改良线栓法制备大鼠脑缺血再灌注模型的经验总结

-精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 1 改良线栓法制备大鼠脑缺血再灌注 模型的经验总结 【中图分类号】R722.t2 【文献 标识码】B 【文章编号 】2095- 6851（2017）01-0-01 中国论文网 /1/view-12857516.htm 脑卒中是一种急性脑血管疾病， 而缺血性脑卒中的发病率高于出血性脑 卒中，占脑卒中的 60%一 70%。由于临 床研究限制，为弄清缺血性卒中的演变 过程和干预措施疗效观察，探寻缺血性 卒中的形成机制和防治策略，建立最接 近人类脑梗死的理想动物模型尤其重要。 大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery， occlusion，MCAO）模型被普 遍认为是局灶性脑缺血的标准动物模型 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 2 1。在脑缺血动物模型制作的研究中， 用大鼠建立 MCAO 脑缺血的动物模型 最为合适。制备 MCAO 模型的方法有 很多种，包括光化学法、三氯化铁法、 线栓法、自体血栓法、电流损伤法、自 发性 MCAO 法等2 。由于线栓法具有 不开颅、效果肯定、易操作等优点，是 常用的模型制备方法3-4。但该方法仍 存在技术要求高、模型差异性大、动物 死亡率高等缺陷。因此，如何建立稳定、 可靠、重复性高的 MCAO 动物模型成 为目前函待解决的问题5。造模过程中 笔者发现，一些微小的操作技巧也许就 决定着实验最终的结果，谨以自身经验 告之，希望让该科研课题的实验工作者 有所收获。下面将主要从术前准备、术 中操作及术后护理三方面进行详细讲述。 1.术前准备 1.1 实验大鼠的选择 有学者认为大鼠局灶性脑缺血再 灌注损伤模型的成功与合理选择实验动 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 3 物有关6-8 ，首先是性别，实验应选用 雄性 SD 大鼠，有研究表明，雌激素水 平的变化与缺血性脑血管病的发生和发 展有一定的关系。雌激素可减轻脑缺血 的损伤，具有神经保护作用，包括增加 脑血流量，阻滞兴奋性神经毒性损伤， 舒张血管等作用9。其次是体重，大鼠 体重的选择十分重要，它决定着大鼠血 管直径的大小，在适应性喂养约 1 周时 间后，根据制作的线栓头端的直径大小， 来大致估算大鼠血管直径的范围，最后 选择相应体重的大鼠进行实验。若体重 过轻，线栓直径相对较大，易损伤血管； 反之，则会因堵不住血管而出现持续性 出血，造模失败。我们实验选用的线栓 头端直径约 0.36mm，大鼠体重 250- 280g，通过试验发现，在进食情况下， 体重达 280-290g 的大鼠禁食不禁水 12 小时后，体重若维持在 260-270g 范围 内，血管直径状况最适宜。 1.2 实验材料准备 在实验材料方面，除了药物，动 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 4 脉夹、显微镊及结扎线的选择直接决定 着造模的操作时间和成效。首先，动脉 夹最好选用内侧有防滑齿的，防止脱落； 动脉夹不宜过大，影响操作。其次最好 配备显微镊，可用于分离血管及血管外 膜；最后在结扎线的选择上，最好购买 两种结扎线，粗线用来结扎大血管如颈 总，不易损伤血管，在解线时更方便， 细线用来结扎颈外断端及线栓口，这样 线栓更好转弯，扎线的松紧更好掌握。 2.术中操作 2.1 麻醉 选择适宜体重的大鼠，术前禁食 不禁水 12h，取出大鼠，用 10%水合氯 醛进行腹腔麻 醉，计量按照 3.5mL/kg，腹腔麻 醉时注意角度及进针深度，避免注射到 皮下。麻醉后 5-10 分钟，以指掐大鼠 尾巴没有挣扎为准。 2.2 分离血管 将大鼠取仰卧位固定于鼠板上， 头端朝术者，持无齿镊牵拉大鼠舌前部 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 5 到一侧口角处，剃除颈部毛发，碘伏、 酒精多次消毒颈部。以正中线行纵向切 口，切口不宜过于靠近下颌，长度约 1.5cm，用弯镊沿切口行钝性剥离，剥 离皮下筋膜、肌肉及甲状腺，用拉钩将 皮肤及肌肉拉开，充分暴露。尽量将气 管两侧的组织分离干净，暴露颈总，沿 气管右侧（笔者实验为右侧）进行血管 分离，并仔细将颈总动脉上附着的筋膜 全部分离，用弯镊从血管下面向两侧分 离，直到看到颈内动脉和颈外动脉的分 叉，切记小心与颈总伴行的迷走神经， 由于个体差异，有些大鼠的迷走神经会 横跨颈总后再向下行，要注意尽量少的 刺激迷走神经，利用筋膜将其分离开。 2.3 结扎 利用拉钩充分暴露 CCA、ICA、ECA，注意分清 ICA 和 ECA，大鼠的颈外和颈内的分布与人类 有所差异，近似于上下分布，颈外在上 偏内，颈内在下偏外。用手术线分别穿 过 CCA、ICA、ECA 做备用，在 CCA -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 6 尽量靠近心脏的方向用粗线结扎，活结， 充分剥离 ECA，在 ECA 靠近头端处打 死结，靠近分叉处放置一细结扎线备用。 用微动脉夹尽量远离分叉口夹闭 ICA， 颈内动脉的结扎是暂时的。 2.4 插线栓 在 ECA 距分叉处 4mm 处，用显 微剪头朝下剪一弧行小口，此时注意是 否有血持续渗出，若有，表示结扎不牢， 可尝试拉紧结扎线，切记此时不能松开 动脉夹，否则会造成大出血。接着夹持 线栓由 ECA 上的切口向分叉方向插入， 左手可提拉起 ECA 头端地结扎线固定 血管，镊子夹太紧会使线栓头变形。待 鱼线进入 CCA 后放手，然后用备好的 结扎线栓紧切口，注意不能越过 OA， 否则会持续出血，必要时可结扎 OA， 此时结扎的松紧度非常重要，过紧则线 栓插入困难，过松则会出血、脱落，以 松开动脉夹后不出血为度。剪掉多余线 头，剪断 ECA，然后用两个弯镊一面夹 住己经进入的鱼线和血管，一面夹住外 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 7 面的鱼线，进行f 送，在分叉处倾斜 巧度角转向进入 ICA，遇到动脉夹阻挡 后，松开动脉夹，继续向内插入。插入 约 10mm 左右，有时会感觉有阻力，是 由线栓穿颅时遇到狭窄所致，此时硬行 推入易损伤血管。应将线栓缓缓退至切 口处，调整方向再缓慢插入，技巧是一 手用显微镊向上抬起 ICA 靠颅段，另一 手持镊子稍下压使线栓尽量保持水平插 入，约当线栓标记点靠近切口时，即插 入 16-18mm 左右，感觉到轻微阻力时 停止插入，不宜超过 20mm，切记操作 者动作一定要轻柔，否则易导致蛛网膜 下腔出血而死亡。应注意线栓在血管里 多次进退可诱发血小板、白细胞劲附， 损伤或刺激血管内皮细胞引起某些活性 物质释放诱发血栓，造成动物存活时间 缩短10。 2.5 缺血与再灌注 线栓插入成功后，记录缺血开始 的时间，浸泡过生理盐水的脱脂棉球覆 盖伤口。给大鼠保暖。缺血 90 min 后 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 8 缓慢拔出鱼线，拔线时速度过快或麻醉 不好大鼠抽动，会引起蛛网膜下腔出血 甚至拉断血管，导致大鼠死亡。在缺血 的 90min 时间里，中途需要补充麻醉， 根据实验经验，若造模耗时在 30min 以 内，在缺血 1 小时后可再次注射 0.2- 0.3ml 水合氯醛，这里要注意不要注射 过多，容易死亡。若大鼠有牙齿挫动或 手脚抽动为苏醒前指征，此时注射麻醉 效果减弱，若大鼠苏醒，应固定头颈部 及四肢，防止动作过大线栓损伤血管。 拔出线栓时，小心残端出血，为防止出 血也可不将线栓头全部拔出，扎紧残端， 不影响再灌注即可。用镊子小心解开颈 总活结，切记不要用剪刀，避免损伤血 管引起大出血，生理盐水清理伤口，观 察无内出血后逐层缝合伤口，乙醇消毒， 对皮。 3.术后护理 术后 20-30 分钟，小鼠苏醒，待 生命体征稳定后，符合入组标准的大鼠 在室温 25 摄氏度环境下单笼饲养，自 由进食，滴管喂水。在术后护理阶段， -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 9 有学者认为可给予生理盐水、速尿，在 我们实验过程中，术后大鼠清醒给予生 理盐水腹腔注射，之后若大鼠食欲不佳， 消瘦明显，可给予生理盐水灌胃，期间 未使用速尿及抗感染药物，实验发现极 少大鼠因感染死亡。室温的控制对大鼠 的恢复十分重要，低温低代谢状态对脑 缺血有保护作用，而温度过高会加重脑 缺血损伤，甚至导致动物死亡。实验发 现缺血症状越明显的大鼠越消瘦，也更 易死亡。 综上所述，在造模过程中，主要 出现的两大问题就是大出血及插线困难 11，如遇大出血，有条件可电凝止血， 无条件应先用镊子或动脉夹迅速夹持住 血管，结扎、清理后再行操作，防止再 出血及血栓形成