【毕业学位论文】（Word原稿）卵巢癌细胞系中miRNA表达差异的比较与miR-199a预测靶基因GSK3β的相关性研究

3 分类号 单位代码 :10159 学 号 :200820918 硕士学位论文 题 目 ： 卵巢癌细胞系中 达差异的比较与测靶基因 in 研 究 生 ： 导 师： 学科专业 ： 生物化学与分子生物学 论文课题起止时间： 2009 年 12 月 2011 年 3 月 论 文 完 成 时 间 ： 2011 年 3 月 4 目 录 一、 摘要 中文论著摘要 3 英文论著摘要 6 二、 英文缩略语 10 三、 论文 前言 11 材料与 方法 14 实验结果 20 讨论 24 结论 26 四、 本研究创新性的自我评价 27 五、 参考文献 28 六、 附录 综述 32 致谢 45 个人简介 46 5 中文论著摘要 卵巢癌细胞 系 中 达差异 的比较 与 测靶基因 相关性研究 目 的 卵巢癌是一类高致死率的妇科肿瘤 , 90%发生于卵巢表面的上皮组织，其余发生于卵巢的间质细胞和生殖细胞。卵巢表面上皮细胞的特征与正常的上皮组织不同，它具有间质细胞特征。卵巢上皮组织虽然与输卵管和子宫内膜上皮组织胚胎来源相同，但是这 两 种组织具有正常上皮组织特征能够表达 皮钙粘素）和其他 白。卵巢上皮细胞转变成肿瘤细胞以后才会表现正常上皮特征，如 表达，而其他上皮组织肿瘤在肿瘤发展过程中丢失 达。卵巢肿瘤的组织性分类取决于其在发展过程中所获得的组织特征，如浆液性 （输卵管） ，子宫内膜性 （子宫内膜） ，粘液性 （宫颈管内膜） 与透明细胞性 （ 中 肾上皮组织） 。近年来，人们开始从分子生物学的角度着手研究卵巢肿瘤的发生发展，卵巢肿瘤的组织特性和其致癌基因的突变，这两方面的信息促使对卵巢肿瘤新的分类。根据卵巢肿瘤的发展 特征的不同，卵巢肿瘤可分 为一型和二型。一型卵巢肿瘤发展慢，包括良性、边界性和恶性三个 阶段和这种癌症 包括低等浆液卵巢癌、粘液卵巢癌、子宫内膜卵巢癌、恶性 瘤和透明细胞卵巢肿瘤。其中浆液癌有 因突变，粘液癌有 变，子宫内膜癌存在微卫星不稳定等。二型卵巢肿瘤发展快，很少见前体肿瘤，恶性程度高，治疗难度大，包括恶性浆液卵巢癌、恶性混和中胚层性肿瘤（ 未分化卵巢癌，一般有 因突变。 一类非 编码 们基于与靶 序列互补抑制翻译起6 始，或者导致靶 解，在细胞中发挥重要作用。到目前为止，人们已经发现了几百个 们的表达取决于细胞的组织类型。研究已经表明 卵巢肿瘤中，一些 达升高 和一些表达，其中 族高表达， 族低表达 。除了这两个家族以外， 族、 存在表达差异。肿瘤的转移和侵袭能力与细胞的上皮细胞向 间质细胞转化（ 一生物化学过程密切相关。最近的研究表明，一些特殊 表达变化能够促进这一过程，如 族的低表达能促进卵巢肿瘤细胞的上皮细胞向间质细胞转化，从而提高细胞的转移和侵袭能力。研究表明， 表达升高 与卵巢癌的 药性有直接关系， 够抑制某些具有促进 程的基因的表达。 本研究以三种卵巢癌上皮细胞系为研究对象，探讨已经证明的 表达差异，并探讨 其预测靶基因糖原合酶激酶 3（ 可能的关系。 方 法 1、细胞培养， 将卵巢上皮 癌细胞系 种到含10%小牛血清、 100U/霉素和 100g/霉素的 养基中，在饱和湿度 37 、 5%孵箱中传代培养。 2、 应用 方法检测 ）、 基 因 三种卵巢癌细胞系中的表达差异。 3、 应用实时 方法检测 三种卵巢癌细胞系中的表达差异。 4、应用 法检测蛋白浓度。 预测 基因数据库显示 抑制 以我们应 用 方法检测 2780 和 的表达差异。 结 果 7 1、 果 显示 ， 转 移细胞系 没有表达，在上皮特征卵巢癌细胞系 有表达 。 均有表达，但在 有表达。 2、 实时 果显示 ， 转移细胞系低表达，而在 具有 上皮细胞特征的卵巢癌细胞系 高 表达 ； 耐药性细胞系 的 表达 高于 其在弱耐药性细胞系的表达 。 3、 果显示，在不同卵巢癌细胞系中， 已经证明的 靶基因 达有差异， 在 胞 中 表达 最多， 表达 最少 。 测靶基因 平上 表达 没有明显差异。 4、 果显示，在不同卵巢癌细胞系中， 测靶基因达 水平上有明显差异。 结 论 1、 本研 究表明 与卵巢 癌 细胞转移能力有关的 在转移 癌细胞系 中 比 未转移 中 表达 低 ，其中 达 差异 最明显 。 2、 在三种卵巢癌细胞系中 预测靶基因 达水平相反，这表明它们之间可能存在抑制关系 。 关键词 卵巢癌； 皮细胞向间质 转化 8 英文论著摘要 in is a of 0% of in of 0% in of of of is in of is to of to to In of of of of of up on of of in of of of of I. to to s I it is to is of no an of in At of to of in is of in is is in in of to be to of in of of or to MT in to of to MT as to in of to ( 、 of 2780, 0% 100 U/ml 00 g/ml in 7C % 10 2、 to ), at in 3、 CR to of in 4、 to in So we to of in 2780 、 2780 2、 CR in 2780 to in to 3、 a of in s t at in 4、 in he in of in of is to as by of in of is 1 in is to of ; 2 英文缩略语 英文缩写 英文全称 中文译名 导的沉默复合物 糖原合酶激酶 3 脂酰肌醇 皮细胞向间质 转化 域受体 1 油醛 on 源性磷酸酶 皮细胞生长因子受体 B 富含 用域 3B 低氧诱导因子 1 细胞生长因子 指增强子结合蛋白 管内皮细胞生长因子 氧化酶 录信号转导子和活化子 皮缩血管肽 因子 B 制因子 细血管扩张 性 共济失调症 突变蛋白 13 论文 卵巢癌细胞系中 达差异的比较与 测靶基因 相关性研究 前 言 卵巢癌是一类高致死率的妇科肿瘤， 90%发生于卵巢表面的上皮组 织，其余发生于卵巢的间质细胞和生殖细胞。 卵巢表面上皮细胞的特征与正常的上皮组织不同，它具有间质细胞特征 。 卵巢上皮组织虽然与输卵管和子宫内膜上皮组织胚胎来源相同， 但是这种组织具有正常上皮组织特征 ， 能够表达 皮钙粘素）和其他 白 1。卵巢上皮细胞转变成肿瘤细胞以后才会表现正常上皮特征，如 表达，而其他上皮组织肿瘤在肿瘤发展过程中丢失 达。卵巢肿瘤的组织性分类取决于其在发展过程中所获得的组织特征，如浆液性 （输卵管） ，子宫内膜性 （子宫 内膜） ，粘液性 （宫颈管内膜） 与透明细胞性 （中肾上皮组织） 。近年来，人们开始从分子生物学的角度着手研究卵巢肿瘤的发生发展，卵巢肿瘤的组织特性和其致癌基因的突变的信息，使卵巢肿瘤有了新的分类。根据卵巢肿瘤的发展特征的不同，卵巢肿瘤可分为一型和二型 2。一型卵巢肿瘤发展慢，包括良性、边界性和恶性三个过程包括低等浆液卵巢癌、粘液卵巢癌、子宫内膜卵巢癌、恶性 瘤和透明细胞卵巢肿瘤。其中浆液癌有 因突变，粘液癌有 变，子宫内膜癌存在微卫星不稳定等。 一个信号通路的成员。 膜蛋白和能活化 通路 与 特殊基因转录有关。 路的重要成员。游离的 入胞核和活化特殊基因的转录。 号通路的抑制因子。 失活能够活化 号通路。 二型卵巢肿瘤发展快，很少见前体肿瘤，恶性程度高，治疗难度大，包括恶性浆液卵巢癌、恶性混和中胚层性肿瘤（ 未分 化卵巢癌，一般有 因突变。14 白是一个主要蛋白，它与细胞的增值抑制与凋亡有关系。一般 细胞受到各种受伤能活化 样能减少细胞基因组的受伤，而减少 肿瘤的可能性。除了卵巢肿瘤，大多数肿瘤类型都有 白的突变或者下调。 目前关于卵巢肿瘤的来源存有几个科学假说，其中如下两个假说 的 影响较大 ； 1. 性激素假说 ： 由于绝经后性激素血清浓度调控反馈机制失活，性激素浓度逐渐增加，促卵泡激素（ 黄体生成素（ 清浓度分别升到正常月经增生期的 10 20 倍和 3 4 倍。一般 女性的绝经年龄是在 47 55 岁，在美国女性卵巢肿瘤发生的平均年龄在 57- 59 岁，且有 50%是 65 岁以后的女士 3； 按照这个假说 ， 卵巢肿瘤发生的可能性取决于排卵次数。 流行病学 研究表明早期月经初始、晚期绝经、未经产和不育症等增加女士月经次数过程会提 高卵巢肿瘤的发生率，闭经过程如 生育多个孩子和长期喂奶会减少卵巢肿瘤的发生率。 家族性卵巢肿瘤有三种 ： 1. 遗传性卵巢癌 ； 2. 遗传 性非息肉性结肠癌和卵巢癌； 3. 遗传性乳腺癌和卵巢癌。由于卵巢癌症状与一般骨盆疾病症状类似， 所以卵巢癌的诊断有一定的难度。在绝经期间无故腹部不适、消化不良、腹胀、胀气、嗳气、便餐后的饱腹感、食欲损失等其它消化障碍症状是诊断卵巢癌可能发生的的指标 4。 一类非编码 们基于与靶 序列互补抑制翻译起始，或者导致靶 解，在细胞 增殖、分化、凋亡等生物学现象 中发挥重要作用。 生物学合成包括两个重要的步骤 ： 1、 的作用， 2、的作用 。 它们的转录一般应用 合酶 转录后它们形成发夹二级结构， 这种结构叫初始结构（ 胞核里的 把初始结构剪成前体结构， 前体结构（ 初始结构段，缺少两端的游离手臂。 前体 胞核转移至胞浆， 这 个 过程需要 白与 浆的 白 把前体 成双链 链 合物 （ 导的沉默复合物）接受 。 括 ， 白 等 。达到 双链 二个单链留在复合物中 。 具有 特异15 3端 合和抑制它的蛋白表达。抑制蛋白表达的机制有三种：切开， 2、 解，和 3、翻译过程不能结束。 植物界中 切开时 导的蛋白沉默的主要方法。在动物界中 解与翻译抑制是比较经常。 到目前为止，人们已经发现了几百个 们的表达取决于细胞的组织类型。研究 已经表明 能作为潜在的癌基因或抑癌基因。在卵巢肿瘤中，一些 表达和一些 表达，其中 族高表达5， 族低表达 57， 除了这两个家族以外， 族、 存在表达差异。肿瘤的转移和侵袭能力与细胞的上皮细胞向间质细胞转化（ 一生物化学过程密切相关。最近的研究表明，一些特殊 表达变化能够促进这一过程，如 及 族 9的低表达能促进卵巢肿瘤细胞的上皮细胞向间质细胞转化，从而提高细胞的转移和侵袭能力。研究表明， 高表达与卵巢癌的 药性有直接关系 10， 够抑制某些具有促进程的基因的表达 。 本研究以三种卵巢癌上皮细胞系为研究对象，探讨已经证明的 未被证明的 间 的表达差异，并探讨 能 存在 的关系。 本研究 选用 种卵巢上皮 癌细胞系 。其中，胞系具有上皮组织形态但一般用于转移和侵袭细胞模型 1112， 所以我们把 为转移或侵袭细胞模型。虽然 胞系具有上皮特征，但是这种细胞在细胞膜存有 3和 4受体，分别命名为 是转移和侵袭促进因子， 在卵巢癌腹水中这种配体的浓度一般较高。 报道 胞系是一种具有上皮组织特征的细胞系 15 ， 这种细胞 具有 达 ， 但 蛋白表达较少， 般在间质细胞类型中的表达 较 高。 细胞凋亡需要 活化，而细胞生存则需要它的失活， 磷酸化状态决定肿瘤细胞的转移和侵袭能力。 酸化分别导致失活和活化。活化的 直 接导致 录因子的蛋白酶 体 依赖16 的降解，使其在细胞存活时 由 胞核向胞浆转移 16。另外， 能通过 转录 17，许多研究已经阐明 录因子能促进上皮肿瘤细胞 由 上皮细胞向间质细胞的转化。目前， 初步 确认特异的 间的抑制性关系 需要 检测 细胞中相应的两个基因的表达水平 。 应 用双荧光素报告基因系统实验 进一步的研究 确认 靶 3目标序列与特殊 抑制性 作用。一般 进行实验之前需要 应 用预测 基因 的数据库检测 间的相关性。 目前 数据库 提供的数据取决于一些决定因素如 间的互补性、二者的热稳定性和目标序列的保守性 。 其中 常用的数据库。 这 三个数据库预测 着不同程度的相互作用关系 。 本研究通过实验加以 探讨 二者是否具有此种关系。 材料与方法 一、 实验材料 （一） 主要仪器 二氧化碳培养箱： 国 显微图像分析系统： 司 美国 倒置显微镜： 本 实时 ： 500 美国 超声破碎仪： 国 恒温水浴箱： 海森信 中国 转印槽： 京六一 垂直电泳槽： 海天能 水平摇床： 京六一 电泳凝胶成像分析系统： 色列 ： 20 梅特勒 磁力搅拌器： 门其林贝尔 冰箱： 南新飞 微量离心机： 仪 17 旋涡振荡器： 门其林贝尔 封口机： 州正雄 （二） 主要试剂 取细胞裂解液 国 I 1转录试剂盒： 本 剂盒： 德国 体 ： 博奥森 中国 根 过氧化物 酶 标记的山羊抗兔抗体 ： 美国 养基： 国 标准胎牛血清： 天津灏洋 中国 （三） 细胞系 卵巢上皮细胞系 购于 中国科学院 细胞 库 卵巢上皮细胞系 购于 中国科学院细胞库 卵巢上皮细胞系 购于 中国科学院细胞库 二、实验 方法 （一） 细胞培养 用含 10%的标准胎牛 血清， 100U/霉素和 100g/霉素的 糖培养基在 37 温度、饱和湿度和 5%情况下孵箱培养三种细胞系 无钙离子 冲液冲洗细胞后用 胰酶 (含 化 1 6照细胞系种类），按照 1:2 至 1:4 比例传代细胞。 （ 二） 测 表达 1、 总 取 用预冷的 冲液洗涤细胞，然后每 10入 1温静置5胞裂解后，将混合液转到 心管里，每 1入 仿，剧烈18 震荡 15温静置 3 在 4 、 12， 000g 离心 15上清至已去除的离心管里，每 1清加入 丙醇，室温静置 10 4 、12,000g 离心 10上清，加 入 10%乙醇， 4 、 7,500g 离心 5上清，室温干燥 5 15 ， 沉淀溶于 10 20 ， 将所得 80 保存。取 1l 加入到 79l 中，测量其 280， 可计算 度当280 比值在 间时为纯 度（ g /L） =40 稀释倍数 /1000 2、 逆转录 （ 按照 I 1st 明书进行逆转录。反应体系为 1 板总 1l 物（ 50 1l 合液（每种10无 水补至 10l。 65 保温 5，冰上迅速冷却。然后在上述反应液中加入 4l 5逆转录缓冲液， 抑制剂（ 20U）， 1l 逆转录酶（ 200U）然后补无 水至 20l。缓慢混匀后， 42 保温 609554 5后将所得到的 保存。 逆转录用总行。操作如上所述但按 的研究 18改变了几个步骤，如 图 1 所示。采用 1l 5构的特殊逆转录引物（ 10M）逆转录特异 1），用 1l 小 游引物（ 10M）逆转录 2），用 为内参。逆转录反应条件如下： 16 300 302 30 60 个循环 50 15 5 保存 所得到的 第一链 80 保存。 19 图 1， 转录 过程 3、 实时 通 检测特异基因的平；实时 检测 达水平。其中， 下游引物序列见表二。 采用 aq 剂盒进行 应。反应体系如下： 25l 2 2/2l 10M 上 /下引物、 1l 含 50l 20l 去离子水。 应条件如下： 94 54 30030 25 30 个循环 72 302 5 保存 使用 剂盒进行实时 应体系如下： 上 /下游 异引物（ 10M）， 1l 板（ 50 75l）和补水至 25l。上游引物 53游引物相同，如图 2 所示。内参 应体系中上 /下游引物各为 每20 个 管有 1l （ 10M），补水至 25 l 反应体积。使用 时 ，反应条件如下： 95 15启动 合酶， 94 15 60 1个步骤