海南油茶优树选择及dna指纹图谱构建

-精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 1 海南油茶优树选择及 DNA 指纹图谱 构建 摘要 通过初选、复选和精选， 从海南岛 35 个油茶居群中选出 5 株油 茶优树，它们具有抗炭疽病强、产果量 高、含油率高等特点，鲜果出籽率 45.57%52.00%，鲜果出油率 7.30% 10.93%，单位冠幅产油 0.110.21 kg/m2，产油量 770.551 470.05 kg/hm2，茶油的酸值在 0.210.30 mg/g 之间，不饱和脂肪酸含 量 85.78%89.10%，亚油酸含量 5.06% 6.32%。基于 SRAP 标记，以引 物组合 Me1/Em4 可把 5 个优树区分开， 构建了直观、清晰、简单的 DNA 指纹 图谱。 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 2 中国论文网 /8/view-12928366.htm 关键词 油茶；优树； DNA 指纹 图谱 中图分类号 S565.9 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）07- 0005-03 Selection and DNA Fingerprinting Construct of Camellia oleifera in Hainan CHEN Wei-wen 1 ZHENG Dao- jun 2 YANG Li-rong 2 YUN Yong 2 CHEN Jia-li 2 CHEN Xuan 2 * （1 Forest Seed and Seeding General Station of Hainan Province，Haikou Hainan 570203； 2 Institute of Tropical Horticulture， Hainan Academy of Agricultural Sciences） Abstract 5 plus trees from 35 populations were checked ultimately in Hainan，the results showed that these plus trees with the characters of anti- anthrax，high fruit and oil production.The -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 3 plus trees fresh seed rate was 45.57%52.00%，oil production rate was 7.30%10.93% ，oil production was 0.110.21 kg/m2 in crown units，oil production was 770.551 470.05 kg/hm2，and the oil acid value was 0.210.30 mg/g，the unsaturated fatty acids was 85.78%89.10%，the linoleic acid content was 5.06% 6.32%.Based on SRAP markers，the primer composition Me1/Em4 could distinguish the 5 plus trees，construct clear and simple DNA fingerprintings. Key words Camellia oleifera；plus trees；DNA fingerprinting 油茶（Camellia oleifera Abel.） c 橄榄、油棕、椰子并称世界四大木 本油料植物，其茶油有丰富的营养成分 和优越的保健功能，有“ 食油之王 ”“东 方橄榄油”等美誉，已被国际粮农组织 列为重点推广的健康型食用油1。海南 省具有发展油茶产业的优质特色资源和 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 4 气候环境优势，油茶产业又是极富有开 发前景的特色生态产业2，充分挖掘海 南省油茶资源，选育新品种，可加快海 南省农林业产业结构调整，促进农民增 收，对促进海南省国际旅游岛建设具有 非常重要的意义。但是，由于海南油茶 资源开发较晚，目前还没有经过审定的 品种，单株产量低、良种少已成为当前 海南油茶发展的关键瓶颈问题之一3-5。 目前，从现有林分中选择优良单 株，是油茶新品种（无性系）培育的必 经步骤。从 20 世纪 60 年代起，我国油 茶育种工作者相继在全国各地选择了林 相较好的 6 700 hm2 油茶林进行选优， 初选优树 11 000 多株。经过复选和精选， 最后决选出 1 000 多株优树。其中，广 西、江西、湖南、浙江等省（区）较多 6，如安徽农业大学从 1999 年 8 月开 始对安徽舒城县境内的油茶品种资源状 况做了一次较为全面的调查，并在现有 资源中初选出 2 个优良单株7。安徽省 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 5 农业科学院针对安徽省祁门县境内原有 的实生油茶林资源进行考察研究，并筛 选出一批优株8。重庆市林业科学研究 院等单位调查了重庆市 36 个油茶林分 布，实测 235 株油茶单株，初步选出 63 株优树9。目前生产上广泛应用的无性 系或品种，如湘林系列、亚林系列、赣 系列、丰系列、长林系列、岑软系列和 桂无系列，均是在优株基础上培育而成。 为了较好地鉴定油茶新品种或无 性系，国内学者应用分子标记技术研究 构建了部分油茶新品种或无性系。如林 萍等10采用 SRAP 标记技术，对油茶 长林系列进行分析，建立了全部供试材 料的 DNA 指纹图谱，实现了 12 个无性 系的有效鉴别；李阿池11通过建立和 优化 AFLP 体系，构建了从福建省 17 个县市 50 份参试材料的 DNA 指纹图谱； 张国武等12 、温 强等13采用 ISSR 分子标记方法，建立了 25 个油茶无性 系的 DNA 指纹库。可见，应用分子标 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 6 记技术对油茶新品种（系）进行研究可 获得可靠的结果。据此，本研究拟筛选 出海南油茶优树并构建 DNA 指纹图谱， 为海南油茶资源开发利用提供可靠的科 学依据。 1 研究内容与方法 1.1 调查范围和时间 在查阅植物标本和相关文献资料 基础上，采用踏查法结合走访当地农户、 农林业部门、油茶加工点，尤其是油茶 果实或茶油收购商，对海南岛油茶资源 分布情况进行了全面的实地调查。同时， 对各分布区 15 年以上油茶林林分现状 进行了调查。项目组走访调查了海南省 海口、定安、文昌、琼海、澄迈、屯昌、 琼中、五指山和临高 9 个市（县）的 38 个乡镇（国营农场） ，重点调查了分布 区内的 35 个油茶林（表 1） ，这些乡镇 基本涵盖了海南省主要油茶分布区。调 查时间从 2013 年 9 月至 2015 年 11 月， 包括了 3 个油茶花果期。 1.2 优 选方法 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 7 通过实地调查，初步观测油茶的 树形、果实分布、果实大小和花芽分布 等情况，以及植株的病虫害情况，并剖 视果皮厚薄程度。初步估计树冠挂果平 均 1.0 kg/m2 以上，春梢枝数不少于挂 果枝数，80%以上的春梢有花芽，而且 花芽健壮、分布均匀者，即为初选优株。 在此基础上，分株采集充分成熟的果实 测定相关的性状指标，并在树干上挂牌 标记优树编号。 1.3 优树选择标准 油茶优树选择标准参照中华人民 共和国林业行业标准油茶第 1 部分： 优树选择和优良无性系选育技术规程 （LY/T 1730.12008）进行。海南油茶 母株优树选择的条件如下： （1）树形完整，树冠开张，生 长良好。 （2）无病或病害较轻，果实炭 疽病率在 3%以下。 （3）果实大小分布均匀，按冠 幅乘积计算，2 年平均单株鲜果产量为 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 8 1 m2 冠幅产茶果 1.0 kg 以上，小年产量 不低于大年的 50%；鲜果含油率 7%以 上；茶油酸价 0.3 以下。 （4）决选时，在上述条件相近 的情况下，优先选择亚油酸含量高的单 株（亚油酸的含量是选择和判断油茶品 种品质优劣的重要评价指标之一） 。 1.4 茶油理化性质 种仁含油率测定采用索氏抽取法， 具体步骤参照中华人民共和国国家标准 植物油料含油量测定 （GB/T 14488.12008） 。油茶籽脂肪酸甲酯的 制备按照 GB/T 173762008 标准进行， 按照 GB/T 173772008 标准进行气相 色谱分析。茶油酸值测定按食用植物 油卫生标准分析方法 （GB/T 5009.372003）中酸值的测定方法进行。 1.5 优树 DNA 指纹图谱构建 采用改良 CTAB 法提取油茶总 DNA，PCR-SRAP 扩增实验体系参考林 萍等10方法，然后取 10 L PCR 扩增 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 9 产物，用 1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行 检测，EB 染色后，在 Gel Doc XR 型凝 胶成像系统中观察、分析、记录，每个 反应重复 1 次。 根据 PCR 扩增产物的电泳结果， 采用人工读带的方法，在凝胶的某个相 同迁移率位置上有条带的记为“1”，无 条带的记为“0”，获得每个引物的 Excel 0-1 矩阵。扩增片段大小参照 DNA ladder 估测，扩增片段编号由引物编号 加片段大小组成。分别统计分析各优树 的特异标记、唯一缺失带以及单一引物 （组合）的特征谱带。筛选出最佳引物 （组合）后，根据 0-1 矩阵在 Excel 中 绘制胶板图的标准化图，从而构建油茶 优株的 DNA 指纹图谱。 2 结果与分析 2.1 海南油茶优树初选结果 2013 年 1012 月之间，通过实 地调查 35 个油茶居群（表 1） ，实测 243 株油茶树，结果表明，海南油茶种 仁出油率较高，平均值为 51.98%，海 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 10 南不同油茶居群茶油的出油率变化不大， 变异系数仅为 4.21%；酸值、碘值和过 氧化值在不同油茶居群间的变化则较大， 平均酸值 0.45 mg/g，变异系数达到 38.6%；平均碘值 102.99 g/100 g，变异 系数为 20.62%；平均过氧化值为 3.39 mmol/kg，变异系数为 27.92%。从中初 选优树 30 株，这些初选优树的鲜果出 籽率均达到 38%以上，树体生长良好， 无病虫害。 在 2014 年 1012 月、2015 年 1012 月分别对上述初选优树进行复选 和精选，最终确定 5 株优树。5 株优树 的形态与经济性状表现分别见表 2 和表 3。 20132015 连续 3 年的观测结果 表明，所选优树的花白色，通常初花期 在 10 月下旬至 11 月下旬，果实成熟期 10 月中上旬至 11 月上旬，具有抗炭疽 病强、产果量高、含油率高等特点。单 鲜果重 26.6676.69 g，鲜果出籽率 45.57%52.00%，鲜果出油率 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 11 7.30% 10.93%，单位冠幅产油 0.110.21 kg/m2，产油量 770.551 470.05 kg/hm2，连续 3 年观测平均值见 表 4。茶油酸值在 0.210.30 mg/g 之间， 不饱和脂肪酸含量 85.78%89.10%， 亚油酸含量在 5.06%6.32%之间（表 5） ，相关特性指标表现优异。 2.2 优树指纹图谱 基于 SRAP 标记，以引物组合 Me1/Em4 可把 5 个优树区分开，构建了 直观、清晰、简单的 DNA 指纹图谱。 其中琼优 1 在 1 200 bp 处有特异带，琼 优 2 在 1 800 bp 和 850 bp 处有特异带， 琼优 3 在 500 bp 和 180 bp 处有特异带， 琼优 4 在 950 bp 处有唯一缺失带，琼优 6 在 1 500 bp 和 350 bp 处有特异带，均 可作为唯一特异性鉴别条带。 3 结论 3.1 筛选获得优树 5 株 本研究最终确定 5 株树，特 征为花白色，通常初花期在 10 月下旬 至 11 月下旬，果实成熟期 10 月中上旬 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 12 至 11 月上旬，平均单鲜果重 42.33 g， 平均鲜果出籽率为