原人参二醇型人参皂苷化合物k的降血糖作用2型糖尿病高脂肪的饮食结合诱导小鼠通过抑制肝糖原异生菌素

原人参二醇型人参皂苷和化合物 K 通过抑制肝糖原异生对高脂肪饮食结合链脲霉素 诱导的 2 型糖尿病小鼠的降血糖作用， 摘要 从人参中提取的原人参二醇型人参皂甙（ PDG ）在肠道的最终代谢产物是化合物 K （ CK ） 。近年来虽然曾报道 CK 对基因小鼠模型（ db / db 小鼠）的抗糖尿病活性 ，但 是 CK 和 PDG 对 2 型糖尿病（糖尿病更普遍的形式）的治疗效果仍不清楚。在本次调查 中，我们开发了一种非胰岛素依赖型糖尿病的小鼠，近似地模拟出的人类疾病的代谢异常。 为了这个目的，结合链脲酶素（STZ）在雄性 ICR 小鼠体内诱导 2 型糖尿病。雄性 ICR 小 鼠喂食高脂食物 4 周，腹腔注射链脲佐菌素 100 毫克/公斤。 4 周后，小鼠（ 12 小时） 空腹血糖 7.8 毫摩尔/升以上的水平（ FBG ） ，被分成 3 组（n = 12 ） ，并用媒介物（糖 尿病模型， DM ）处理 ， 300 毫克/千克/ 天的 PDG 和 30 毫克/ 公斤/天的 CK4 周，同时 继续高脂肪的饮食。 CK 和 PDG 降血糖作用一贯表现出的空腹血糖水平，胰岛素增敏效 应在口服葡萄糖耐量试验（ OGTT ）中观察到 。此外， 对 2 型糖尿病小鼠降血糖作用 的机制进行了检查。糖异生基因，磷酸烯醇式丙酮羧酸（ PEPCK ）和葡萄糖-6 - 磷酸酶 （ G6Pase ） ，在两组治疗组中下降， CK 表现出更大的效果。这些发现证明了 ck 对 HFD / STZ 诱导的 2 型糖尿病的降糖和胰岛素敏感的能力，通过下调 PEPCK 和 G6Pase 在肝脏的表达。 1 介绍 2 型糖尿病是一个复杂的，异构的，多基因遗传病，特点主要是由胰岛素抵抗及胰岛 -细胞功能障碍1。餐后胰岛素分泌受损是由于功能缺陷和损失的胰腺 细胞的存在， 导致高血糖和随后的胰岛素的敏感性下降2,3。最近，越来越多的研究发现，糖异生是肝 葡萄糖升高的一个主要原因，促进释放 50-60的葡萄糖 4 。通过糖异生途径产生的过 多的肝葡萄糖是 2 型糖尿病患者的血糖水平升高的主要原因5,6。糖异生的速率受两个速 率限制的活性糖异生酶的调节，磷酸烯醇式丙酮酸羧（ PEPCK ）和葡萄糖-6 - 磷酸酶（ G6Pase ） 7。抑制肝糖原异生（抑制 PEPCK 和 G6Pase 表达）有助于糖尿病患者通 过胰岛素增敏剂控制血糖 8。因此，抑制肝糖原异生是治疗 2 型糖尿病的优良目标。 虽然有几种药物可用于治疗糖尿病，副作用和不良反应受到极大关注。最近，许多研 究人员正在寻求天然产品或饮食干预措施来预防或治疗 2 型糖尿病。几千年的药学实践中， 在传统的中国医疗系统已累计大量治疗糖尿病的宝贵经验。至目前为止，人参（人参 C.A 迈耶）被认为是作为糖尿病治疗的一个最强大的互补和替代药物9,10。一般来说，人参的 药理性质主要归因于人参皂甙，主要分为原人参二醇型人参皂甙（ PDG ，如人参皂甙 Rb1 ，RB2 ， RC，Rd， Rg3 和 Rh2 ）和原人参三醇型人参皂甙（ PTG ，例如，人 参皂甙 Rg1， ）以达玛烷苷元骨架为基础 11。在我们先前的人参皂甙的抗肥胖活性调查 中，发现 PDG 显着抑制体外胰脂肪酶活性在和减少高脂食物喂养的小鼠血脂 12 。众所 周知， PDG 口服后经肠道细菌代谢，他们最后的衍生物 20 -O- -D -吡喃葡萄糖基 20 （ S） - 原人参二醇，也命名为化合物 K （PDG 在肠道吸收后的主要形式） 13,14。最 近， CK 的多种生物活性日益受到重视，包括抗癌15,16，抗炎17和保肝效果18 。 CK 的结构示于图中。 1。 本次调查之前，一些研究人员也证实在 db / db 小鼠的血糖降低和胰岛素敏感性增加 19，以及 HepG2 蜂窝甘油三酯积累的减少与 CK 处理20。直到现在，虽然已经很少关 注 CK 在 2 型糖尿病治疗中的作用，一个更为普遍的糖尿病类型。此外，鉴于 CK 抑制肝 糖原异生，这可能代表了 CK 在控制血糖中的一种新机制。综上所述，本研究的首要目标 是开展 CK 的降血糖作用和 HFD / STZ 小鼠中的 PDG 和研究抗糖尿病活性的机制。这里 给出的数据表明， CK 发挥抗糖尿病作用部分是通过下调 PEPCK 和 G6Pase 表达。据 我们所知，这是第一次报告在 CK 通过抑制肝糖原异生改善高血糖。 2 材料与方法 2.1 。物料 STZ 购自 Sigma Chemicals，胰岛素购自中国长春 Eli Lilly，葡萄糖，总胆固醇（TC） ，甘油三酯（TG）检测试剂盒获得从 BHKT Clinical Reagent Co., Ltd，北京，中国;碘 125I胰岛素放射免疫分析试剂盒购自 Tianjin Nine TripodsMedical ，其他试剂购自北京化学厂，北京，中国。本研究中使用的化合物 K 从 人参根中通过一系列色谱法分离和纯化，通过对照光谱数据阐明其结构。通过 HPLC-UV 分析其纯度确定为 98.5以上。 2.2 PDG 到 CK 的生物转化 PDG 按前面的方法从人参根部分离 12。蜗牛酶是在优化的条件用于转换 PDG 到 CK。总之，蜗牛酶和 PDG 在 pH 值= 4.5 的乙酸钠缓冲液中孵化过夜，搅拌温度为 50 和 20的酶量反应 24 小时。随后将混合物在 90的水浴中放置以终止酶反应。将反应混 合物分别蒸发，溶于甲醇，通过硅胶柱层析分离，得到 ck。图 2 显示酶制剂前和酶制剂后 PDG 色谱图。 2.3 。饮食和动物模型 普通饲料由 5 的脂肪，53 碳水化合物，23蛋白质，总热值 25.0 千焦/千克，高脂肪 的饮食，由 48 的碳水化合物， 22 的脂肪和 20 的蛋白质组成，总热值 44.3 千焦 /千克，吉林大学实验动物控股购买。 90 只熊性 ICR 鼠 （实验动物控股吉林大学） ， 18 至 22 克，分别安置在笼子里温度控制的房间，一个 12 小时光和黑暗循环。经过 1 周的饲 料和水随意使用，将小鼠随机分为 2 组。第一组（ N = 12 ，正常对照组 CON ）喂常规 食物。第 2 组（N = 78，高脂肪的饮食 HFD ）喂养高脂肪饮食。经过 4 周高脂肪饲料喂 养后， 第 2 组注入（腹膜内）溶解在柠檬酸盐缓冲液中（ pH 值 4.5 ）的链脲佐菌素（ STZ ） ，按 100 毫克/公斤体重的剂量，并在注射后 4 周测试空腹血糖（ FBG ）水平。该 第 1 组注射柠檬酸盐缓冲液。第 2 组小鼠 FBS 值大于 7.8 毫摩尔/ 升的随机分为 3 组（每 组 12 只）和继续高脂饮食。其中一组被用来作为高脂肪糖尿病控制组（ DM ） ，其他 2 组每天按 300 和 30 毫克/公斤体重的剂量分别口服灌胃 PDG 和溶解于 0.5 羧甲基纤 维素钠的 CK。 CON 和 DM 组的小鼠用 0.5 CMC Na 灌胃。每周记录体重和每日记 录食物摄入量。 在研究结束时，动物禁食过夜，并从尾巴获得血液样本收集到 EDTA 管，并置于冰浴 中。离心后，血浆收集并存储在-80。肝立即分开，收集及储存在液氮中，用于进一步分 析 2.4 空腹血糖（ FBG ）和口服葡萄糖耐量试验（OGTT ） 在整个 4 周治疗期间，每周尾静脉血液样本测定空腹血糖。口服葡萄糖耐量试验在治疗的 最后一周进行。禁食 12 小时后，动物按 2 克/公斤的剂量口服灌胃葡萄糖水溶液（40重 量/体积） 。在 0 和 120 分钟按葡萄糖氧化酶的方法测量血糖水平。 2.5 血浆胰岛素含量和胰岛素敏感指数 重复使用商业碘125I 胰岛素放射免疫分析试剂盒测量血浆胰岛素水平。每次检测按试剂盒 说明书进行。一系列不同浓度的标准样品和样品平行操作。样品的胰岛素浓度参照相应的 标准曲线计算并用 mu/l 表示。 胰岛素敏感性指数（ ISI ）根据空腹胰岛素和葡萄糖浓度计算。ISI 的计算公式如下： ISI= Ln（FBG FINS） -1 2.6。血液样本中的血脂图谱评价 完成的 FBG 和 OGTT 约 24 小时后，下颈椎脱位处死乙醚麻醉的小鼠，通过心脏穿刺收集 血液。四组动物的血脂谱使用市售试剂盒如前面所述进行（北京 BHKT 临床试剂有限公司， 中国） 。 2.7。 Western blot 分析 等量的蛋白（50 微克/列）用 12SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分解和转移 到聚乙二烯二氟化物膜（Millipore 公司，马萨诸塞州） 。将膜分别与 PEPCK（1:1000）和 G6Pase 抗体（ 1:1000）保温。该连续培养适当的膜二次耦合辣根过氧化物酶和抗体在 ECLwestern 检测试剂的开发。免疫反应条带通过增强化学发光观察然后通过密度分析进 行定量 2.8 统计分析 数据分析由单向分析方差分析（ANOVA）使用 SAS11.1（SAS 研究所，卡里， NC）。治疗手段之间的差异用最小平均方差对比两组之间的差异，与 P0.05 有统计学意义。结果是：平均值标准差表示。 3 结果 3.1 酶法从 PDG 制备 CK 一般来说，CK 是口服 PDG 血液中检测到主要药理活性代谢产物。然而，CK 在多数 天然人参植物中不存在。因此，把人参皂苷转换成 CK 具有重大意义。迄今为止，酶法制 剂被认为是产生 CK 是一种有效方法，通过在 C-3 和/或 C-20 的位置裂解为两部分。一些 糖酵解酶的水解能力以糖苷部分，蜗牛酶，-葡聚糖酶，纤维素酶和淀粉为基础，用于评 价 PDG 转换为 CK。尽管上述的酶有相同的水解模式和能力，用蜗牛酶完全水解 PDG 只 用 24 小时可以得到。 3.2 高脂肪饮食和链脲霉素诱导的 2 型糖尿病特点 生成一个非遗传性的啮齿动物模型模仿胰岛素抵抗的和胰岛素缺乏的人 2 型糖尿病， ICR 小鼠用 HFD 喂食 4 周，然后注射链脲佐菌素，随后持续 8 周喂食高脂饮食 21。如表 1 所示 ，老鼠喂食 HFD4 周后在食品和热量的摄入展出了显著增加或增加倾向，相比喂食 常规饲料（ NPD ，正常的颗粒饲料） 。有超过 75的 HFD-糖尿病小鼠中具有显着性 高血糖，高胰岛素血症和肥胖。此外，初步研究发现，这些小鼠表现出一种稳定糖尿病和 肥胖状况，腹腔注射链脲佐菌素诱导糖尿病后至少持续 8 周。因此，我们选择它作为一个 2 型糖尿病模型研究 CK 和 PDG 的降糖效果 。 3.3 。 PDG 和 CK 对体重和食量的影响 在本次调查中，我们对 PDG 和 CK 在 HFD / STZ 小鼠体内的代谢指标进行了长期作 用。首先，我们发现， 用 STZ 处理小鼠 STZ 注射后体重下降很多。另外，与高脂肪的对 照组小鼠相比 STZ 诱导的糖尿病小鼠 1 和 4 周食物和液体的摄取量增加了。CK 按 30 毫 克/千克/天的剂量处理后，4 周治疗后食物摄入量降低并且和糖尿病控制组显着不同的。 PDG 治疗 300 毫克/公斤/天的剂量并没有改变食物摄入量显着糖尿病小鼠。尽管在整个治 疗期间高脂肪的饮食与正常对照相比增加体重，在整个研究期间 CK 和 PDG 治疗对体重 没有显着影响。 3.4 PDG 和 CK 对血糖的影响 CK 和 PDG 对糖代谢的影响用经过 12 小时的禁食和 OGTT 4 周每周测量的空腹血糖值评 价。如图表 2 中所示，30mg/kg/d 剂量 CK 处理能够降低（ P0.05 ）空腹血糖水平在第 4 周。 PDG 在 300 毫克/公斤 /天的剂量处理，空腹血糖水平也表现出了显着的降低。 CK 和 PDG 的敏感效应通过禁食过夜的 ICR 小鼠的 OGTT 评价（图 3） 。在 DM 组中血糖水 平增加，而 CK 和 PDG-处理组的 120 分钟后显着阻止血糖水平升高。这些结果表明 CK 和 PDG 治疗的血糖耐量性增加。 3.5。 PDG 和 CK 对胰岛素敏感性的糖尿病小鼠的影响 如表 2 所示，在 HFD / STZ 小鼠中 ck 处理导致胰岛的胰岛素含量和胰岛素分泌量显 着 metabolic 增加。然而，PDG 组的胰岛素增敏效果没有观察到（ P 0.05） 。 3.6 。血脂谱估计 血脂分析，包括总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG ） ，对高脂肪食物表现出显着增加 响（表 1） 。为了进一步评估 CK 和 PDG 的抗糖尿病效果，我们评估了不同组的与 2 型 糖尿病有关的代谢指标（ TG 和 TC ） 。与糖尿病控制组相比，CK （ 30 毫克/千克）和 PDG （ 300 毫克/千克） ，显着（ Pb0.05 ）降低 38.5和 44.9TG， TC 分别降低 为 11.0 和 6.26 ， （表 2） 。 3.7 CK 抑制肝脏中的糖异生基因的表达 调查肝糖原异生，我们检查了肝脏中 PEPCK 和 G6Pase 的表达。 PEPCK 和 G6Pase 是肝细胞中糖异生过程两个重要的限速酶。 PEPCK 和 G6Pase 的蛋白水平主要由基因 转录控制的。在对照组的肝脏，这两种酶的蛋白质显着减少（图 4） 。 4 讨论 在过去的几十年中， 2 型糖尿病（ T2DM ）患病率已迅速增加，目前被认为是全球流行 病 22。因此，迫切需要 2 型糖尿病更好的新的治疗方法。为了实现这一目标，建立一个 适当的实验动物模型至关重要23。至目前为止，一些自发实验性糖尿病动物模型可用于 2 型糖尿病的研究，其中一些具有与 2 型糖尿病患者病理功能相似的特征 24 。然而，这 些糖尿病动物模型不发展或表达为人类的症状25,26。因此，通过调整现有的方法和/ 或开 发新方法或两者的组合建立更好的 2 型糖尿病的动物模型是一个持续的追求过程。 在前面的调查，我们已经通过喂食高脂肪的饮食开发大鼠模型，低剂量 STZ 会模仿疾 病的自然过程（从胰岛素抵抗到细胞功能障碍）以及 2 型糖尿病人的代谢特性 27-29 。 认为大鼠喂食高脂肪的饮食和低剂量链脲佐菌素处理可以作为 2 型糖尿病的一种替代动物 模型，很少有研究评估小鼠模型的特点，这对治疗 2 型糖尿病的新药的实验研究和临床前 试验很重要。因此，一个合适的 2 型糖尿病小鼠模型，模仿人类 2 型糖尿病的代谢特点， 虽然很便宜和容易，但是是迫切需要的，这对中药筛查很合适。 一般来说，2 型糖尿病的人，胰岛素的分泌和功能都缺失 30 。因此，模仿人类 2 型糖尿病的发病机制和临床特征的实验动物模型最好应具有这两个特点。在可利用的动物 模型中，某些菌株遗传性高血糖和/或肥胖已被广泛用于在研究中如 OB / ob 小鼠31 ， KK - AY 鼠标32 ， Zucker 大鼠33 。然而，这些自交系糖尿病模型相对昂贵且不易产生。 因此，已经研究了在啮齿类动物中开发 2 型糖尿病模型的原因，如生成时间短，和经济方 面的考虑。 先前的研究已经表明， HFD 喂养的老鼠已经轻度高血糖，由于链脲佐菌素致糖尿病 作用小鼠变得更容易发展显着的高血糖和高脂血症，这类似于人类的 2 型糖尿病患者34。 TG 和 TC 的显着增加是 HFD / STZ 诱导的糖尿病小鼠高脂血症的已知标志。 人参的根历来被认为是一般的补药或调理以保持身体抵抗不利因素和动态平衡。现代研 究已经表明，人参的大部分的药理作用是人参皂甙。根据糖基，在 C-3 ，-6 和-20 位置苷 元，各人参皂甙可分为 PTG 和 PDG 12。 PDG 组的糖部分连接到 C - 3 的位置，而 PTG 组连接到 C -6 位。先前的研究表明人参皂甙 Rb1 35,36 ， RB2 37 ，RC 38 ， 皂甙 Rh2 39和 Rg3 40 （ PDG 组）的降糖效果。然而，目前尚未见报道 PDG 和它的 代谢产物 ck 之间的抗糖尿病作用的比较， ，比较 CK 和 PDG 之间的抗糖尿病活性是有趣 的。 目前的工作是第一次进行全面和系统地研究，探讨 PDG 和