实验十二 厌氧性细菌(1稿)

实验十二 厌氧性细菌（厌氧培养方法） 厌氧性细菌（Anaerobic bacteria）是一大群必须在无氧或低氧环境中才能生长繁殖 的细菌；一般情况下，这类细菌在无氧条件下比在有氧环境中生长好，不能在空气（氧气 浓度大于 18%）和（或）二氧化碳浓度小于 10%以下的固体培养基表面生长。这类细菌缺乏 完整的代谢酶体系，其能量代谢多以无氧发酵的方式进行。它能引起人体不同部位的感染， 包括阑尾炎、胆囊炎、中耳炎、口腔感染、心内膜炎、子宫内膜炎、脑脓肿、心肌坏死、 骨髓炎、腹膜炎、脓胸、输卵管炎、脓毒性关节炎、肝脓肿、鼻窦炎、肠道手术或创伤后 伤口感染、盆腔炎以及菌血症等。 （一）无芽胞厌氧菌主要种类及生物学性状 无芽胞厌氧菌共有 23 个属，与人类疾病相关的主要有 10 个属。 1.革兰阴性厌氧杆菌有 8 个属，类杆菌属中的脆弱类杆菌最为重要。形态呈多形 性，有荚膜。除类杆菌在培养基上生长迅速外，其余均生长缓慢。 2.革兰阴性厌氧菌有 3 个属，其中以韦荣菌属最重要。为咽喉部主要厌氧菌，但 在临床厌氧菌分离标本中，分离率小于 1%，且为混合感染菌之一。其他革兰阴性球菌极少 分离到。 3.革兰阳性厌氧菌有 5 个属，其中有临床意义的是消化链球菌属，主要寄居在阴 道。本菌属细菌生长缓慢，培养需 57 天。 4.革兰阳性厌氧杆菌有 7 个属，其中以下列 3 个属为主： （1）丙酸杆菌属：小杆菌，无鞭毛，能在普通培养基上生长，需要 25 天，与 人类有关的有 3 个种，以痤疮丙酸杆菌最为常见。 （2）双歧杆菌：呈多形性，有分枝，无动力，严格厌氧，耐酸。29 个种中有 10 个种与人类有关，其中只有齿双歧杆菌与龋齿和牙周炎有关。其他种极少从临床标本中分 离到。 （3）优杆菌属：单一形态或多形态，动力不定，严格厌氧，生化反应活泼，生长 缓慢，常需培养 7 天，最常见的是迟钝优杆菌。 （二）微生物学检查 要从感染灶深部采取标本。最好是切取感染灶组织或活检标本，立即送检医.学教 育网搜集整理。 1.直接涂片镜检：将采集的标本直接涂片染色镜检，观察细菌形态、染色及菌量， 为进一步培养以及初步诊断提供依据。 2.分离培养与鉴定：分离培养是鉴定无芽胞厌氧菌感染的关键步骤。标本应立即 接种相应的培养基，最常用的培养基是以牛心脑浸液为基础的血平板。置 37厌氧培养 23 天，如无菌生长，继续培养 1 周。如有菌生长则进一步利用有氧和无氧环境分别传代 培养，证实为专性厌氧菌后，再经生化反应进行鉴定。 厌氧菌广泛分布于自然界以及人和动物的体内，具有以下特点： 1、种类繁多，分类方法多。 （1）按照形态厌氧性细菌分为芽胞厌氧菌和无芽胞厌氧菌两大类。芽胞厌氧菌只有一 个菌属，即梭状芽胞杆菌属，共有 100 多个种；无芽胞厌氧菌有 40 多个菌属，300 多个种 和亚种。 （2）根据对 O的耐受程度，可将厌氧菌分为 3 大类：（1）对氧极端敏感的厌氧菌： 代表菌种为月形单胞菌。这类细菌对厌氧条件要求很高，在空气中暴露 10min 即死亡，临 床上很难分离出；（2）中度厌氧菌：代表菌种为脆弱拟杆菌、产气荚膜梭菌等临床分离常 见的厌氧菌。它们在空气中暴露 6090min 或在脓汁抽出 72h 后仍然能分离出来；（3）耐 氧厌氧菌：代表菌种为溶组织梭菌。这类细菌不能利用氧，在无氧条件下生长好，而在有 氧条件下生长不佳。也有按照其对氧的耐受的程度不同，可分为专性厌氧菌和兼性厌氧菌 等。专性厌氧菌（Obligate anaerobe） ，是指在无氧的环境中才能生长繁殖的细菌。此类 细菌缺乏完善的呼吸酶系统，只能进行无氧发酵，不但不能利用分子氧，而且游离氧对其 还有毒性作用。如破伤风杆菌、肉毒杆菌、产生荚膜杆菌等。 只能在没有游离氧存在的环 境中生存的微生物。甲烷菌即属此类细菌。人们利用甲烷菌等产生沼气，利用厌氧菌处理 各种有机废物和废水。如梭菌、甲烷菌、硫酸盐还原菌以及大部分光合细菌。 与此相反，无论有氧状态还是无氧状态都能生长发育的细菌，则称它为兼性厌氧细菌 （facultative obligate anaerobe） 。专性厌氧菌除通过发酵，光合作用获得能量外，有 的能把硫酸盐那种的无机氧化物作为末端电子受体而加以利用。据认为，在专性厌氧菌中， 通过发酵获得能量的一般都缺少细胞色素或过氧化氢酶，氧对生长，其所以有害，是由于 缺少超氧化物不均化酶和过氧化氢酶，而对由黄素系氧化酶的作用而产生的有害的超氧化 物或过氧化氢不能分解所致。在土壤中与好氧菌共存时，在有通透空气的地方也可发现有 厌氧菌的存在。在兼性厌氧菌中，很多是像大肠杆菌那样，有氧存在时是借助呼吸，氧不 存在时是借助发酵来获得能量的。但也有的像乳酸菌那样，即使有氧存在，主要也是借助 发酵来获得能量。因而即使是兼性厌氧菌，其中也包括从在有氧条件下生长十分良好的直 到无氧条件下生长十分良好的各种各样的情况。 （3）根据革兰氏染色可分为厌氧革兰阳性球菌（消化链球菌） 、厌氧革兰阳性杆菌 （乳酸杆菌、痤疮丙酸杆菌、放线菌、破伤风梭菌、产气荚膜梭菌、艰难梭菌） 、厌氧革兰 阴性杆菌（脆弱类杆菌、产黑色素普雷沃菌、具核梭杆菌、坏死梭杆菌） 、厌氧革兰阴性球 菌（韦荣球菌） 。 2、分布广泛。在正常人体的皮肤以及所有与外界相通的腔道如口腔、上呼吸道、胃肠 道、泌尿生殖道等的黏膜上均有大量厌氧菌寄居。除梭状芽胞杆菌能以芽胞的形式在自然 界长期存活外，绝大多数厌氧菌存在于人和动物体内，与需氧菌、兼性厌氧菌共同组成人 体的正常菌群，并且在种类和数量上占绝对优势，如在结肠中，厌氧菌与需氧菌或兼性厌 氧菌的比例为 1000:1，即厌氧菌占结肠细菌的 99.9%。 3、主要临床及细菌学指征：感染局部有气体产生；发生在黏膜附近的感染；深 部外伤；分泌物恶臭或为暗血红色或出现红色荧光；某些抗生素治疗无效的感染； 标本直接镜检见细菌染色不均、呈明显多形态；或镜检查见细菌，而有氧培养无细菌生长。 4、厌氧菌感染的原因：局部组织的氧化还原电势降低，形成有利于厌氧菌生长的厌氧 微环境；机体免疫功能下降及屏障作用破坏；菌群失调或厌氧菌的寄居部位发生改变等。 目前，培养厌氧微生物的技术和方法不断改进，日趋完善，并逐渐发展成为研究厌氧 微生物的一整套完整技术。目前简便而又有效的技术包括有：厌氧箱培养技术、厌氧罐培 养技术、厌氧袋培养技术、亨盖特（Hungate）厌氧滚管技术等。 一、临床意义 厌氧菌一般为条件致病菌。主要存在于人体及动物体内，特别是肠道、口腔、上呼吸 道和泌尿生殖道等处，与需氧菌和兼性厌氧菌共同构成机体的正常菌群。在正常菌群中厌 氧菌通常占有绝对的优势。正常情况下，菌群保护相对平衡，如长期应用广谱抗生素、激 素、免疫抑制剂等，发生菌群失调，或机体抵抗力减退，则可导致内源性厌氧菌感染，也 常与其他细菌混合感染。常作为条件致病菌引起各组织和器官的内源性感染，感染可发生 于人体的各个部位，遍及临床各科。在临床厌氧菌感染中，内源性感染多于外源性感染； 由无芽胞厌氧菌引起的感染多于芽胞厌氧菌的感染；混合感染多于单纯厌氧菌感染。 破伤风梭菌广泛存在于土壤、人与动物的肠道中，芽胞在土壤中可存活数年，经伤口 感染，在厌氧条件下生长繁殖，引起破伤风。产气荚膜梭菌是气性坏疽的主要病原菌，某 些型别也可引起食物中毒和坏死性肠炎。也常与兼性厌氧菌混合感染，引起深部脓肿，腹 腔、盆腔、胸腔感染、败血症、心内膜炎以及胆道、泌尿道、女性生殖道感染等。肉毒梭 菌在厌氧环境中，可分泌毒性极强烈的肉毒毒素，被食入可引起特殊的神经中毒症状，病 死率极高。婴幼儿若食入被肉毒梭菌芽胞污染的食物，引起婴幼儿肉毒病。艰难梭菌是人 类肠道正常菌群，可因菌群失调而引起伪膜性肠炎，是医院内感染的病原菌之一。此外， 艰难梭菌尚能引起气性坏疽、肾盂肾炎、脑膜炎、腹腔和阴道感染及菌血症等。 无芽胞厌氧菌是一大类寄生于人体的正常菌群，引起的感染均为内源性感染，在 一定的致病条件下，可引起多种人类感染。所致疾病有： 1.败血症：主要由脆弱类杆菌引起，其次为革兰阳性厌氧球菌医.学教育网搜集整 理。 2.中枢神经系统感染：主要由革兰阴性厌氧杆菌引起，常可引起脑脓肿。 3.口腔与牙齿感染：主要由消化链球菌、产黑素类杆菌等引起。 4.呼吸道感染：主要由普雷沃菌属、坏死梭杆菌、核梭杆菌、消化链球菌和脆弱 类杆菌。 5.腹部和会阴部感染：主要由脆弱类杆菌引起。 6.女性生殖道感染：主要由消化链球菌属、普雷沃菌属和卟啉单胞菌等引起。 7.其他：无芽胞厌氧菌尚可引起皮肤和软组织感染、心内膜炎等。 二、厌氧性细菌的检验程序（见图 12-1） 生长 专性厌氧菌 菌种保存 分类鉴定 药物敏感试验 形态与染色 菌落特性 生化反应 药敏性鉴定 气液相色谱 需氧培养 厌氧培养 生长 兼性厌氧菌 无生长 27d 厌氧培养 确定厌氧菌 （耐氧试验） 每个平板挑 5 个以上不同菌落 每个菌落接种 2 个平板，经 48h 培养 临床标本 肉眼观察及 直接涂片检查 分离培养 (非选择性及选择性厌氧培养基) 增菌培养 (液体培养基) 图 12-1 厌氧性细菌检验程序 三、试验目的要求 1掌握厌氧性细菌的生物学特性、形态特性和培养特性。 2掌握厌氧菌的概念、分类、常用鉴别方法、鉴定原则和鉴别要点。 3、熟悉厌氧菌标本采集方法、送检要求、检验程序、分离培养方法。 4. 了解破伤风梭菌、产气荚膜梭菌、肉毒梭菌的致病性和防治原则 5、了解厌氧性细菌的感染特点及检验的临床意义 四、器材与试剂（题前空二格，五号宋体加粗） 1菌种 破伤风芽胞梭菌、产气荚膜梭菌、肉毒梭菌、艰难梭菌、脆弱拟杆菌和厌氧 消化链球菌；或上棕菌种的庖肉培养物。 2培养基 庖肉培养基，厌氧血琼脂平板，牛乳培养基，五糖（葡萄糖、乳糖、麦芽 糖、甘露醇、蔗糖）发酵管，卵黄琼脂平板，溴甲酚紫牛乳培养基，CCFA(环丝氨酸一头孢 西丁一果糖一卵黄琼脂)平板培养基、拟（类）杆菌胆汁七叶苷琼脂平板(BBE)、七叶苷琼 脂培养基、20%胆汁培养基、明胶培养基、溴甲酚紫牛乳培养基等。 3试剂 革兰染色液、芽胞染色液、产气荚膜梭菌抗血清、200g/L 糖溶液、20g/L 尿 素，L色氨酸基质液、0.5g/L 硝酸钠溶液、糖发酵缓冲液、0.2g/L 七叶苷水溶液、 0.025mol/L pH 6.0 酚红磷酸盐缓冲液、0.025mol/L 的 pH 6.8 磷酸盐缓冲液、硝酸盐还原 试剂、二甲苯、欧氏试剂等。 4其他 凡士林、小白鼠、无菌注射器、无菌吸管、剪刀、镊子、玻片、厌氧袋或厌 氧罐、恒温培养箱、水浴锅、蒸馏水、透明微孔板、366nm 紫外灯等。 五、步骤与方法 （一）采集标本 根据不同感染部位采集相应标本，如：血液、关节液、心包液、腹腔液、膀胱穿刺液 等体液；深部脓肿渗出液、肺部渗出液、其他组织穿刺液等。采集标本时需注意无菌操作， 防止正常菌群污染，尽量避免接触空气，迅速送检。 有些标本如鼻咽拭子、痰液、流出的脓液、阴道分泌物、粪便等因含大量的正常菌群， 故不宜作厌氧菌培养。 1、破伤风梭菌检验：可疑破伤风患者取感染伤口脓液或坏死组织块。 2、产气荚膜梭菌检验：气性坏疽病患者可采集创伤深部分泌物、穿刺物、坏死组织块； 菌血症患者取血液；食物中毒取剩余食物、患者粪便或呕吐物。 3、肉毒梭菌检验：取剩余食物、患者粪便或呕吐物。 4、艰难梭菌检验：取患者粪便。 （二）分离培养 1形态观察（涂片染色镜检）：取标本或破伤风梭菌、产气荚膜梭菌、肉毒梭菌及艰 难梭菌的培养物；或脆弱类杆菌、产黑色素类普雷沃菌、厌氧消化链球菌的培养物别涂片 作革兰染色与芽孢染色后，镜检，观察形态。 表 12-1 厌氧菌的镜下形态特征 菌 名 形态及其他特征 脆弱类杆菌 革兰阴性短杆菌，两端钝圆而浓染，菌体中央不易着色或染色较浅，形似 空泡；可形成荚膜；陈旧培养物常呈多形性，长短不一，标本有琥珀味 产黑色素普雷沃菌 革兰阴性球杆菌，可见多形性，长短不一，两端钝圆、浓染，着色不均匀， 菌体中间似空泡，紫外线照射发红色荧光，标本有恶臭 具核梭杆菌 菌体细长，两头尖，紫色颗粒沿菌体长轴成双排列，标本有丁酸味 坏死梭杆菌 菌体细长，高度多形性，长短不一，菌体中部膨胀呈圆球形 韦荣球菌 极小的革兰阴性球菌 消化链球菌 革兰阳性球菌，菌体圆形，或卵圆形，成双或短链状或成堆排列的小球菌， 大小不等；易染成阴性 乳酸杆菌 细长，无芽胞，有时多形性，标本有乳酸气味 痤疮丙酸杆菌 菌体微弯呈棒状，一端圆一端渐细，呈 X、Y、V 或栅状排列，标本有丙酸 气味 放线菌 分枝呈棒状、X、Y、V 或栅状排列，脓汁中有硫磺颗粒，呈琥珀酸气味 破伤风梭菌 G+的细长杆菌，散在排列，用 Wirtz&Conklin 法进行芽胞染色，可见菌体 细长呈红色，芽胞圆形呈绿色，位于菌体顶端，芽胞圆形，直径大于菌体， 有鞭毛，使菌体呈“鼓槌状” 。 产气荚膜梭菌 G+的粗大杆菌，两端钝圆，单个或散在或成双排列；芽胞卵圆形，但一般 不易看见，直径小于菌体，位于菌体中央或次末端；有荚膜，标本直接染 色可见肥厚荚膜。 肉毒梭菌 G+的粗大杆菌，两端钝圆，单个或成双排列；芽胞卵圆形，直径大于菌体， 位于菌体次末端，使细菌呈“网球拍”状。 艰难梭菌 G+的粗长杆菌，培养时间延长（48h）易转为革兰阴性；芽胞卵圆形或 长方形、位于菌体次极端。 2培养特性观察：将可疑标本（破伤风梭菌、产气荚膜梭菌、肉毒梭菌）分别接种于 庖肉培养基与血平板；将艰难梭菌接种于血平板与 CCFA 平板。将脆弱类杆菌接种于血平板 及 BBE 平板；将产黑色素类普雷沃菌、厌氧消化链球菌接种于厌氧血琼脂平板。于 35厌 氧条件下孵育 2448h，观察结果。形态和培养结果见表 12-2、表 12-3。 表 12-2 厌氧芽胞梭菌的培养特性 培养特性 细菌名称 庖肉培养基 血平板 CCFA 平板 破伤风梭菌 培养液混浊,肉 渣部分消化微变 黑,有少量气体。 呈扩散生长，菌落扁平、灰 白色、边缘不齐、周边疏 松似“羽毛状” ，有狭窄 溶血环。 产气荚膜梭 菌 生长迅速、培养 液混浊，肉渣不 被消化、呈粉红 色，产大量气体。 圆形凸起的光滑型菌落，边 缘整齐、有双层溶血环，内 环为 溶血、外环为 溶 血。 肉毒梭菌 培养液混浊，肉 渣被消化、呈黑 色，有腐败性恶 臭，产少量气体。 菌落较大，半透明、灰白色、 有光泽，边缘薄、弥散而不 规则；有 溶血环。 艰难梭菌 培养 48h 后，形成圆形、白 或淡黄色菌落，边缘不整齐、 表面粗糙，不溶血。 菌落较大，边缘不整齐、 表面粗糙呈毛玻璃样；在 紫外线照射下，可见黄绿 色荧光。 表 12-3 厌氧无芽胞梭菌的形态和培养特性 培养特性 细菌名称 厌氧血平板 BBE 平板 脆弱类杆菌 在厌氧血琼脂平板上生长良好，菌 落直径 13mm，圆形、微凸、半透 明、灰白色、表面光滑、边缘整齐， 多数菌株不溶血。 在 BBE 平板中生长旺盛，菌 落较大，周围有黑色晕圈。 产黑色素普 雷沃菌 在厌氧血琼脂平板上生长良好，经 48h 培养后形成直径 0.53mm 的菌 落；菌落圆形凸起，初为灰白色， 后呈黄色、浅棕色，57 天后变成 黑色；多数菌株呈 溶血。在黑色 素产生前，于 366nm 紫外线下，可 见橘红色荧光，色素出现后则无荧 光。 厌氧消化链 球菌 生长缓慢，经 24 天培养，在厌氧 血琼脂平板上形成直径 0.51mm 的 小菌落；菌落圆形凸起、光滑不透 明，初为黑色，接触空气后颜色变 浅，传代后黑色消失。 （三）生化反应 1、五糖发酵与牛乳消化试验 （1)原理：不同的细菌产生不同的酶，因而对糖的利用能力和对蛋白质的分解能力不 同，据此可作为厌氧菌鉴定的参考依据之一。 （2)方法：将五糖发酵管与牛乳培养基置 1000C 水浴中加热煮沸 10 分钟，取出后迅速 冷却，以驱除培养基中的空气。以无菌吸管吸取待检菌培养物，分别滴加于五糖发酵管与 牛乳培养基中，接种完毕后，在液面上加一薄层熔化的凡士林。经 35孵育 2448 小时， 观察结果。 （3)结果判定和报告：破伤风芽胞梭菌不分解葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇和蔗糖， 牛乳培养基无变化。产气荚膜梭菌分解葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖，产酸产气，牛乳凝 固、胨化变清。肉毒梭菌能分解葡萄糖、麦芽糖与蔗糖，不分解乳糖与甘露醇，牛乳培养 基一般无变化。艰难梭菌能分解葡萄糖和甘露醇产酸，不分解乳糖、麦芽糖和蔗糖，牛乳 培养基无变化，见表 12-4。 2、汹涌发酵试验 （1）原理：在牛乳培养基中，产气荚膜梭菌可迅速分解乳糖产酸产气，酪蛋白被酸凝 固形成凝块，由于同时产生大量气体，酪蛋白凝块被产生的大量气体冲击，使其形成分散 的海绵碎块，并将部分凝块及培养基及表面的凡士林冲至试管塞处。这种气势凶猛的反应 现象被称为“汹涌发酵”现象。 （2）方法：以无菌吸管（或接种环）取产气荚膜梭菌庖肉培养物，接种于溴甲酚紫牛 乳培养基，经 35孵育 1824h，观察结果。 （3）结果判定：一般于孵育 6 小时后即可见到“汹涌发酵”现象。此特征可作为鉴定 本菌的重要指标之一。 3、卵磷脂酶试验和 Nagler 试验 （1）原理：某些厌氧芽孢梭菌（如产气荚膜梭菌）能产生卵磷脂酶，在卵黄琼脂平板 上，可将其中可溶性的磷脂酰胆碱分解成磷酸胆碱和不溶性的甘油酯，后者在菌落周围形 成不透明区（呈乳白色环） ，此为卵磷脂酶试验阳性。若先将产气荚膜梭菌抗血清（即卵磷 脂酶抗血清）涂在卵黄琼脂平板上，再接种产气荚膜梭菌，则卵磷脂酶抗血清（抗体）与 细菌的卵磷脂酶抗原发生中和反应，使菌落周围无乳白色环形成，此为 Nagler 试验阳性。 这两项试验通常同时进行，可确证该细菌能产生卵磷脂酶。 （2）方法：将卵黄琼脂平板分成两个区，其中一部分均匀涂上产气荚膜梭菌抗血清， 置 35待干后，取待检细菌先接种于未涂抗血清区域，再接种于已涂抗血清的另一区域。 35厌氧孵育 2448h，观察结果。 （3）结果判定：未涂抗血清的一半平板，菌落周围形成较大的混浊不透明区，表示卵磷 脂酶试验阳性；涂抗血清的一侧，菌落周围无不透明区，表示卵磷脂酶活性已被抗毒素中 和，为 Nagler 试验阳性；如两侧菌落周围均无不透明区，表示该菌不产生卵磷脂酶。产气 荚膜梭菌卵磷脂酶试验为阳性，破伤风梭菌、肉毒梭菌及艰难梭菌为阴性。 4、脂酶试验 （1）原理：某些厌氧芽孢梭菌（如肉毒梭菌）可产生脂酶，作用于卵黄中的游离脂肪， 产生甘油和不溶性的游离脂肪酸，在菌落周围培养基中形成局限的不透明区，并在菌落表 面产生一层珠光层（为一薄脂肪酸，其融点在 37以下，因此不能进入培养基，只能漂浮 在菌落表面） 。 （2）方法：将肉毒梭菌接种于卵黄琼脂平板，35厌氧孵育 48 72h，观察结果。 （3）结果判定：菌落表面有珠光层，菌落下面的培养基中有不透明区域者为脂酶阳性。 肉毒梭菌(G 型除外)脂酶试验阳性，破伤风梭菌、产气荚膜梭菌及艰难梭菌脂酶阴性。 表 12-4 厌氧芽胞梭菌的主要生化反应 卵黄平板 菌种 卵磷脂酶 脂酶 牛乳 消化 明胶 液化 葡萄 糖 乳糖 麦芽 糖 甘露 醇 蔗糖 破伤风梭菌 - - d + - - - - - 产气荚膜梭菌 + - cd + + + + - + 肉毒梭菌 - + d + + _ V - - 艰难梭菌 - - - + + - - +/- - 注：+：阳性；-：阴性；v：不定。 牛乳消化：d：消化；c：凝固；cd：既消化又凝固；-：不消化不凝固 无芽孢厌氧菌应做如下生化反应： 5、七叶苷水解试验 （1）原理：某些细菌具有七叶苷水解酶，能将七叶苷水解为葡萄糖和七叶素，七叶素 与培养基中的枸橼酸铁的 Fe2+反应，形成黑色化合物。 （2）方法：斜面法：待检菌接种七叶苷琼脂斜面，于 35厌氧孵育 2448h，观察 结果；经培养若出现黑色化合物，则为阳性。微量斑点法：将 0.2g/L 七叶苷水溶液（淡 蓝色）滴加于透明微孔板中，共滴加 3 孔，再于各孔分别加 1 滴脆弱类杆菌菌液、产黑色 素类普雷沃菌的菌液以及蒸馏水（对照） 。经 35、3060min 后，置 360nm 紫外灯下观察 结果。紫外灯照射下，对照孔呈淡蓝色荧光；待测孔若与对照孔相同，则为阴性，若无荧 光则为阳性，说明被水解后荧光消失。 （3）结果判定：斜面法培养基变黑表示七叶苷已经水解，为阳性。微量斑点法对照孔呈 淡蓝色荧光，加菌液孔无荧光者为阳性，说明被水解后荧光消失，与对照相同者则为阴性。 脆弱类杆菌能水解七叶苷为阳性反应，产黑色素普雷沃菌一般不水解七叶苷为阴性反应。 6、20%胆汁（或 2%胆盐）刺激生长试验 （1）原理：胆汁能抑制许多厌氧菌生长，因为胆盐可降低细胞膜表面张力，损伤细胞 细胞膜。但脆弱类杆菌和少数其它厌氧菌，却能利用胆汁作为营养物质，故生长旺盛。 （2）方法：将相同菌量的脆弱类杆菌和产黑色素类普雷沃菌分别接种至 20%胆汁（或 2%胆盐）培养基中，同时接种不含胆汁的对照管。于 35孵育 2448h，观察结果。 （3）结果判定和报告：如果待检细菌在含胆汁的培养管中细菌生长旺盛(+)，而在不含 胆汁的对照管细菌生长一般（+） ，说明胆汁刺激生长试验阳性；若在含胆汁的培养管中抑 制生长者，则胆汁刺激生长试验为阴性。脆弱类杆菌胆汁刺激生长试验阳性，产黑色素普 雷沃菌胆汁试验为阴性。 7、明胶液化试验 （1)原理：明胶是一种动物蛋白，能在 20凝固，高于 20时液化。某些厌氧菌能产 生明胶酶，能使明胶分解为多肽和氨基酸，从而失去凝固力，使半固体的明胶培养基变为 流动的液体。 （2）方法：将待检菌接种于明胶管中，同时用一支未接种细菌的明胶管作为对照，经 370C 厌氧孵育 25 天，取出置 4冰箱中 30 分钟，观察培养基是否凝固。 （3）结果判定：对照管 37时呈液化状态，置 4冰箱中应呈凝固状态。接种细菌的明 胶管置 4冰箱中 30 分钟仍不凝固者为阳性，若凝固者则为阴性。脆弱类杆菌和厌氧消化 链球菌明胶液化试验为阴性，产黑色素普雷沃菌及厌氧消化链球菌明胶液化试验为阳性。 8、胞外酶快速生化试验 （1）原理：利用厌氧菌已产生的特异性酶可作用于相应基质，发生特异性的酶促反应， 迅速使基质分解产生各种可见的变化。试验时，将高浓度菌液接种到高浓度的基质中，由 于菌量大，携带的酶也多，基质量充分，故反应速度快。普通环境下置 37孵育 4h（由于 细菌不需要再繁殖，故不必厌氧培养） ，观察结果。 （2）方法：用直径 2mm 的接种环取一满环待检细菌菌苔，加于 0.5ml 磷酸盐缓冲液中 配成浓厚菌液，再按表 12-5 的方法操作，在一次性微量板中依次加入基质和浓菌液，并观 察结果。 表 12-5 胞外酶快速生化试验方法 糖发酵试验 脲酶试验 吲哚试验 硝酸盐还原试验 基质 200g/L 糖溶液 2 滴 20g/L 尿素溶液 3 滴 L-色氨酸 4 滴 0.5g/L 硝酸钠溶液 2 滴 缓冲液 糖发酵缓冲液 5 滴 0.025mol/L pH6.0 酚红磷酸 盐缓冲液 3 滴 0.025mol/L pH6.8 磷酸盐缓冲液 2 滴 脓菌液 2 滴 2 滴 2 滴 2 滴 反应