.8 6 0.32 0.3197 99.9 从上表可知，RSD 为 0.7%，表明本法可行。 槲皮素标准曲线的绘制 精密称取槲皮素对照品 0.0024g，加甲醇溶解成 14 25ml，分别吸取 1、2、3、4、5ml 于 5 个 10ml 的量瓶中，加甲醇稀释至刻度， 于 370nm 处测定其吸光度，以浓度 X 为横坐标，吸光度 Y 为纵坐标绘制标准 曲线。 表 6-8 槲皮素对照品的标准曲线数据 试验号 1 2 3 4 5 浓度（mg/ml） 0.0096 0.0192 0.0288 0.0384 0.0480 吸光度 0.147 0.282 0.417 0.549 0.681 直线回归方程为：Y=0.0147+13.90625X r=0.99998，表明槲皮素浓度在 0.00960.048mg/ml 范围内线性关系良好。 槲皮素稳定性的考查 将浓度为 0.0384mg/ml 的标准品溶液于不同时间测定其 吸光度,计算 RSD，结果见表 6-9： 表 6-9 槲皮素稳定性的考查结果 时间(h) 0 6 12 24 48 RSD(%) 吸光度 0.548 0.550 0.551 0.549 0.545 0.42 槲皮素标准品溶液在 48 小时内吸光度 RSD 为 0.42%,表明槲皮素标准品在 48 小时内较稳定。 精密度考查 将浓度为 0.0384mg/ml 的槲皮素标准品溶液在 7530G 分光光度计 上连续测 5 次,计算吸光度的 RSD。结果见表 6-10： 表 6-10 槲皮素的精密度考查结果 试验号 1 2 3 4 5 RSD（% ） 吸光度 0.549 0.548 0.551 0.552 0.547 0.38 从上表可知，RSD 为 0.38%，表明该仪器有较好的精密度。 回收率试验 取溶出介质 5ml,分别加入 3 个不同浓度的槲皮素标准品溶液 1ml，加醋酸乙酯萃取 3 次，每次 10ml，合并醋酸乙酯，水浴蒸干，残渣加甲 醇溶解成 5ml，于 370nm 处测定其吸光度，计算回收率，结果见表 6-11： 表 6-11 槲皮素回收率试验结果 试验号 加入量(mg) 测得量(mg) 回收率(%) 平均回收率(%) RSD(%) 1 0.05 0.0490 97.9 15 2 0.05 0.0493 98.6 3 0.10 0.0982 98.2 98.6 0.8 4 0.10 0.0977 97.7 5 0.15 0.1497 99.8 6 0.15 0.1486 99.1 从上表可知，RSD 为 0.8%，表明本法可行。 三批样品体外释放度测定结果 表 6-12 肝苏缓释胶囊体外释放度测定结果 6.5.1.2 鉴别、检查、含量测定 方法同普通制剂相同。 6.5.2 肝苏缓释胶囊的体内评价 6.5.2.1 肝苏缓释胶囊在狗体内的药代动力学研究 通过比较了肝苏缓释胶囊与肝苏颗粒的体外释放度后，表明肝苏缓释胶囊 的释放明显慢于肝苏颗粒，由于没食子酸是肝苏缓释胶囊中的有效成分之一， 为了考查体外释放度的变化是否导致肝苏缓释胶囊体内药代动力学的变化，故 以没食子酸作为其中的一个特征成分，从而建立了狗服用肝苏缓释胶囊后血样 的处理、没食子酸的含量测定方法，并比较了肝苏缓释胶囊与肝苏颗粒在狗体 内的药动学过程。 6.5.2.1.1 HPLC 方法学考查 仪器与试药 Agilent 1100 型 HPLC 系统（惠普公司） ；LD4-2 低速离心机 （北京医用离心机厂） ；TGL-16G 台式高速离心机（上海医用分析仪器厂） ； XK96-A 快速混匀器（江苏姜堰市新康仪器厂） ；肝苏缓释胶囊（自制，批号： 001003，规格：0.28g/粒） ；肝苏胶囊(自制,批号： 001003,规格:0.26g/粒)；没食 子酸对照品(中国生物制品检定所，批号：0831-9501 供含测用) 血清中没食子酸的含量测定方法 HPLC 色谱分析法 色谱条件：色谱柱：ODS-3 柱（2504.6mm，5m） ；流动相：乙腈： 0.05%H3PO4(3：97)；流速：1ml/min；检测波长：275nm；柱温：40 血清样品处理方法的考查 分别取空白狗血清 0.5ml 于 3 个离心试管中,各加入 16 0.2mol/L 的 HCl 0.25ml,快速混匀,再分别加甲醇、乙酸乙酯、丙酮至 5ml，快速 混匀 5min，低速离心（3500r/min）10min，取上清液，供 HPLC 用。 图 6-7 甲醇处理的空白狗血清色谱图 图 6 -8 丙酮处理的空白狗血清色谱图 图 6-9 乙酸乙酯处理的空白狗血清色谱 图 由上图可知，用甲醇处理的血清样品杂质干扰最少，故选择用甲醇沉淀血 清样品中的蛋白为最佳。 血清样品的处理及测定 空白血清样品的制备 精密吸取空白狗血清 0.5ml,加 2mol/L 的 HCl 0.25ml,快 速混匀,再加甲醇至 5ml,于快速混匀器上快速混匀 5min,于低速离心机(3500r/min)中 离心 10min,取上清液,水浴蒸干，残渣加 0.5ml 甲醇溶解,高速离心(10000r/min) 10min,取上清液,供 HPLC 用。 含没食子酸标准品血清样品的制备 精密吸取空白狗血清 0.5ml,加没食子酸标准品适量,再加 2mol/L 的 HCl 0.25ml,快速混匀,按空白血清样品的处理方法制得含有没食子酸的血清样品,供 HPLC 用。 图 6-10 血清样品色谱图 图 6-11 含没食子酸的血清样品色谱图 图 6-12 没食子酸对照品色谱图 没食子酸在狗血清中的线性关系考查 精密吸取空白狗血清 0.5ml 于 5 个玻璃 17 离心试管中, 加 2mol/L 的 HCl 溶液 0.25ml,快速混匀,再分别加入浓度为 0.1、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/ml 的没食子酸(没食子酸)标准品溶液 10l, 再加甲 醇至 5ml,于快速混匀器上混匀 5min，低速离心(3500r/min)10 分钟,取上清液,沉 淀再加甲醇 5ml,混匀、离心，合并上清液，水浴蒸干，残渣加 1ml 甲醇使溶解， 高速离心（10000r/min） ，取上清液，分别精密吸取 20l 注入色谱仪,测定峰面 积,以峰面积积分值 Y 为纵坐标,浓度 X 为横坐标,绘制标准曲线,计算回归方程。 表 6-13 没食子酸在血清样品中的标准曲线 浓度 （ug/ml） 1.0 5.0 10.0 20.0 40.0 峰面积 12.27681 105.14036 234.17118 470.64050 950.57912 计算得回归方程 Y=-11.3310+24.07188X r=0.9999 ，表明没食子酸的 血清样品浓度在 1-40g/ml 范围内线性关系良好。 没食子酸在血清样品中的精密度考查 分别精密吸取含没食子酸（20g/ml ） 的血清样品 20l，连续进样 5 次，测定峰面积，计算 RSD。 表 6-14 没食子酸在血清样品的精密度考查 试验号 1 2 3 4 5 RSD（% ） 峰面积 470.640 474.231 466.231 475.265 468.235 0.86 从上表可知，RS