发育复习题 老师给的重点

5. 经典 Wnt 信号通路及在发育中的作用 Wnt 是一类分泌型糖蛋白，通过自分泌或旁分泌发挥作用。 该途径参与了脊椎动物胚胎体轴的建立与分化、果蝇的分节等发育过程。 Wnt 的主要受体是 Frizzled(Fz)家族受体，属于 7 次跨膜蛋白，在结构上与 G-蛋白偶联受体类似。 Wnt/-catenin 信号的活化还需要另一个 Wnt 辅助受体 LRP5/6 (果蝇中的同源蛋白称为 Arrow)。 -catenin (果蝇中称为 Armadillo)是经典 wnt 信号通路中的效应因子。 -catenin 具有两种功能： 一方面它可与钙黏蛋白及肌动蛋白结合，从而将细胞粘连复合体与细胞骨架相连，对于细胞粘连具有重要作用； 另一方面，存在于细胞之中的可溶性 -catenin 参与了 Wnt 信号的传导。 在 Wnt 信号未激活，-catenin 与多种蛋白形成一个复合体并被 GSK3 磷酸化，然后通过泛素-蛋白酶体途径被迅速 降解。GSK-3：是一种蛋白激酶(糖原合成激酶-3 ） ，能将磷酸基团加到 -catenin 氨基端的丝氨酸/苏氨酸残基 上。当 Wnt 配体与 FzLRP6 结合时会诱导 Axin 与 LRP6 膜内部分结合，使得原蛋白复合体解聚。同时 fz 可通 过 Dsh 抑制 GSK3 的活性。-catenin 不能再被降解而在细胞质内积累，并进入细胞核内，与 T-细胞因子(T cell factor， TCF)家族的转录因子一起激活靶基因 (如 xnr3、 ，siamois)的转录。Wnt 信号途径可概括为： WntFrzDsh-catenin 的降解复合体解散 -catenin 积累，进入细胞核TCF/LEF基因转录（如 xnr3、 ，siamois ） 。 6. TGF 信号通路及在发育中的作用。 转化生长因子 是一类分泌性的信号分子超家族，包括 30 多个成员，可分为 TGF、BMP（骨形态发生蛋白） 、 Activin 等亚类。TGF 类分子以前体形式合成，需要经过加工才能成为有活性的成熟形式，其成熟单体之间通过 二硫键形成二聚体。 TGF 家族因子在早期发育中起关键作用： 1.TGF1，2，3，5 参与细胞外基质形成和细胞分裂的调节；BMP 在脊椎动物及果蝇胚胎的背-腹轴图式形成中起作 用； Nodal(BMP 因子亚类）在脊椎动物胚胎中胚层的图式形成及左右轴建立过程中起关键作用, 2. TGF 结合 RII 并诱导形成 RI 和 RII 结合形成四聚体；R 最丰富, 为细胞表面糖蛋白，能结合并富集细胞表 面附近的 TGF,但在胞浆中存在的时间很短，不能介导 TGF- 的活性.TGF 配体首先与型受体结合，进而 TGF- 的型受体也被募集到这一复合体中(形成四聚体） ， TR会磷酸化 TR ，并使其活化。 3.Smad 蛋白在传递 TGF 信号通路中非常重要激活的 RI 磷酸化 R-Smad，导致其变构，暴露出 NLS；两分子 R-Smad 与一分子 co-Smad(Smad4)相互作用，并与 importin（输入蛋白） 形成一个大的细胞质复合体整个复合体转位进 入细胞核，RanGTP 导致 importin 与之解离，形成一个激活的复合体；激活的复合体与靶基因的调节元件相互作 用调节基因的表达。 7. 简述附肢近-远轴发育的机制。 附肢中的骨骼成分是以近-远轴的方向建立的。 附肢沿近-远轴的分化由 AER 和附肢中胚层诱导的相互作用产生。 由 AER 释放的分子维持间质细胞不断进行分裂。 AER 刺激 PZ 细胞的增殖，PZ 决定 P-D 轴生长程度 渐进带（progress zone，PZ ）：为 AER 内侧保持有旺盛分裂能力的间质细胞区域,在附肢顶端被切除时，附肢的向 外生长停止一旦细胞从生长的顶端离开，其位置信息就固定了 2. PZ 决定附肢的 P-D 极性,当年幼的顶端移植到老的断肢上时，具有加倍的肱骨、桡骨和尺骨,老的顶端移植到年 幼的断肢上时，桡骨和尺骨缺失 3.间质细胞离开 PZ 区的时间决定其分化命运 中胚层细胞一旦离开渐近带和脱离 AER 的影响，它们的命运就不可逆地被固定；一个细胞的位置信息由其在 AER 下的时间长短决定。4.近/远轴的发育的机制 AER 中合成并释放（FGF-2）,刺激间质细胞增殖,当除去 AER 后，植 入的可释放 FGF-2 的念珠将代替 AER 的作用,附肢近远轴的建立过程 附肢内中胚层细胞的命运是由它们在渐进带的区域中保留多长时间决定的： 在渐进带中细胞持续增殖，那些首先被推离渐进带的细胞脱离开 AER 的影响，将形成附肢最近端的成分； 而那些在渐进带保持较长时期的细胞将形成附肢较远端的成分. 8. 简述初级胚胎诱导的三个阶段 经典实验胚胎学将脊索中胚层诱导外胚层细胞分化成神经组织这一关键的胚胎诱导作用称为初级胚胎诱导 初级胚胎诱导的三个阶段： 第一阶段发生在卵裂期，为中胚层形成和分区； 第二阶段为脊索中胚层诱导背部外胚层转变为神经系统的神经诱导； 第三阶段是中央神经系统的区域化。 1.中胚层的形成和分区 中胚层来源于位于动植物极交接处的边缘带细胞，由位于其下方的植物极细胞诱导形成。 囊胚最背部的植物极细胞（富含背前部决定子）能诱导组织者的产生，它被称为 Nieuwkoop 中心。 2.神经诱导 神经诱导的非特异性（诱导者） 松节油、美蓝染料和甲醛，死的原肠和各种动物成体的一些组织都能诱导出神经板。 神经诱导所必需的反应 第一激活在外胚层表面的蛋白激酶 C（PKC） ； 第二在外胚层细胞内 cAMP 浓度的增加。 实现神经诱导二者缺一不可，而每个反应可能是由不同分子起始的。 1.组织者的诱导作用信号不是扩展到周围表面，而是中胚层向上传递。从底部的中胚层传递到表面的外胚层 2.在用背部和腹部外胚层进行诱导实验中神经基因的表达 从胚胎背部和腹部取得的外胚层包裹一片脊索中胚层。然后将它们分开分别测定神经 mRNA 的表达。结果，中胚层 中没有、腹部外胚层微表达，背部外胚层含有高浓度的神经 mRNA。 3.神经诱导的 2 套信号 第一套信号使背部外胚层倾向于变为神经板（约存在于 8 细胞期；另一个可能是由早期胚孔背唇分泌的，它移动 穿过外胚层。 第二套信号可能来自侧部背唇以及外胚层下的脊索中胚层，它们诱导外胚层形成神经管。 已经发现的具有神经诱导作用的分子包括 Noggin，inhibin，follistatin 等 3.中央神经系统的区域化 在神经胚期，中胚层靠后方较厚，越往前越薄； Xhox-3 基因产物在中央神经系统的区域化中起着重要的作用； 在晚原肠胚和早神经胚期间有一个活性高峰；活性最初基本上被局限于中胚层中；在中胚层前部和后部存在浓度 差。 四.问答 1. 试述顶体反应的调控机制。 顶体反应：精子膜和顶体外膜发生一系列点状融合并释放顶体酶的过程。顶体反应既为精卵结合作准备，又是受 精过程一部分。顶体反应的调控机制 离子调控:Ca 2+内流是早期顶体反应的关键，主要依赖于 Na+Ca2+交换器。除 Ca2+的调控之外，K + 、Mg 2+、C1 - 、H +也对顶体反应起调控作用，如 Ca2 +内流可导致 H +外流，使精子内部 pH 升高，诱发顶体反应。 脂质调控:溶血卵磷脂含量下降，而卵磷脂含量升高，后者形成溶血化合物作用于顶体。 磷酸肌醇调控:多磷酸肌醇在磷脂酶 C（PLC）的作用下 DAG 和 IP3。在 IP3作用下，非线粒体 Ca+释放，激活相关 酶。作为第二信使的 DAG，活化 PKC，使蛋白磷酸化，诱导顶体反应。 上课给划的题 1.附肢的起源：是由胚胎体壁向外生长形成的。 主要由来自侧板中胚层的体节部分和体节腹侧部产生的疏松间质形成的中央核，以及位于外部的，来自外胚层的 表皮两大部分组成。 2.激素：在动物的发育中，由一类细胞产生的可扩散的分子通过血液循环对于另一类细胞发生作用，并调节动物 的发育，这些可扩散的发育调节因子称为激素(hormone)。 3.昆虫变态的类型：原变态、半变态、全变态 4.激素对蜕皮和变态过程的控制 5神经系统的主要组成成分来源于神经胚三个部分：神经管、神经脊、外胚层管 6.神经细胞的结构：胞体（细胞膜、细胞核） 、突起（轴突、树突） 7.根据神经元功能神经细胞分为：感觉神经元、运动神经元、中间神经元 8.核团：在脑的非层状结构的组织发生中，成神经细胞聚集成团，称为核团，每个核团是一个功能单位。 9.最后小脑分化为三层：由外向内分别是：分子层、浦肯野细胞层、颗粒层 10.体节(somite)：随着原条退化和神经褶开始在胚胎中央合拢，轴旁中胚层分隔成细胞模块，称为体节。体节左右 成对。 11.神经管前部扩展膨大形成（前、中和后脑）的原基，而后部的神经管发育为脊髓 12.图示形成：胚胎细胞形成不同组织、器官，构成有序空间结构的过程称为图式形成。 13.缺口基因：（Gap gene，间隙/间隔基因）: 是指那些在受精后最早沿 AP 轴线呈区域性表达的合子基因。 14.副体节：在原肠作用后短暂的一个时期，胚胎表面沿 AP 轴线出现一些过渡性的浅沟，将胚胎分为 14 个区域， 这些区域即为副体节(parasegment) 15.在动物胚胎发育中，早期的图式形成主要涉及：胚轴形成、体节形成、肢芽和器官原基形成及其一系列与躯体 模式建立相关的细胞分化过程 16 果蝇前-后轴形成方式及分子机制 受精后，由定位于卵质中母体效应产物如 bcd mRNA 立即翻译，激活 hb 基因表达，而 HB 可激活合子基因的表达。 沿前-后轴依次激活主要的合子基因：缺口基因、成对控制基因、体节极性基因。缺口基因和成对控制基因可进一 步激活同源异形基因。果蝇的 AP 轴线由三类母体基因控制：前端系统、后端系统和末端系统组成。 前端系统 【前端组织中心】-BCD 蛋白 前端系统至少包括 4 个主要基因，其中 bicoid(bcd) 基因对于前端结构的决定起关键作, exuperantia,swallow,staufen 另 3 个与 bcd mRNA 的定位有关。 Bicoid 为母体效应基因，受精后 bcd mRNA 定 位于卵前端。 受精后 bcd mRNA 迅速翻译，BCD 蛋白在前端积累并向后端弥散，形成从前向后稳定的浓度梯度 BCD 蛋白主要覆盖胚胎前 23 区域。BCD 蛋白是一种转录调节因子，可以激活合子靶基因的表达。缺口基因 hunchback（hb）是其靶基因之一，是控制胚胎头、胸部结构发育的重要基因;hb 在合胞体胚盘阶段开始翻译，表 达区域主要位于胚胎前部，HB 蛋白从前向后也形成一种浓度梯度。Hb 基因转录起始位点上游 300bp 的序列中含有 6 个 BCD 蛋白结合位点，其中 3 个强结合位点，3 个弱结合位点。 2、后端系统 【后端组织中心】-Nanos 和 Caudal 蛋白 后端系统的核心为 nanos 基因；nanos mRNA 定位到卵子后极; 母源性产物 caudal(cdl)mRNA 翻译 CDL，在 BCD 的影响下形成由后向前的浓度梯度。 NOS 与 hb mRNA 结合并抑制后者在后区的翻译； HB 蛋白含有 6 个锌指结构并可以与 DNA 结合，抑制形成腹部所需的缺口基因 knirps 和 giant 的表达； Hunchback：母体 mRNA 在卵中均匀分布，受精后前区高浓度的 Bicoid 蛋白激活合子 hb 基因的表达，从而帮助形 成蛋白浓度梯度。 Caudal: 母体 mRNA 在卵中均匀分布，受精后 bicoid 蛋白抑制其在前区的表达，因而 Caudal 蛋白形成类似于 nanos 的浓度梯度。 3、末端系统 末端系统包括约 9 个母体效应基因，核心基因为 torso 基因；这个基因编码一种跨膜酪氨酸激酶受体。 torso 基因编码的受体蛋白在整个合胞体胚盘的质膜上。由 torso like 基因（tsl)编码的配体 TSL 定位在两端 的卵黄膜上(在前后极的滤泡细胞中表达） 。 受精时， TSL 被释放，并与 TOR 结合, 引起 TOR 蛋白分子自我磷酸化，经过一系列信号传递，最终激活合子靶 基因的表达。 17.诱导者：相互作用的两种组织中，产生影响并引起另外的细胞或组织分化方向变化的这部分细胞或组织称为诱 导者(inductor) 。 18.反应组织：接受影响并改变分化方向的细胞或组织称为反应组织(responding tissue) 19.自动神经化：在没有诱导组织或不具诱导活性的化学物质存在的情况下，外胚层移植块出现神经化的现象。 20.自动中胚层化：在没有内胚层诱导组织存在条件下从外胚层分化出中胚层的结构的现象。 21.异源诱导者：是指能诱导原肠胚外胚层形成一定结构，并具有区域性诱导效应的组织。 22.原肠作用：指囊胚细胞通过剧烈有序的运动过程，使细胞重新排列，形成由内胚层、中胚层和外胚层三个胚层 构成胚胎结构的过程。 23.原肠作用中主要细胞迁移：外包、内陷、内卷、内移、分层、集中延伸 24.绒毛膜：合胞体滋养层充分发育后，形成由滋养层组织和富含血管的中胚层构成的器官-绒毛膜。 25.绒毛膜的功能：与母体间的物质交换；合胞体滋养层产生的激素：绒毛膜促性腺激素：为一种多肽类激素，可 以使胎盘(及母体卵巢)细胞产生孕酮。孕酮：类固醇激素，能使子宫壁增厚并布满血管。绒毛膜催乳激素：促进 母体乳房发育，产后生乳。保护胎儿免受母体免疫系统的损伤：绒毛膜分泌阻止抗原（组织相容性抗原）产生的 可溶性蛋白；抑制子宫内正常免疫反应的淋巴细胞的产生；细胞滋养保护胚胎不被母体免疫系统认出 26.初级性别决定：指生殖腺发育为睾丸或卵巢的选择。胚胎生殖腺的发育命运决定于其染色体组成，Y 染色体的 存在使生殖腺的体细胞发育为睾丸而非卵巢 27.与卵巢命运决定有关的基因是：DAX1 28.精巢分泌两种主要的激素：第一种是抗缪勒氏管激素，第二种激素为睾酮。 29.SRY 基因：Sry 基因位于 Y 染色体的 35000 碱基对的区域；Sry 基因编码一个含有 223 个氨基酸的肽；SRY 为转 录因子：含有 HMG-box 的 DNA 结合域；AMF 和 P450 芳构化酶的启动子有 SRY 结合位点 30.人类性腺的分化 从妊娠 4 周时中段中胚层发育形成性腺原基，至 7 周之间，一直处于未分化状态，此时生殖嵴上皮增生进入其上 方的疏松结缔组织中，并形成生殖索。妊娠 6 周时，生殖索将包围在迁入性腺的生殖细胞周围。此时生殖索保持 与上皮连接。XY 型 XY 生殖索到妊娠 8 周一直持续增殖，并向深处延伸到结缔组织中，形成生殖索网和睾丸网， 最后被一层厚的白膜将它们分隔开。 生殖细胞处于睾丸的生殖索中，处于实心的结构。到青春期变成中空的结构，发育成生精小管。而生殖细胞开始 精子形成。 精子通过睾丸输出管输送到乌尔夫氏管（中肾的收集管，在雄性分化形成输精管） ，精子通过输精管进入泄殖腔并 排出体外。在胎儿发育时期，睾丸中的间质细胞已分化为睾丸间质细胞，它们能分泌睾酮。睾丸索的细胞分化为 支持细胞，它们为精子提供营养和分泌抗缪勒氏管的激素。 XX 型 XX 胎儿生殖细胞位于靠近性腺的外表面，其生殖索不仅不像雄性那样继续增殖，而且发生退化。 然而，很快上皮产生一组新的生殖索，它并不深入到基质中，而是停留在性腺的外表面(皮质)的附近。因此，它 们称为皮质生殖索。 生殖索断裂成簇，每簇围绕一个卵，上皮生殖索分化为颗粒细胞，卵巢间质细胞分化为卵泡膜细胞。它们共同形 成卵泡，围绕着生殖细胞，它们能分泌类固醇激素。 雌性的缪勒氏管保持完整并分化为输卵管、子宫、子宫颈和上阴道。乌尔夫氏管因为丧失了睾酮的影响而退化 干细胞相关的题：1.干细胞有两个区别于其他细胞的重要特性：一是，它们是无特定功能的细胞，它们能通过分 裂长期增殖；二是，它们在生理或特定的实验条件下能转化为具有某种功能的细胞，如心肌细胞，胰岛细胞等等。 干细胞的分类:干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。根据其发育阶段，它包括胚胎干细胞和成体干细胞 胚胎干细胞是在人胚胎发育早期囊胚（受精后约 57 天）中未分化的细胞。由于内细胞群可以发育成完整的 个体，因而这些细胞被认为具有全能性。当内细胞群在培养皿中培养时，我们称之为胚胎干细胞。 胚胎干细胞的鉴定： 1）传代几个月，显微镜下观察细胞是否健康且未分化。 2）用特殊的技术检测未分化细胞细胞表面标记物的存在。如 oct 4（一种重要的是基因启动和关闭的转录因子， 对于细胞的分化和胚胎的发育期起重要的作用。ABCG2/Bcrp1 等 3）显微镜下检测染色体。看是否染色体被破坏（无法检测基因突变） 。 4）检查细胞冻存、解冻、培养以后是否仍能持续传代。 5）检测干细胞是否具有多能性： a. 让细胞在培养中自主分化；b. 控制培养条件，将细胞分化为特定的细胞类型 c. 将细胞移植到具有免疫缺陷的老鼠，观察是否能形成畸胎瘤 （畸胎瘤 是许多分化的和部分分化的细胞类型 的混合物） ，这可以显示胚胎干细胞能分化为很多种细胞类型。 5. 控制定向分化的方法：培养基的组成，培养皿的表面特性、插入特殊的基因进行筛选。几年来，人们已经建立 了一些标准的实验方法和配方使干细胞分化为各种类型的细胞。 存在的问题：伦理学问题、免疫排斥问题、分化的诱导因子 成体干细胞是指一群分布在成体组织中尚未分化的、具有自我更新潜能并负有构建和补充某种组织的各种类型细 胞的干细胞，也称为组织干细胞。起到一定的修复损伤组织或再生能力的作用。 8. 获取：1）反复传代培养：2）分子标记物标记分离： 9. 成体干细胞除了分化为他们所在组织细胞类型外，同样能分化为其他的组织细胞，称之为横向分化或可塑性。 10. 比较胚胎干细胞和成体干细胞： 分化能力： 全能性 多能性 增殖能力： 无限细胞系 非无限细胞系 免疫排斥反应： 有 无 伦理学问题： 有 无 11. 干细胞的应用及存在的问题：1 体外研究人胚胎的发生发育: 1）正常发生发育 2）非正常发育 3）新人类基因的发现 2 药物筛选和致畸实验 3 作为组织移植、细胞治疗的细胞源 4 干细胞治疗心血管疾病 （骨髓干细胞、胚胎干细胞） 上课讲的一些重点： 发育生物学：一门研究生物体从配子发生、受精、胚胎发育、生长到衰老、死亡规律的学科。既研究个体发育机 制也研究生物种群的发生 形态发生决定子：胞质中的一类分子，在母 C 中呈极性分布，分裂时导致两个子 C 只有一个能继承这种物质。 胚轴：指胚胎的前-后轴(anterior-posterior axis)和背-腹轴(dorsal-ventral axis)。 果蝇卵细胞质中含有与图式形成有关的信息，由母性效应基因产物构成果蝇早期胚轴形成相关的位置信息网络； 这些母体效应基因的蛋白质产物均为形态发生素（morphogen） 。 早期图式形成主要涉及：1 早期胚胎发育中，果蝇背腹轴四个区域：即背部外胚层、腹侧外胚层、中胚层和羊浆膜。 2 与前后轴决定有关母体效应基因：前端系统、后端系统、末端系统、背腹系统 蛙类由外胚层形成晶状体依赖于其下方视杯的影响 诱导者：室杯 反应组织：外胚层 将脊索中胚层诱导外胚层细胞分化成神经组织称为初级胚胎诱导 组织者：胚孔背唇 广义：指胚胎中能够指导整个胚胎或部分区域发育的信号中心 表皮细胞：细胞间紧密连接 间质细胞：松散连接 内细胞团分裂为两层：与囊胚腔接触的一层为下胚层形成卵黄囊、内胚层，另一层为上胚层 阻止多精入卵：皮质反应 皮质颗粒形成受精膜 哺乳动物-透明带反应 12信号传导：是细胞间通讯的主要形式。即由信号细胞产生信号分子诱导靶细胞发生某种反应。靶细胞通常通 过特异性受体识别细胞外信号分子，并把细胞外信号转变为细胞内信号。引起细胞发生反应这一过程称为信号传 导 2、生物催化（Biocatalysis)：利用酶或有机体（细胞或细胞器等）作为催化剂实现化学转化的过程。 3、酶的命名有两种方法：系统名、惯用名。 系统名：包括所有底物的名称和反应类型。 （如：乳酸：NAD +氧化还原酶） 惯用名：只取一个较重要的底物名称和反应类型。 （如：乳酸脱氢酶） 第二章 酶的分离纯化 2、 ，酶分离纯化不同阶段 酶的纯化过程，约可分为三个阶段： (1) 粗蛋白质 (crude protein): 采样 均质打破细胞 抽出全蛋白，多使用 盐析沉淀法；可以粗略去除蛋白质 以外的物质。 (2) 部分纯化 (partially purified): 初步的纯化，使用各钟 柱层析法。 (3) 均质酶 (homogeneous): 目标酶的进一步精制纯化，可用 制备式电泳 或 HPLC。 大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，这称为盐溶 现象。 （5）电泳分离 原理：在一定 pH 条件下（用 buffer） ，不同大小、形状及带电颗粒在电场中的移动速度不同（用迁移率表示） ，各 自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。 PAGE 根据其有无浓缩效应，分为： 连续电泳（continuous electrophoresis）：采用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统 不连续电泳（discontinuous electrophoresis） ：采用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系 1）电荷效应 : 分离胶中，蛋白质表面净电荷不同，迁移率不同。 2）分子筛效应 ：大小和形状不同的样品分子通过一定孔径的分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移 率。 3）浓缩效应：使样品在浓缩胶中被浓缩成一条窄带，然后再进入分离胶进行分离。 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 原理：SDS 是一种阴离子去污剂，带有大量负电荷，与蛋白质结合后使蛋白质所带负电荷大大超过了天然蛋白质 原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异。 SDS 破坏蛋白质氢键、疏水键，巯基乙醇使二硫键打开，引起蛋白质构象改变，使蛋白质SDS 复合物形状近 似椭圆形，短轴相同（1.8nm ） ，长轴与蛋白质分子量成正比。 因此，蛋白质SDS 复合物(SDS-denatured protein)在凝胶中的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只 与椭圆棒长度（蛋白质分子量）有关。 等电聚焦电泳 (Isoelectric Focusing Electrophoresis，IEFE) 原理：一种利用具有 pH 梯度的支持介质分离等点电不同的蛋白质的电泳技术。 各种蛋白质各自都有一个等电点,在一特殊的 pH 环境中,蛋白质分子呈电中性,在电场中不会迁移。 等电聚焦就是在电泳介质中放入载体两性电解质，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐 步增加的 pH 梯度，在此体系中，不同的蛋白质即移动到或聚焦于其相当的等电点位置上，也就是说被聚焦于一个 狭的区带中，电泳技术中的等电点聚焦也称为聚焦电泳。 反萃取（back extraction）：完成萃取操作后，将产物从有机相转入水相的萃取操作。 双水相萃取技术：又称水溶液两相分配技术（partion of two aqueous phase system） 用两种不相溶的亲水性高分子聚合物水溶液，如聚乙二醇（PEG）和葡聚糖（Dextran）进行萃取。由于形成的两 相均有很高的含水量（达 70%90% ） ，故称“双水相” 系统 超临界流体萃取 兼有蒸馏和溶液萃取的特征，与常规溶剂萃取的区别：将超临界流体作为萃取剂。 超临界流体(supercritical fluid，SCF）：超过气液共存时的最高压力和最高温度下物质特有的点临界点后的流 体。 常用超临界液态 CO2 作为萃取剂，因为： 1） 液体 CO2 无毒 2）临界温度（304.06K）接近常温 3）临界压力（7.38MPa）较低 4）操作安全 反胶团萃取：又称反胶束（Reversed Micelles） 指表面活性剂（由亲水的极性基团和疏水的非极性基团两部分组成）分散在连续有机 溶剂中自发形成的一种稳定 的纳米级的聚集体 6、酶的浓缩 （一）蒸发浓缩 （二）超滤浓缩 超滤(ultrafiltration) ：浓缩以压力差为动力，将待浓缩溶液通过超滤膜，酶分子较大被滞留，水分 子和小分子选择性透过，达到浓缩目的 。 （三）吸水剂 1.胶过滤浓缩 ：利用葡聚糖凝胶 Sephadex G-25 或 G-50 等的吸水特性。 2.聚乙二醇浓缩：聚乙二醇（polyethylene glycol） ，简称 PEG （四）反复冻融浓缩：利用酶溶液相对于纯水冰点较低的原理使酶分子与小分子物质分离。 （五）沉淀法：盐析法，有机溶剂法 7、酶的干燥 酶的干燥多采用冷冻干燥法。 将酶溶液在较低温度下（-10-50）冻结成固态，然后在高度真空条件下，将其中固态水分直接升华为气 态而除去，也称酶的升华干燥。 真空干燥 冷冻干燥 喷雾干燥 气流干燥 吸附干燥 第三章 酶与细胞的固定化 固定化生物技术：通过化学或物理的手段将酶或游离细胞定位于限定的空间区域内，使其保持活性并可反复利用。 固定化酶的制备原则 （1）必须注意维持酶的构象，特别是活性中心的构象。 （2）酶与载体必须有一定的结合程度。酶的固定化既不影响酶的原有构象，又能使固定化酶能有效回收贮藏，利 于反复使用。 （3）固定化应有利于自动化、机械化操作。这要求用于固定化的载体必须有一定的机械强度，才能使之在制备过 程中不易破坏或受损。 （4）固定化酶应有最小的空间位阻。 （5）固定化酶应有最大的稳定性。在应用过程中，所选载体应不和底物、产物或反应液发生化学反应。 （6）固定化酶的成本适中。 固定化酶(immobilized enzyme) ：固定在载体上并在一定空间范围内进行催化反应的酶。 固定化细胞（immobilized cell）：固定在载体上并在一定空间范围内进行生命活动（生长、繁殖、新陈代谢）的 细胞。 酶固定法方法： （1）吸附法：通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法，是固定化中最简单的方法。 常用的固体吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石等。 物理吸附法：通过非特异性物理吸附作用将酶直接吸附在水不溶性载体表面上而使酶固定化的方法。包括范德华 力、疏水相互作用、氢键 离子吸附法(ion adsorption)是通过离子键使酶与含有离子交换基团的水不溶性载体相结合的固定化方法。 （2）共价偶联法：借助共价键将酶的活性非必需侧链基团和载体的功能基团进行偶联。 载体：亲水载体优于疏水载体 酶蛋白上可供载体结合的功能基团：芳香氨基，羧基，羧甲基等。 常用的偶联反应有： 重氮化法：将酶蛋白与水不溶性载体的重氮基团通过共价键相连接而固定化的方法，是共价键法中使用最多的一 种。 叠氮法：即载体活化生成叠氮化合物，再与酶分子上的相应基团（氨基、羟基、巯基）偶联成固定化酶。 溴化氰法：即用溴化氰将含有羟基的载体，如纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等，活化生成亚氨基碳酸酯衍生 物，然后再与酶分子上的氨基偶联，制成固定化酶。 烷基化法：以卤素为功能团的载体可与酶蛋白分子上的氨基、巯基、酚基等发生烷基化或芳基化反应而使酶固定 化。 细胞固定方法： 1) 直接固定法 ：不使用载体，借助物理（如加热、冰冻） 、化学方法（如柠檬酸、各种絮凝剂）将细胞直接固定。 一般只用于单酶或少数几种酶催化的反应。 2)吸附法 3)包埋法 固定化酶的性质 （一）固定化酶的酶活力 固定化酶的活力在多数情况下比天然酶的活力低，其原因可能是： 酶活性中心的重要氨基酸残基被载体结合； 高级结构和空间构象的改变； 空间位阻的影响； 内扩散阻力； 半透膜的隔离。 个别情况下，酶经固定化后其活力升高。 （二）固定化酶的稳定性 操作稳定性：体内半衰期 贮藏稳定性：