南方医科大学博士硕士中期考核复件分生答案

分生 一名词解释： 1. mRNA 剪接（mRNA splicing）-mRNA 前体去除掉内含子而 保留外显子的修饰过程。通常 mRNA 前体能经由数种不同的剪 接方式，产生不同组态型式的 mRNA，使一段基因在不同的 组织或发育过程中能经过转录-剪接-转译后产生不同型式的蛋白 质，进而拥有不同的作用，或是产生出稳定性差的 mRNA 达到 调控基因表达的目的。这种剪接型态叫做选择性剪接。除了 mRNA 之外，有些 RNA 分子也有能力催化自身的修剪，例如核 酸酶会做自我切除，而第 I 或第 II 型外显子在特殊环境下可以不 借由蛋白质酵素的作用而进行剪接，称为自剪接作用。 2. 逆转录（reverse transcription）:是以 RNA 为模板合成 DNA 的过程，即 RNA 指导下的 DNA 合成。此过程中，核酸合成与 转录（DNA 到 RNA）过程与遗传信息的流动方向（RNA 到 DNA）相反，故称为逆转录。 3. 开放阅读框架：在 mRNA 的核苷酸序列中，有一段序列是一个特 定蛋白质多肽链的序列信息，这一段核苷酸序列从起始密码子开 始、到终止密码子结束，称为蛋白质编码区或开放阅读框，此段 核苷酸序列决定蛋白质分子的一级结构。 4. 限制性内切酶：限制性内切酶是一类能够识别双链 DNA 分子中的 某种特定核苷酸序列，并在相关位置切割 DNA 双链结构的核酸内 切酶。 5. 启动子：启动子是基因转录起始所必须的一段 DNA 序列，是基因 表达调控的上游顺式作用元件之一 6. 启动子：RNA 聚合酶特异性识别和结合的 DNA 序列。 启动子是 基因（gene）的一个组成部分，控制基因表达（转录）的起始时 间和表达的程度。启动子（Promoters）就像“开关” ，决定基因 的活动。 7. 管家基因 是指在一个生物生命全过程中以及一个个体的所有细 胞类型中均持续表达，很少受环境影响的基因。 8. 看家基因（housekeepinggene ）:看家基因 (house-keeping gene) 又称管家基因又称持家基因，维持细胞最低限度功能所不可少的 基因, 如编码组蛋白基因、编码核糖体蛋白基因、线粒体蛋白基 因、糖酵解酶的基因等。这类基因在所有类型的细胞中都进行表 达，因为这些基因的产物对于维持细胞的基本结构和代谢功能是 必不可少的。 9. 核小体：核小体是染色体的基本组成单位，它是由 DNA 和组蛋白 构成的，组蛋白 H3、H4、H2B、H2A 各两份，组成了蛋白质八聚 体的核心结构，大约 200bp 的 DNA 盘绕在蛋白质八聚体的外面， 相邻两个核小体之间结合了 1 分子的 H1 组蛋白。 10. 基因组: 基因组是指一个细胞或病毒的全部遗传信息。真核 生物基因组是指一套完整单倍体 DNA(染色体 DNA)和线粒体 DNA 的全部序列，既包括编码序列，也包括大量存在的非编码序列。 11. 粘性末端：被限制酶切开的 DNA 两条单链的切口，带有几 个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末 端。 12. 基因诊断：某些受精卵（种质）或母体受到环境或遗传等的 影响，引起的下一代基因组发生了有害改变，产生了（体质）疾 病，为了有针对性的解决和预防，故需要通过实验室的基因诊断、 基因分析才能得到确认。又称 DNA 诊断或分子诊断。用目前人 类对基因组的认识和分子遗传学数据，检查分子结构水平和表达 水平，对普通遗传病或家族遗传病做出的诊断。 13. 基因诊断（gene diagnosis）是以探测基因的存在, 分析基因 的类型和缺陷及其表达功能是否正常,从而达到诊断疾病的一种 方法.它是继形态学、生物化学和免疫学诊断之后的第四代诊断 技术,它的诞生与发展得益于分子生物学理论和技术的迅速发展. 二问答题： 1. DNA 的复制的基本规律： DNA 的半保留复制：DNA 在复制时，双链解开，按单链 DNA 的核苷 酸顺序，按碱基配 对原则合成新链，组成新的 DNA 分子，新形成的 DNA 分子与原来的 DNA 分子的碱基顺序 完全相同，每个子代 DNA 的一条链来自亲代，一条是重新合成的， 这种复制方式称为半保留复制。 DNA 的半不连续复制：DNA 复制时，一条链按 5-3的方向连续 合成，另一条链的合是不连续的，先按 5-3的方向合成若干的 冈崎片段，在通过 DNA 连接酶的作用合成一条链，这种合成方式称 为 DNA 的半不连续复制。前导链：DNA 复制中，按 5-3方向连续 合成,复制方向和复制叉移动方向相同，连续合成的一条链。 后随链：DNA 复制中，复制方向与复制叉方向相反，不连续合成 的链 复制叉：DNA 复制时在 DNA 链上通过解旋、解链和 SSB 蛋白的结 合等过程形成的 Y 字型结构称为复制叉。在复制叉处作为模板的双 链 DNA 解旋，同时合成新的 DNA 链，生物体的复制单位称为复制子。 2.原核生物体内转录是如何终止的？ 原核生物转录的终止有两种机制.一是需要蛋白质因子 （Rho ） 的参与, 因子能与转录中的 RNA 结合,启动 因子 ATP 酶活性, 并 向 RNA 的 3端滑动,划至 RNA 附近时,RNA 聚合酶暂停聚合活动, 使 RNA:DNA 解链分离转录的 RNA 释放种植转录. 另一是在立体系统中发现的,纯化的的 RNA 聚合酶不需要其他蛋白 质因子的参与,可使转录终止,即不依赖 因子的转录终止机制 ,模板 DAN 在转录终止点附近有特殊核苷酸序列可以形成颈环结构影响 RNA 聚合酶的构象使转录暂停,DAN 与 RNA 双链不稳定分离,转录 终止. 三.目的基因与载体（质粒）的重组（重组体的构建）程序如下： 1.质粒 DNA 的分离纯化。2.目的基因与载体的限制性内切核酸酶 的设计与应用；3.目的基因和线状载体 DNA 片段的分离和回收；4. 目的基因与载体的连接。外源 DNA 片段与载体 DNA 分子的连接， 即 DNA 分子的体外重组，主要依赖于限制性内切核酸酶及 DNA 连 接酶的作用。在进行连接时， 连接方法一般有两种。一种是用用两 种不同的限制酶同时酶解一种特定的 DNA 分子，产生具有两种不同 末端（粘性末端与另种粘性末端、粘性末端与平齐末端）的 DNA 片 段，那么可实现外源 DNA 片段定向插入载体分子。另一种是非互补 粘性末端 DNA 分子的连接。即在一定的反应条件下，可用 T4 DNA 连接酶将平齐末端的 DNA 片段有效地连接起来；对于非互补粘性末 端 DNA 分子，在用特异作用干单链 DNA 的 S1 核酸酶处理，使其 变成平齐末端后，也可用 T4 DNA 连接酶进行有效的连接。另外， 可采用附加衔接物（linker，是一种人工合成的双链 DNA 短片段， 其上具有一个或数个在将与其连接的载体 DNA 上不存在的限制酶识 别位点，可按平齐末端连接法给平齐末端片段加上相同识别位点的 衔接物，再用在衔接物中具有识别位点的合适限制酶切割，用常规 方法连接）的方法，提高平齐末端间的连接作用效率。也可利用接 头进行 DNA 平齐末端门的连接。接头（adaptor ）是一种具有粘性 末端的短核昔酸双链，它与平齐末端连接后，不用经过切割即可与 载体相连。 为了使连接反应物中尽可能多的外源 DNA 片段插入载体分子，以 形成重组 DNA ，必须阻止在限制酶切割后线性载体分子的自身环化 作用。 4.PCR 技术的基本原理和主要用途 1.PCR 原理：类似于 DNA 的天然复制过程，是以拟扩增的 DNA 分子为模板，以一对分别与模板 5末端和 3末端相互补的寡核 苷酸片段为引物，在 DNA 聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制 沿着模板链延伸，直至完成新的 DNA 合成，反复重复这一过程，即 可使目的 DNA 片段得到扩增。PCR 反应的特异性依赖于 2 个与靶序 列两端互补的寡核苷酸引物，取决于 2 个引物设计的好坏，依赖于 引物与模板结合的正确性，退火温度。 2.PCR 的过程：(1)DNA 模板变性 (denature)：95 左右高温使 模板 DNA 完全变性;(2)单链 DNA 模板与引物退火 (annealing)：引 物与模板形成复合物的几率DNA 分子自身的复性;(3)引物的延伸 (extension)：DNA 聚合酶在最适温度下催化 DNA 合成反应。5 端是 人工合成的引物，是特定的，3 端没有固定的终止点。 3.PCR 技术的特点：1）高度的敏感性：是最主要的特点，25 个 循环可扩增 106 倍，它可对单拷贝、单根头发、一滴血等微量标本 进行分析；2）高度的特异性：取决于 2 个引物设计的好坏，依赖于 引物与模板结合的正确性，退火温度；3）操作简便、快捷；4 ）适 用样品的广泛性。 4.PCR 技术的应用：1）基因分析：（一）基因缺失的检测； （二）基因突变的检测；（三）基因易位的检测；（四）外源致病 基因的检测；2）定位克隆； 3）序列分析。 5.列举 5 种 RNA 并对其功能进行简要介绍： 生物体内有14 个种类的 RNA: (1) 信使RNA(mRNA) ,携带从DNA 转录 来的遗传信息。(2) 转运RNA(tR2NA) ,负责蛋白质合成时氨基酸的转 运。(3) 核糖体RNA( rRNA) ,在核糖体中起装配和催化作用。(4) 具有 催化作用的RNA ,即核酶(ribozyme) 和其它 RNA 自我催化分子。(5) 基因组RNA(genome RNA) ,指一些病毒以RNA 为遗传物质。(6)指导 RNA(guide RNA) ,是指导RNA 编辑的小RNA 分子。(7)mRNA 样非编 码RNA ,其转录和加工方式同mRNA ,但不翻译为蛋白质。已知这类 RNA 有20 多种,例如人的xistRNA 和X染色体的 XIST结合,使此X染色 体失去转录活性。(8) tmR2NA ,本身既是tRNA 又是mRNA ,翻译时一 身二任。如大肠杆菌中的10Sa RNA。(9) 小胞质 RNA( small cytoplasmic RNA ,scRNA) ,存在于细胞质中的小RNA 分子。如信号识 别颗粒(signal recognition particle ,SRP) 组分中含有的7S RNA。(10) 小核RNA(small nuclear RNA ,snRNA) ,是剪接体的组分。(11) 核仁小 RNA(small nucleolar RNA ,snoRNA) ,参与rRNA 的加工。(12) 端粒酶 RNA ,是真核生物端粒复制的模板。(13) 反义RNA(antisense RNA) ,可 通过与靶位序列互补而与之结合的RNA ,或直接阻止靶序列功能,或改 变靶部位构象而影响其功能 6.RNAi 技术的原理及应用 RNA 干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保 守的、由双链 RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源 mRNA 高效特异性降解的现象。由于使用 RNAi 技术可以特异性剔除 或关闭特定基因的表达， （长度超过三十的 dsRNA 会引起干扰素毒 性）所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿 瘤的基因治疗领域。 作用机制：病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整 合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些 dsRNA。宿主细胞对这些 dsRNA 迅即产生反应，其胞质中的核酸内 切酶 Dicer 将 dsRNA 切割成多个具有特定长度和结构的小片段 RNA（大约 2123 bp） ，即 siRNA。siRNA 在细胞内 RNA 解旋酶的 作用下解链成正义链和反义链，继之由反义 siRNA 再与体内一些酶 （包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成 RNA 诱导的沉默复合 物（RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC 与外源性基因表达 的 mRNA 的同源区进行特异性结合，RISC 具有核酸酶的功能，在结 合部位切割 mRNA，切割位点即是与 siRNA 中反义链互补结合的两 端。被切割后的断裂 mRNA 随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些 mRNA 的降解反应。siRNA 不仅能引导 RISC 切割同源单链 mRNA， 而且可作为引物与靶 RNA 结合并在 RNA 聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP ）作用下合成更多新的 dsRNA，新合成的 dsRNA 再由 Dicer 切割产生大量的次级 siRNA，从而使 RNAi 的作用 进一步放大，最终将靶 mRNA 完全降解。 RNAi 在探索基因功能中的应用 人类基因组计划的完成：由于 RNAi 技术可以利用 siRNA 或 siRNA 表 达载体快速、经济、简便的以序列特异方式剔除目的基因表达，所 以已经成为探索基因功能的重要研究手段。 RNAi 在基因治疗领域中的应用 RNAi 作为一种高效的序列特异性基因剔除技术在传染性疾病和恶性 肿瘤基因治疗领域发展极为迅速。在利用 RNAi 技术对 H-1 、乙型 肝炎、丙型肝炎等进行基因治疗研究中发现，选择病毒基因组中与 人类基因组无同源性的序列作为抑制序列可在抑制病毒复制的同时 避免对正常组织的毒副作用。 肿瘤病的治疗 使用 RNAi 技术剔除黑素瘤细胞的 BRAF 表达，不仅抑制了肿瘤细胞 生长，而且减弱了其侵袭能力，为黑素瘤基因治疗奠定了基础。 研究表明趋化因子受体 CXCR4 是乳腺癌转移的重要调节因素，其配 体 CXCL12 可趋化肿瘤