pin1反义核酸转染抑制乳腺癌mcf

PIN1 反义核酸转染抑制乳腺癌 MCF-7 细胞的增殖 【摘要】 目的 研究利用 Pin1 反义核酸阻断乳腺癌 MCF-7 细胞中 Pin1 的表达，并 观察其对增殖的影响。 方法 构建 Pin1 反义核酸真核表达质粒 pPIN1as，用脂质体转染 法将重组质粒转染 MCF-7 细胞， G418 筛选稳定表达重组质粒的克隆，RT-PCR 检测 Pin1 基因表达水平，Western blot 检测 Pin1 蛋白的表达，MTT 检测细胞增殖状况。 结果 稳 定表达 Pin1 反义核酸的 MCF-7 细胞内 Pin1 基因表达在 mRNA 水平和蛋白水平都显著降 低；MTT 实验显示 MCF-7PINAS 细胞的增殖速度较 MCF-7 细胞明显减慢(P0.05)。 结 论 阻断 Pin1 可以显著抑制乳腺癌 MCF-7 细胞的增殖活性，这为乳腺癌的基因研究及治 疗提供了新思路。 【关键词】 Pin1 反义核酸 乳腺癌 Effect of P1N1 antisense nucleotide on proliferation of human breast cancer cel l line MCF-7. HU Chun-xia, ZHOU Jin-hua, ZHU Tao, et al. (Molecular Tumor Center, Tongji Medical College of Huazhong University of Sci ence and Technology, Wuhan 430030, Hubei, P. R. China；Department of Obstetri cs and Gynecology, Affiliated Hospital of Hainan Medical College,Haikou,570102, P. R. China) Abstract：Objective To observe the effect of Pin1 antisense nucleotide on cell proliferation of human breast cancer cell line MCF-7. Methods The eukaryotic vect or named pPINas, expressing Pin1 antisense nucleotide, was constructed. MCF-7 w as transfected with pPINas and selected in the culture with G418. The selected clo ne MCF-7PINAS was checked for expression of Pin1 by RT-PCR and Western blot. The proliferation of cells in clone MCF-7PINAS were investigated by MTT. Results The expression of Pin1 at mRNA and protein level in MCF-7PINAS clone was dow n-regulated remarkably. MTT showed the proliferation of MCF-7PINAS was significa ntly retarded contrasting to MCF-7 (P0.05). Conclusion Blocking the expression of Pin1 with antisense nucleotide can signficntly depress the proliferation activity of M CF-7 to have offered new insight in gene research and treatment of human breast cancer. Key words：Pin1; Antisense nucleotide; Breast cancer PIN1(Peptidyl-Prolyl Cis/Trans Isomerase,NIMA-interating,1)是一种肽脯氨酰顺反异 构酶，能够特异性地识别磷酸化后的丝/苏脯氨酰基序，而蛋白序列中丝/ 苏脯氨酰基序的 磷酸化是一个重要的细胞内信号机制，它主要关系到细胞的增殖和转化。Pin1 特异性识别 并催化磷酸化的丝/苏脯氨酰，使蛋白质发生顺反异构反应，从而调节蛋白的功能。这种复 杂信号机制的失调可导致细胞转化和肿瘤发生1。近年来发现 Pin1 在人类多种肿瘤组 织中存在 Pin1 基因过度表达2。在乳腺癌、前列腺癌中高表达并提示预后不良 3,4 。因此，有学者认为 Pin1 可能成为癌症治疗的新靶点5。本文应用反义核酸技术，构 建了携带 Pin1 反义核酸的真核表达载体 pPINas，转染乳腺癌 MCF-7 细胞，观察细胞的 增殖活性，探讨 Pin1 反义核酸用于乳腺癌基因研究和治疗的可能性。 1 材料与方法 1.1 材料 MCF-7 细胞株购自 ATCC 并由本实验常规保存，真核表达载体 pcDNA3.1 (+)购自 Invitrogen 公司，大肠杆菌 DH5 株购自天为时代公司。各种限制性内切酶购自大 连宝生物公司，脂质体转染试剂 Lipofectamine2000 为 Invitrogen 公司产品,T4DNA 连接 酶及 Trizol 试剂、鼠白血病病毒逆转录酶(M-MLV)、耐热 DNA 聚合酶（Taq 酶）均购自 P romega 公司。兔抗人 Pin1 多克隆抗体购自 Santa Cruz 公司。G418 购自 Sigma 公司。 所有引物均用 Oligo 软件自行设计。 PCR 引物合成及 DNA 测序由上海英骏生物技术公司 完成。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养和 Pin1 反义核酸真核表达质粒的构建 MCF-7 乳腺癌细胞系采用含 有 10%胎牛血清的 DMEM 培养基，置 37，5%CO2 培养箱常规培养，收获对数生长期 的细胞，Trizol 一步法提取细胞总 RNA，逆转录反应获得 cDNA，反应条件为 37 60min 。从 Genbank 获得 Pin1 mRNA 全长及编码区序列(Accession No. NM_006221)，设计 扩增反义基因的引物：上游：5-GC TCT AGA CTG CGG CAG GAG GGA AGA TG-3 , 下游：5-CG GGA TCC TCA GTG CGG AGG ATG ATG TG-3，下划线分别为 Xb aI 和 BamHI 的酶切位点，以达到定向插入的目的。扩增条件为：95 预变性 2min，94 变性 30s，64.3 退火 45s，72延伸 45s，扩增 30 个循环，最后 72延伸 7min，PCR 产物长度为 513bp。PCR 纯化试剂盒回收纯化 PCR 产物，纯化产物和 pcDNA3.1(+)质粒 分别用 XbaI 和 BamHI 双酶切，玻璃奶法从琼脂糖凝胶中分离回收，室温下连接 3h，连接 产物转化感受态细胞，铺板挑取阳性克隆，命名为 pPIN1as，经酶切鉴定片断大小无误， 送测序结果显示插入片断完全正确。 1.2.2 表达重组质粒的 MCF-7 细胞亚克隆的筛选及鉴定 采用 Lipofectamine2000 脂 质体转染法, 将重组质粒 pPIN1as 和 pcDNA3.1 分别转染 MCF-7 细胞，按照说明书操作 ，并以未转染的 MCF-7 细胞做对照。转染后 24h 按照 1:5 传代，48h 加入含有 G418 1 0 00g/ml 的完全培养基进行压力培养，23d 换液 1 次。两周后未转染对照组细胞完全死 亡，实验组和空载体组改用含 G418 400g/ml 的完全培养基维持筛选，直至挑出阳性克 隆，用套环法挑取单克隆行扩大培养。鉴定阳性克隆方法为 RT-PCR 检测细胞中的 Neo 基因表达。Neo 基因检测引物序列：上游：5-AGA GGC TAT TCG GCT ATG AC-3， 下游：5-GCT TCA GTG ACA ACG TCG AG-3，扩增条件为：95 预变性 2min，94 变性 30s，56退火 30s，72延伸 30s，扩增 30 个循环，最后 72延伸 7min，PCR 产物长度为 211bp，表达反义重组质粒的阳性克隆命名为 MCF-7PIN1as，表空载体的阳 性克隆命名为 MCF-7pcDNA。 1.2.3 RT-PCR 检测 Pin1 mRNA 表达 用于 Pin1 基因表达检测的引物： P1：5-TC A GGC CGA GTG TAC TAC-3，P2：5-CGG AGG ATG ATG TGG ATG-3，扩增 条件为：95变性 30s，57.3退火 30s，72 延伸 30s，产物长度为 428bp。同时以 GA PDH 作为对照。用图像扫描分析系统 HPIAS-1000 测定各条带光密度值(AOD)，计算 Pin1 与 GAPDH 之比。 1.2.4 Western blot 检测 Pin1 蛋白的表达 收集转染重组质粒、空白质粒和未转染质 粒的 MCF-7 细胞，三去污裂解液分别提取细胞总蛋白并以考马斯亮兰(G250)法测定蛋白 浓度，取 100g 蛋白质样品进行 SDS-PAGE 电泳后转至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶 37 封闭 1h， Pin1 抗体 4孵育过夜，相应二抗 37孵育 1h，按照 ECL 用增强化学发光显 色系统显色。用 Bio-Rad 公司一维图像分析系统测定条带灰度值，以 -actin 作为等量蛋 白上样对照，计算 Pin1 与 -actin 之比，比较三组细胞中 Pin1 蛋白表达。 1.2.5 MTT 检测筛选后细胞和正常细胞生长曲线 制备单细胞悬液，按 3103/孔的细 胞密度分批接种于 96 孔板中，以细胞开始贴壁生长定为 0，培养 24、48 、72、96 和 120 h 后分别往每孔中加入浓度为 5mg/ml 的 MTT 20l，继续培养 4 h 后平板离心，弃培养液 ，每孔加入 150l DMSO 轻摇 15min 溶解甲月赞结晶，酶标仪测定各孔 570nm 处吸光度 值6。实验分为稳定表达 PIN1as 的细胞组、空载体组和未转染组，每组设 4 个复孔， 计算同组处理样品 A570 平均值，绘制细胞生长曲线。 1.2.6 统计学分析 所有数据均用 xs 表示，精确到两位小数，应用 SPSS12.0 版统 计软件进行 t 检验和方差分析。 2 结果 2.1 反义基因真核表达质粒的酶切和鉴定 以 MCF-7 细胞的 cDNA 为模板，利用 5 端含有 XbaI 和 BamHI 的引物扩增出长度为 513 bp 的 Pin1 cDNA 片断，酶切后连接到真 核表达载体 pcDNA3.1 上，转化 DH5 宿主菌，得到阳性克隆。pcDNA3.1 和 pPINas 分 别经 XbaI 和 BamHI 双酶切后行电泳，pPINas 酶切电泳后在 5366bp 和 503bp 处分别可 见载体片断和插入的 PIN1 的反义核酸片断(图 1), 测序结果显示定向插入序列完全正确， 表明成功构建了 pPIN1as 反义重组质粒。 图 1 重组质粒酶切鉴定结果及 G418 筛选后阳性克隆 Neo 表达鉴定结果（略） Figure1 Identification of recombinant pPINas by restrictive enzyme digestion an d MCF-7PINAS by checking the expression of Neo (A) M. 1kb DNA marker. 1. digested pcDNA3.1. 2. digested pPINas; (B) M. 10 0bp DNA marker. N. Neo G. GAPDH 1. pPINas transfected. 2. pcDNA3.1 transfect ed. 3. not transfected 2.2 PIN1 反义重组质粒及空质粒转染阳性细胞亚克隆的筛选、鉴定 用脂质体法将反 义重组质粒和对照空质粒分别转染 MCF-7 细胞，含 G418 的完全培养基培养直到挑出阳性 克隆，反义重组质粒组和空白质粒组的阳性克隆中均检测出较高的 Neo 基因表达，而正常 MCF-7 细胞中则无 Neo 基因表达(图 1)，说明成功筛选出稳定表达重组质粒的 MCF-7 细 胞亚克隆。 2.3 转染反义重组质粒对 MCF-7 细胞 Pin1 基因表达的影响 RT-PCR 和 Western bl ot 分别用于检测 mRNA 水平和蛋白质水平的表达。RT-PCR 显示转染反义质粒后 Pin1 m RNA 表达水平比未转染组明显下降，相对积分吸光度值显示下降了 64.7%；Western-blot 显示转染反义质粒后 Pin1 蛋白质表达水平也比未转染组显著下降，相对积分吸光度值显 示下降了 57%，而转染空质粒组 PIN1 表达在 mRNA 水平和蛋白水平与未转染组均无显著 性差异(如图 2)。 图 2 三组细胞中 Pin1 在 mRNA 水平和蛋白水平的表达情况（略） Figure 2 The expressions of Pin1 at mRNA and protein level in different cells M: 100bp DNA Marker P. Pin1 G. GAPDH 1. not transfected; 2. pcDNA3.1 transfected; 3. PinAS transfected 2.4 转染反义重组质粒对 MCF-7 细胞增殖的影响 MTT 法测定结果显示，转染反义 质粒组 MCF-7 细胞增殖速度明显减慢，与未转染组比较有显著性差异，转染空质粒组与 未转染组相比无显著性差异。结果证明，PIN1 表达水平的下降可以导致细胞增殖速度明显 减慢（图 3）。 图 3 三组细胞的生长曲线图（略） Figure 3 The growth curve of different cells X-axis. growth time Y-axis. The A570 value 1. not transfected; 2. pcDNA3.1 tra nsfected; 3. PinAS transfected. 3 讨论 Pin1 是一种作用底物广泛、作用位点明确并能增强许多致癌信号途径的功能酶,其过表 达能增强 Neu 和 Ras 诱导的乳腺上皮细胞转化 7。文献报道 Pin1 水平在人前列腺癌 临床转移过程中起重要作用, 提示 Pin1 可能成为人侵袭性癌症治疗的标靶8。有研究 表明，Pin1 基因敲除的小鼠除了部分细胞增殖不良外能长至成年,这提示选择性抑制 Pin1 并无普遍毒性9。这说明 Pin1 在许多肿瘤疾病治疗、预后等方面可能发挥重要作用， 进一步深入研究 Pin1 有着极其重要的意义。 近年来研究表明，依赖 Pin1 的丝/苏脯氨酰顺反异构转变是新发现的蛋白磷酸化后 信号转导机制1015。这种顺反构型转变直接影响蛋白功能活性。研究显示，至少对 某些底物而言，正是 Pin1 依赖的构型转变，而不是原始的磷酸化本身在调节蛋白功能，就 如 Cdc25c、CyclinD1 和 Tau 蛋白显示的那样，Pin1 对其稳定性、活性、亚细胞定位等多 方面产生影响并导致结果一致，提示磷酸化特异性的肽基脯氨酰异构可能是一种计时机制 ，它允许细胞以一种高效而又精确的方式打开或关闭某些磷蛋白的功能。这种复杂信号机 制的失调可导致细胞转化和肿瘤发生。丝/苏脯氨酰基序是许多癌信号分子共同的致癌信 号通路之一，丝/苏脯氨酰磷酸化后可被 Pin1 特异性识别催化，构型转变后该类蛋白被 充分激活且不被降解， Pin1 放大致癌信号，其功能类似于致癌信号通路的必不可少的翻 译和放大者, 正是 Pin1 将致癌信号和细胞增殖转化紧密联系1。 本实验应用反义核酸技术，成功构建了 PIN1 反义核酸的真核表达载体，利用阳离子 脂质体介导将其转染 MCF-7 细胞并成功筛选出稳定表达 Pin1 反义核酸的 MCF-7 细胞亚 克隆，观察细胞的增殖活性。我们在实验中发现，实验组比对照的细胞克隆延长到 3.5 周 。实验结果显示，Pin1 反义核酸可显著下调 MCF-7 细胞中 Pin1 的表达，明显抑制 MCF- 7 细胞的增殖，表明 Pin1 基因过表达与乳腺癌细胞 MCF-7 的增殖失控可能密切相关。我 们认为这是因为在乳腺上皮细胞发生转化和过度增殖过程中，丝/苏脯氨酰磷酸化信号机 制可能发挥重要作用，而磷酸化的丝/苏脯氨酰基序可被 Pin1 特异性识别催化，而引起 某些底物的构型和功能发生改变，致使信号分子不能及时降解，处于高度激活的持续状态 ，从而导致多种致癌信号持续放大，最终引起细胞转化和增殖失控。而 Pin1 反义核酸显著 下调了 MCF-7 细胞中 Pin1 的表达，阻断 Pin1 功能，在肿瘤细胞中致癌信号不能产生级 联放大作用，致癌通路被阻断，有助于恢复细胞内信号稳态，部分逆转恶性肿瘤细胞的过 度增殖。 文献报道 Pin1 具有调节细胞周期运行的重要作用11，并通过参与调节 P53、Bcl 2 功能发挥抗凋亡作用12。本实验通过转染技术观察 Pin1 基因对人乳腺癌 MCF-7 细 胞生长状态的影响，我们将进一步研究 Pin1 对乳腺癌 MCF-7 细胞周期及其抗凋亡作用并 探讨其相关机制，为深入研究 Pin1 在乳腺癌中的作用奠定实验基础，并为乳腺癌基因研究 和治疗提供新思路。 【参考文献】 1 Lu KP. Pinnig down cell signaling, cancer and Alzheimers diseaseJ . Trends Biochem Sci, 2004,29(4):200209. 2 Bao L, Kimzey A, Sauter G, et al. Prevalent overexpression of prolyl iso merase Pin1 in human cancersJ. Am J Pathol, 2004,164(5):17271737. 3 Wulf GM, Ryo A,Wulf GG, et al. Pin1 is overexpressed in breast cancer and cooperates with Ras signaling in increasing the transcriptional activity of c-Jun towards cyclin D1J.EMBO J, 2001,20:34593472. 4 Ayala G, Wang D, Wulf G, et al. The prolyl isomerase Pin1 is a novel prognostic marker in human prostate canerJ. Cancer Res,2003, 63:62446251. 5 Ryo A, Liou YC, Lu KP, et al. Prolyl isomerase Pin1: a catalyst for onc ogenesis and a potential therapertic target in cancerJ.J Cell Sci,2003,116(5):77 3783. 6 司徒镇强，吴军正.细胞培养M. 第 2 版. 西安：世界图书出版公司， 2003， 250252. 7 Rippmann J F, Hobbies S, Daiber C, et al. Sc