基因敲除技术的运用 (1)

兰州交通大学化学与生物工程学院 综合能力训练文献综述 题目：基因敲除技术研究进展 作者：蒋成 学号：201207749 指导教师：谢放 完成日期： 2014-7-16 基因敲除技术研究进展 摘要：本综述主要阐明基因敲除技术近几年来的方法和步骤，以及在真核 生物和原核生物中的具体实施，并运用实例形象阐明基因敲除技术的作用，以 及其在国内的发展和以后基因敲出技术的发展前景，和一些在运用基因敲除技 术过程中的问题。 关键字：基因敲除 原核中断系统 真核中断系统 丝状真菌基因敲除 1.引言： 1.1 概念： 基因敲除是 80 年代后半期应用 DNA 同源重组原理发展起来的。80 年代初， 胚胎干细胞（ES 细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础 1。 1985 年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基 础。到 1987 年，Thompsson 首次建立了完整的 ES 细胞基因敲除的小鼠模型 2。 直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最 普遍的使用方法。 2012 年初的敲除决定表面抗原的猪的模型的成功建立更是为异种器官移植 排除了一道重要的障碍，展示了基因敲除技术的美好前景。总之, 基因敲除已 成为当前医学和生物学研究的最热点与最前沿，并已对生物学和医学的许多研 究领域产生深刻的影响，成为革命性的研究工具, 具有极其重要的理论意义和 实践意义 1,3。 基因敲除是借助分子生物学、细胞生物学和动物胚胎学的方法, 通过胚胎 干细胞 2这一特殊的中间环节将小鼠的正常功能基因的编码区破坏, 藉以揭示基 因功能最直接的手段之一, 因此成为后基因组时代的重要研究方法和内容。通 常意义上的基因敲除主要是应用 DNA 同源重组原理 3，用设计的同源片段替代 靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。 1.2 基本步骤： a.基因载体的构建：目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的 DNA 分子都 重组到带有标记基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。 b.ES 细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔， 猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。而最常用的鼠的种系是 129 4及其杂合体， 因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向， 是基因敲除的理想 实验动物。 c.同源重组：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的 DNA 分子都重组 到带有标记基因(如 neo 基因，TK 基因等)的载体上，使外源 DNA 与胚胎干细 胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的 DNA 序列整合到内源基 因组中，从而得以表达。 d.选择筛选已击中的细胞：一般地， 筛选使用正、负选择法， 比如用 G418 筛选所有能表达 neo 基因的细胞，然后淘汰所有 HSV -TK 正常表达的细胞， 剩下的细胞为命中的细胞。将筛选出来的靶细胞导入鼠的囊胚中， 再将此囊胚 植人母鼠体内，使其发育成嵌合体小鼠 2,6。 e.表型研究：通过观察嵌体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前 后对小鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的。 f.得到纯合体：由于同源重组常常发生在一对染色体上中一条染色体中,所以如 果要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型，需要进行至少两代遗传。 1.3 其他基因敲出技术 1.3.1.条件性基因敲除法 条件性基因敲除法可定义为将某个基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的 细胞或发育的某一特定阶段的一种特殊的基因敲除方法 4。它实际上是在常规 的基因敲除的基础上，利用重组酶 Cre 干预的位点特异性重组技术，在对小鼠 基因修饰的时空范围上设置一个可调控的“按钮” ，从而使对小鼠基因组的修饰 的范围和时间处于一种可控状态 3。 1.3.2 诱导性基因敲除法 诱导性基因敲除也是以 C re/lox p 系统为基础，但却是利用控制 Cre 表达 的启动子的活性或所表达的 C r e 酶活性具有可诱导的特点，通过对诱导剂给 予时间的控制或利 Cr e 基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性和将该表达 系统转移到动物体内的过程在时间上的可控性，从而在 1oxP 动物的一定发育 阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰之目的的基因敲除技术。 人们可以通过对诱导剂给予时间的预先设计的方式来对动物基因突变的时空特 异性进行人为控制、以避免出现死胎或动物出生后不久即死亡的现象。 1.3.3 利用随机插入突变进行基因敲除 此法利用某些能随机插入基因序列的病毒，细菌或其他基因载体，在目标 细胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后 通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞。 2.基因敲除技术的应用现状 2.1 原核生物中基因敲除技术的应用 2.1.1 基因敲除技术在丝状真菌中的研究现状 （1）载体构建利用 P C R 技术辅助构建打靶载体 7可以快速获得目的片段， 即大肠杆菌质粒基因。 （2）载体中加入特殊的结构元件或采用特殊的报告基因,在打靶载体中，加 入非同重组选择标记是提高筛选效率的 一 种非常有效的方法. （3）构建高同源重组率茵株等将粗糙链孢霉中与 KU70、KU80(编码与非同 源重组有关蛋白质的基因)同源 的两个基因分别敲除，突变株的生长及产生的 孢子都正常,但对于一些抗真菌药物比野生型菌株更加敏感对其进行基因打靶， 转化子的同源重组率达 1005，而对照的野生菌株只有 109，6309 5等确定 了构巢曲霉中与人 KU70 基因同源的基因，将之敲除后，菌株的生长和敏感性 几乎影响，但是同源重组率大幅度提高，90 以上的转化子在正确的位点具有单 拷贝插入。结合异源标记基因，建立了一个高效通用的构巢曲霉基因打靶系统 (4)其他农杆菌的外源基因转化是目前植物转基因应用比较广泛的方法。1998 年用农杆菌干预转化了等丝状真菌，并证明异源的农杆菌 TDNA 往往以单拷 贝随机地插入到丝状真菌染色体中近，以宿主对比研究了农杆菌介导转化法与 CaC1PEG 原生质体转化法4,7。 2.1.2 基因敲除技术在基因功能和结构方面的研究现状 作为研究基因功能和结构的最直接最有效的方法之一，为从分子水平研究 病原菌致病、耐药机理，并为最终防治病害提供了强有力的手段。烟曲霉是曲 霉属中最常见的致病真菌，在免疫受损的患者中常引起有致命危险的侵袭性肺 曲霉病。等研究了烟曲霉 erg3A 和 erg3B 两个基因在固醇合成和对抗真菌药物 耐受性中的作用。分别敲除 rg3A 基因 1,20、erg3B 基因和将两个基因共同敲除， 结果显示 erg3B 编码 C-5 固醇脱氢酶，而 erg3A 对烟曲霉麦角固醇合成没有明 显的作用，3 种突变株对两性霉素 B，等抗真菌药物的敏感性没有改变 L4。构 巢曲霉而被作为“模式”真核生物的一些丙酸盐可以作为丝状真菌的碳源，但 是将它添加到含葡萄糖的培养基时又抑制真菌生长。为解释这一现象，人们对 构巢曲霉进行了研究，发现了柠檬酸甲酯循环。Brock 等进一步研究了这一机 制，他们从构巢曲霉基因组序列中确定了上述循环中的一个关键酶异柠檬 甲酯酸裂合酶的编码基因，并将其敲除。得到的缺失株在以丙酸盐为碳源的培 养基上不生长，在以其它物质为主要碳源且含有丙酸盐的培养基上受抑制。由 此推论，柠檬酸甲酯循环的产物异柠檬甲酯是潜在的细胞代谢毒物。 2.1.3 基因敲除技术在改良工业生产菌株中的应用现状 丝状真菌与其它生产菌株相比有其独特优点，即具有很高的蛋白质分泌能 力；能正确进行各种翻译后加工，包括肽链剪切等，且其糖基化的方式与高等 真核生物的类似；丝状真菌如曲霉等作为生产菌株，已有成熟的发酵和后处理 工艺。但是丝状真菌用作工业生产菌株也存在一些缺陷，例如对外源蛋白质的 表达量低，有的菌株会产生一些有害物质影响产品品质等。基因敲除技术无疑 给基因工程育种提供了一个有效的途径。孙晶等以潮霉素抗性基因为标记，利 用基因敲除技术将黑曲霉 GICC2773 中一种编码天冬氨酸胞外蛋白酶的基因敲 除，功能分析显示突变株的酸性蛋白酶活性明显下降，外源蛋白漆酶的分泌表 达提高，提示基因的缺失对外源蛋白漆酶的表达有保护作用。 2.1.4 基因敲除技术次生代谢产物合成途径改造中的应用现状 丝状真菌的许多次生代谢产物对人类的营养和健康有着非常重要的作用， 如抗生素、stat 类药物、有机酸、多不饱和脂肪酸等。利用基因敲除技术可以 有目的地对次生代谢产物生物合成途径进行改造，使代谢向目的产物积累方向 进行。 2.1.5 原核中断系统中的应用现状 Red 系统的机制：Red 系统是原核中断系统的代表,由 噬菌体 bet、gam3 个基因组成,它们分别编码 Gam3 蛋白质。一种核酸外切酶,单亚基的分子量为 24kDa,这种蛋白的活性形式是一种环状三聚物分子,中间有一中空的通道,通道的 一端可容纳双链 DNA 分子,另一端只可容纳单链 DNA。Ex 蛋白可结合在双链 DNA 的末端,从 DNA 双链的 5端向 3端降解 DNA,产生 3突出端。Beta 蛋 白是一种退火蛋白,单亚基的分子量为 25.8kDa。在溶液中,Beta 蛋白自发地形成 环状结构,紧紧地结合在单链 DNA3末端 DNA 被单链核酸酶降解, 同时干预互 补单链 DNA 的退火双链 DNA 退火完成后,Beta 蛋白从 DNA 双链上解离下来。 Beta 蛋白在 Red 同源重组过程中起着决定性的作且重组效率远高于重组 2.2 真核生物中基因敲除技术的应用 将小鼠 ESC 中的卡巴 B 蛋白抑制因子的激酶 2 基因敲除 16,获得了杂合的 IKK2 突变体 (IKK+/-2),杂合体在各个方面都是正常的, 通过杂合个体之间的交 配, 研究者在很长时间内未能得到该位点纯合的个体 ,即 I KK- / -2 个体。在杂 合状态时 IKK2 的表达只是受到了影响,但依旧有表达,而一旦纯合就意味着该基 因的表达完全被中断,或者说即便有表达,表达出的蛋白质也不再是正常的 IKK2。随后的研究表明,IKK-/-2 属致死基因型,该位点纯合的个体在胚胎发育的 早期(125135d)死亡。原因是当无 IKK2 表达时,胎儿产生肿瘤坏死因子)引起早 期胎儿的肝细胞发生大量凋亡,而在正常情况下,IKK2 可抑制 TNF 引起的肝细胞 凋亡。那么能否拯救这样的纯合子个体呢?通过 IKK+/-2 与 TNF 基因被敲除的 杂合子小鼠交配,获得了 IKK+/-2/TNF+/-的个体,通过这种基因型的公母鼠的交配 获得了 IKK-/-2 和 TNF-/-的个体。观察表明,IKK/-2/TNF-/-的个体可以存活到出 生,但出生后一月内死亡 6。 将线性化的针对小鼠凝血因子 IX 基因 2,6的敲除载体用电穿孔法转入小鼠 ES 细胞 ,经 G418 筛选,用 PCR 和 Southern 杂交 15的方法从具药物抗性的细胞中 筛选出 4 个凝血因子 IX 基因被定向敲除的 ES 细胞克隆 ,为进一步开展基因敲除 研究打下基础。采用 PCR 扩增的方法研究了从美国德克萨斯大学引进的热休克 因子 1(Heatshockfactor1,HSF1)基因敲除小鼠的基因型。结果表明,采用 PCR 扩 增的方法,野生型小鼠仅在 562bp 的位置出现一条带,突变纯合子则在 377bp 处出 现一条带,而突变杂合子则在 562bp 和 377bp 处出现两条带。构建了可用于大鼠 次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)基因敲除的载体。采用解剖学和血清学 指标测定的方法研究了 Smad3 基因敲除对小鼠肾功能的影响 ,结果表明,该基因 敲除的纯合小鼠 125%的个体表现为单肾,表明 Smad3 基因对小鼠肾脏的形成有 一定的影响。 3.影响因素： 构建特定基因的敲除载体必须深入了解该基因的结构组成, 如组成该基因 的核苷酸序列、 外显子和内含子数目、 特定位点的限制性内切酶的种类以及 该基因在染色体上的定位等。筛选发生了同源重组的干细胞的方法主要有以下 三种。 (1) southern 杂交即用特定的限制性内切酶消化从经过扩增的干细胞中提取的 基因组 DN A , 用敲除载体为探针, 对于发生了同源重组的干细胞克隆和随机 整合了敲除载体的干细胞克隆, 其 Southern 杂交结果不同, 杂 交出的条带有差 异。 (2) PCR 扩增采用在经过改造的载体中插入一小段聚核苷酸 序列, 该序列正 好与基因组基因上的小段序列组成一对 P CR 引物, 这样通过 PCR 扩增产物的 大小即可区分同源重组和随机插入。 (3) 正负选择该方法筛选同源重组克隆的依据是对于线性化的外源基因片段无 论采用电转化还是显微注射, 外源基因整合进宿主基因组时的方式多为两头插 入, 根据这一现象 Mario 设计了长度大于 10 k b 的载体, 其中包含 neo 基因, 而在距离发生同源重组较远的位置上有一个由单纯疱疹病毒基因启动子驱动的 胸甘激酶基因( H S V t k ) 片段 1,10。 同源重组效率的因素主要是外源基因转染的方式。采用显微注射的方法, 在经 G4 18 筛选出的克隆中,发生同源重组的概率 为 1/ 15014, 而采用电转化 的方法时, 经 G418 筛选出的克隆中,发生同源重组的概率仅为 1/ 3 004。 4.展 望： 4.1 基因敲出技术将对医学和生物学的发展产生深远的影响,有着更加广阔的 应用前景 1,8,1018,19。 4.2 将来对时间和区域可控性的基因敲除大鼠兔猪以及和人类更为接近的猴的 研究，将会成为遗传工程中的另一重大飞跃，对疾病的分子机理研究和疾病的 基因治疗，药物治疗评估以及异种移植器官等有着重大的理论和实际意义。 4.3 基因敲除技术的缺陷随着基因敲除技术的发展，早期技术中的许多不足和 缺陷都已经解决，但基因敲除技术始终存在着一个难以克服的缺点，即敲掉一 个基因并不一定就能获知该基因的功能，其原因包括：一方面，许多基因在功 能上是冗余的 13， 敲掉一个在功能上冗余的基因，并不能造成容易识别的表 型，因为基因家族的其他成员可以提供同样的功能；另一方面，对于某些必需 基因，敲除后会造成细胞的致死性 4，也就无法对这些必需基因进行相应的研 究了。而这缺陷在未来一定会克服。 4.4 建立生物模型 7。在基因功能，代谢途径等研究中模型生物的建立非常重 要。基因敲除技术就常常用于建立某种特定基因缺失的生物模型，从而进行相 关的研究。这些模型可以是细胞，也可以是完整的动植物或微生物个体。 4.5 疾病的分子机理研究和疾病的基因治疗。通过基因敲除技术可以确定特定 基因的性质以及研究它对机体的影响。这无论是对了解疾病的根源或者是寻找 基因治疗的靶标都有重大的意义。 4.6 提供廉价的异种移植器官 1,2。 4.7 免疫学中的应用 10。同异源器官移植相似，异源的抗体用于人体时或多 或少会有一定的免疫排斥，使得人用抗体类药物的生产和应用受阻。而如果将 动物免疫分子基因敲除，换以人的相应基因，那么将产生人的抗体，从而解决 人源抗体的生产问题。 4.8 改造生物、培育新的生物品种 1,8。细菌的基因工程技术是本世纪分子生 物学史上的一个重大突破，而基因敲除技术则可能是遗传工程中的另一重大飞 跃。它为定向改造生物，培育新型生物提供了重要的技术支持。 5.存在的问题： （1）基因定向敲除的成功率很低, 检测发生同源重组干细胞的工作比较困难。 （2）尽管小鼠的繁殖周期为 19 到 21d，但从定向敲除干细胞基因到筛选出具 备理想基因型的基因敲除小鼠模型依旧耗时极长 2,6。 （3）基因敲除后的功能可能被其它基因的代偿作用填补, 因此并不表现表型 缺陷。 6.结束语 基因敲出技术对人们具有很大的运用，不仅在植物，动物微生物都有巨大的 运用，很大程度上可以造福人类，对人类具有重大的意义。然而基因敲出技术 依然存在许多问题等待人们进一步解决和研究。 参考文献 1王又红. 基因敲除技术的应用现状与发展前景J. 国外医学 , 1999:26-5. 2戴旭明,薛红,杨桦,等.小鼠胚胎干细胞凝血因子 IX 基因的定向敲除 J.第二军医大学学报, 1998, 19(1):1-14. 3刘德培, 方福德. 基因敲除J. 生理科学进展, 1995: 26-1 4yunfengli 基因敲除技术的最新进展 J 丁香园电子期刊,200