张忠亮鱼腥草茎在不同时期多糖含量比较

黄山学院 生命与环境科学学院 学士学位论文 第 1 页 共 15 页 本科毕业论文 （设计） ( 2013 届 ) 黄山学院教务处制 题 目 ： 鱼腥草茎在不同时期多糖含量比较 学 院 ： 生命与环境科学学院 专 业 ： 生物科学 学生姓名 ： 张忠亮 学号 ： 20909041084 指导教师 ： 余利华 职称（学位） ： 工程师（硕士） 合作导师 ： 陈向阳 职称（学位） ： 讲 师（硕士） 完成时间 ： 2013 年 5 月 25 日 成 绩 ： 综合成绩： 等级： 黄山学院 生命与环境科学学院 学士学位论文 第 2 页 共 15 页 学位论文原创性声明 兹呈交的学位论文，是本人在指导老师指导下独立完成 的研究成果。本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研 究成果，均在文中以明确方式标明。本人依法享有和承担由 此论文而产生的权利和责任。 声明人（签名）： 2013 年 6 月 1 日 第 3 页 共 15 页 目 录 中文摘要 英文摘要 1 引言 5 1.1 鱼腥草简介 5 1.2 鱼腥草的研究价值 5 1.3 超声波的作用原理 5 2 材料仪器和实验方法 6 2.1 材料仪器准备 6 2.1.1 材料的准备和处理 6 2.1.2 实验试剂 6 2.1.3 实验器材 6 2.2 试验方法 6 2.2.1 多糖含量测定原理 6 2.2.2 标准曲线的绘制 6 2.2.3 鱼腥草的脱脂脱色 7 2.2.4 单因子实验 7 2.2.5 正交试验 9 2.2.6 不同时期多糖的测量 9 3 实验结果与分析 10 4.1 标准的绘制 10 4.2 单因素实验 11 4.3 正交实验 11 4.4 不同时期多糖的测量 12 4 讨论 13 参考文献 14 致谢 14 鱼腥草茎在不同时期多糖含量比较 张忠亮（20909041084） 导师：余利华（工程师） 合作导师：陈向阳（讲师） （黄山学院生命与环境科学学院，黄山学院） 摘要：先分别通过单因素实验和正交实验对鱼腥草茎中的多糖进行超声波提取，以鱼腥草提 取率作为指标，分别对超声波浸提时间，水浴时间，水浴温度以及乙醇浓度这些因素进行考 察，从而得出超声波提取鱼腥草茎中多糖的最好条件：超声波浸提时间 30min，水浴时间 90min，水浴温度 80，乙醇浓度 80%。然后在最佳条件下分别测四个不同时期下鱼腥草茎 中多糖的提取率，从而得出鱼腥草茎中多糖在 6 月份含量比较丰富。 关键词：鱼腥草；多糖；单因素；正交；超声波；不同时期 Houttuynia cordata stems in the polysaccharide content in different periods Zhong-Liang ZHANG（20909041084） Supervisor: Li-Hua YU(Engineer) Co-supervisor:Xiang-Yang CHEN(Lecturer) (College of Life and Environment sciences, Huangshan University, Huangshan, 245041 China) Abstract:first by single factor experiment and orthogonal experiment for ultrasonic extraction of polysaccharide of Houttuynia cordata stems, rate as the index in Houttuynia cordata extraction, ultrasonic extraction time of time, water bath, water bath temperature and ethanol concentration on these factors, then the best extraction conditions of polysaccharide in Houttuynia cordata stems: ultrasonic ultrasonic the extraction time, water bath time, water bath temperature, ethanol concentration. The extraction rate and then under the optimal conditions were measured at four different times of H. cordata stems polysaccharide, thus draws cordata stems polysaccharides rich in content. Key Words: Houttuynia cordata; polysaccharide; single factor; orthogonal; ultrasonic; different periods 第 5 页 共 15 页 1 引言 1.1 鱼腥草特点 鱼腥草（Houttuynia cordata ） 又名侧耳根，鱼鳞草等，是三白草科 （Saururacere）蕺菜属(Houttuynia), 是很常用中草药。为多年生草本植物，高 3050 厘米， ，常呈紫红色，下部伏地蔓生、生根，节上轮生小根。因其含有鱼 腥气味，故而得名鱼腥草。鱼腥草生长于阴湿处或山涧边，常可在野地、路旁、 庭园树下等较阴湿的地方发现，大片蔓生。该植物我国南方各地较常见。鱼腥草 内含有黄酮，蛋白质，多糖等等。由于多糖有多种生物活性，与生物机能的维持 密切相关，各种植物多糖有很多的药理作用药理研究表明鱼腥草具有：抗菌作用， 抗病毒作用，增强机体免疫功能，利尿作用抗炎抗过敏作用。还有学者发现，鱼 腥草水溶性多糖多葡萄球菌，变形杆菌，大肠杆菌，沙门氏菌有不同的抑菌效果， 七对双歧杆菌有促增效果 2。其独特的功能和低毒性有很广的前景。 1.2 鱼腥草的研究价值 鱼腥草含有比较丰富的药用成分和营养成分，是一种药食兼用的野生植 物，具有清热解毒，利尿消肿。治肺炎，肺脓疡，热痢，白带，痈肿，秃疮，疥 癣等功效 12。其富含人体所需的蛋白质，脂肪，钙，维生素 C 和维生素 E 等营养 成分。其主要含有的是挥发油和黄酮类。这些方面已有很多人做过相关的研究。 而多糖是对人类很重要的化合物，人们从内到外都离不开它，而其多糖低毒性的 性质也很值得去了解。本实验主要是借助超声波对不同鱼腥草茎内的多糖进行提 取分析。进而分析出不同时期鱼腥草茎中多糖含量最为丰富的时期。为更高效的 利用鱼腥草提供一定理论依据。 1.3 超声波的作用原理 超声波提取是很高效的一种强化提取效果的方法 1,2,5,8。主要是利用超声波 所产生的超声能，强烈的机械振动和空化效应。当超声波振动时，产生很大的能 量，从而引起媒质以很大的速度进入加速的振动状态。使其结构发生变化，促使 有效成分进入溶剂中。除此之外，超声波还在液体中国产生空化作用，而且伴随 强大的冲击波和微声波，以致细胞壁被破坏，植物内的物质成分会释放出来从而 会提高相应物质的提取率。除此之外，超声波还有些像热效应，乳化等等，也会 相应的提高物质的提取率 5,15。 2 材料仪器和实验方法 2.1. 1 材料的准备和处理 鱼腥草是分不同时期（2012 年 4 月 20 日,5 月 3 日，5 月 28 日，6 月 10 日） 在黄山学院南区内挖得，洗净后将根茎叶分开取茎，放入干燥相中恒温 70干燥 24 小时，直至恒重，然后在粉碎机中粉碎放置在干燥的地方备用。 2.1.2 实验试剂 95%乙醇（上海振企化学试剂有限公司） ，浓硫酸（上海振企化学试剂有限公 司） ，葡萄糖（天津博迪化工股份有限公司） ，石油醚（新陇化工股份有限公司） ， 乙醚（扬州沪宝化学试剂有限公司） ，蒸馏水，蒽酮（上海科丰化学试剂有限公 司） 。 2.1.3 实验器材 微型植物试样粉碎机 (金坛市杰瑞尔电器有限公司 ) ；电子天平（上海越 平科学仪器有限公司） ；紫外可见分光光度计（上海奥普勒仪器有限公司） ；超声 波清洗机（曙峰企业制造） ；索氏提取器（上海新嘉电子有限公司） ；电热恒温鼓 风干燥箱（上海新苗医疗器械制造有限公司） ；数显恒温水浴锅（金坛市杰瑞尔 电器有限公司） ；RE-52AA 旋转蒸发仪(上海亚荣有限公司产品)；粉碎机；试管； 量筒；烧杯；容量瓶等。 2.2 实验方法 2.2. 1 多糖含量测定原理 利用苯酚-浓硫酸法测定多糖的含量 3，因多糖在浓硫酸作用下，分子内脱 水生成羟甲基糠醛或者羟甲基糠醛，其与苯酚缩合生成一种橙红色化合物，在 490nm 波长下有最大的吸收峰，所以可以用比色法在此波长下测定吸光度 2，进 而算出多糖的含量。此法灵敏度高，基本不受蛋白质的存在干扰。而本次试验的 基本流程是：材料的脱脂脱色，干燥，精确称量，加酒精，超声波浸提，水浴加 热，静置，过滤取上清液，在旋转蒸发仪中蒸发浓缩，静置，离心，取沉淀物加 蒸馏溶解水并加热，过滤去除杂质，然后醇析离心，得到粗多糖，再定溶，最后 按照苯酚-浓硫酸法测相应多糖的吸光度 A 值 2,15，进而得出结论。 2.2.2 标准曲线的绘制 3,9 利用电子天平精密称取干燥张致恒重的葡萄糖 0.0966g 加水溶解至 100ml,然 第 7 页 共 15 页 后再取 1ml 定容至 10ml 容量瓶中，制的 0.0966mg/ml 的葡萄糖对照品储备液。取 11 支试管按 0 到 11 编号，0 号作对照；1,2 号加 0.20ml 葡萄糖储备液；3,4 号加 0.40ml 葡萄糖储备液；5,6 号加 0.60ml 葡萄糖储备液； 7,8 号加 0.80ml 葡萄糖 储备液；9,10 号加 1.00ml 葡萄糖储备液；然后将 0 到 10 号全部加蒸馏水定容至 2.00ml；然后按照顺序向试管中加入 1.00ml 的 9%的苯酚溶液和 5.00ml 的浓硫酸 （浓硫酸加入一定要缓慢） ，摇匀，静置 30 分钟。最后以 0 号试管为参照，在 490nm 波长下测吸光度 A 值 3,9。做好登记，以横坐标为糖含量，吸光度 A 值为纵 坐标，绘制标准曲线并进行线性回归的的求解见图 3-1。 2.2.3 鱼腥草粉末的脱脂脱色 将不同时期的鱼腥草茎用电子天平精确称各取 6 包，每包 1g，再称任一时期 的材料 9 包，均用滤纸包好并做好标记。然后在索氏提取器中用石油醚脱脂脱色 4 小时，提取温度恒定在 70。然后取出放入电热恒温鼓风干燥箱中在 70下干 燥 12 个小时以上，使之达到恒重。之后放入干燥箱中作为实验材料。脱脂脱色 对其多糖的提取是很重要的步骤，脂类和色素的存在是很影响多糖的测定的，所 以脱脂脱色要充分。 2.2.4 单因子实验 每次实验均取同一时期的“2.2.3”中的材料四包，即每次取同一时期的 4 克，分别放入 4 个试管中，按下图表 2-1，表 2-2，表 2-3 和表 2-4 中依次编号， 每支试管中均加 20ml 的乙醇，并且按下面表格添加试剂和进行实验 13,15。 表 2-1 乙醇浓度的选择实验 table 2-1 Choice experiment ethanol concentration 试管编号 实验条件 1.1 1.2 1.3 1.4 乙醇浓度 60% 70% 80% 90% 水浴温度 70 70 70 70 水浴时间 30min 30min 30min 30min 超声波浸提时间 30min 30min 30min 30min 表 2-2 水浴温度选择的实验 Table 2-2 bath temperature selection experiment 试管编号 实验条件 2.1 2.2 2.3 2.4 乙醇浓度 70% 70% 70% 70% 水浴温度 60 70 80 90 水浴时间 30min 30min 30min 30min 超声波浸提时间 30min 30min 30min 30min 表 2-3 水浴时间选择的实验 Table 2-3 bath time selection experiment 试管编号 实验条件 3.1 3.2 3.3 3.4 乙醇浓度 70% 70% 70% 70% 水浴温度 60 70 80 90 水浴时间 30min 60min 90min 120min 超声波浸提时间 30min 30min 30min 30min 表 2-4 超声波浸提时间的选择实验 table 2-4 Choice experiment ultrasonic extraction time 试管编号 实验条件 4.1 4.2 4.3 4.4 乙醇浓度 70% 70% 70% 70% 水浴温度 60 70 80 90 水浴时间 30min 30min 30min 30min 超声波浸提时间 30min 45min 60min 75min 然后静置过滤取上清液，滤液在 RE-52AA 旋转蒸发仪中浓缩，在静置 12 小 时，在离心机中以 3000r/min 离心 30min,然后沉淀物溶于蒸馏水中，加热去除不 溶物，醇析离心，得到鱼腥草粗多糖，最后按照“2.2.2”中的苯酚-浓硫酸法 2 在紫外可见分光光度计（490nm ）中分别测其吸光度 A 值，作好记录。根据实验 数据制作表格见图 3-2。 第 9 页 共 15 页 2.2.5 正交实验 1,3,7,12 在单因素的基础之上选择不同的乙醇浓度，水浴时间，水浴温度和超声波浸 提时间为条件进行正交实验，取“2.2.3”中单独处理的 16 包材料为实验材料， 分别放入 16 支试管中依次编号 1 到 9 号，加入的各梯度的酒精均为 20ml。以确 定鱼腥草的最佳提取工艺其各条件的试验情况见表 2-5。 表 2-5 正交实验各因素的条件 Table 2-5 factors orthogonal experiment conditions 条件 编号 超声波浸提时间 （min） 水浴时间 （min） 水浴温度 （） 乙醇浓度 （% ） 5.1 30 60 70 70 5.2 30 90 80 80 5.3 30 120 90 90 5.4 45 60 80 90 5.5 45 90 90 70 5.6 45 120 70 80 5.7 60 60 90 80 5.8 60 90 70 90 5.9 60 120 80 70 然后静置过滤取上清液，滤液在 RE-52AA 旋转蒸发仪中浓缩，在静止 12 小 时，在离心机中以 3000r/min 离心 30min,然后沉淀物溶于蒸馏水中，加热去除不 溶物，醇析离心，得到鱼腥草粗多糖，最后按照“2.2.2”中的苯酚-浓硫酸法 2 在紫外可见分光光度计中分别测其吸光度 A 值，作好记录。制作表格见图 3-3。 2.2.6 不同时期多糖含量的测定 在单因素实验和正交实验的基础上选择最佳的实验条件，即乙醇浓度 80%， 水浴温度 80%，水浴时间 90min 和超声波浸提时间 30min。分别取各个时期的 “2.2.3”中的材料各一包，分别放入 4 支试管中，依次编号 6.1，6.2，6.3，6.4 对应的鱼腥草茎的日期为 4 月 20 日，5 月 3 日，5 月 28 日， 6 月 10 日。和上面一样加入酒精的体积也为 20ml 然后按照表 2-6 进行操作。 表 2-6 不同时期多糖含量测定的实验 Table 2-6 determination of polysaccharide content in different periods of experimenttable 条件 编号 乙醇浓度 （% ） 水浴温度 （） 水浴时间 （min） 超声波浸提 时间(min) 6.1 80 80 90 30 6.2 80 80 90 30 6.3 80 80 90 30 6.4 80 80 90 3 然后静置过滤取上清液，滤液在 RE-52AA 旋转蒸发仪中浓缩，在静止 12 小 时，在离心机中以 3000r/min 离心 30min,然后沉淀物溶于蒸馏水中，加热去除不 溶物，醇析离心，得到鱼腥草粗多糖，最后按照“2.2.2”中的苯酚-浓硫酸法 2 在紫外可见分光光度计中分别测其吸光度 A 值，作好记录，根据数据制作表格见 图 3-3。 3 实验结果 3.1 标准曲线的绘制 表 3-1 葡萄的糖标准曲线 Grape 3-1 Glucose standard 图 3-1 所示标准曲线回归方程:Y=1.5312X+o.0006,R=0.9906 其吸光度与浓 度呈现出良好的线性关系。 第 11 页 共 15 页 3.2 单因素实验 图 3-2 鱼腥草茎部多糖提取单因子实验结果图 Grape 3-2 Extraction of single factor experiment results polysaccharidecordata stems. 由单因素的实验结果图可以看出在固定三个变量恒定的情况下，吸光度最大， 即鱼腥草茎部多糖的提取率最大的条件为乙醇溶液的浓度为 80%，水浴温度为 80，水浴时间为 120min，超声波浸提时间为 45min。 3.3 正交实验 表 3-1 鱼腥草茎部多糖提取的正交实验结果 3,16，7 table 3-1 Results of orthogonal test Houttuynia cordata stems polysaccharide extraction 条件 编号 超声波浸提时 间（min） 水浴时间 （min） 水浴温度 （） 乙醇浓度 （%） 提取率 mg/g 5.1 30 60 70 70 3.861 5.2 30 90 80 80 6.023 5.3 30 120 90 90 4.726 5.4 45 60 80 90 3.754 5.5 45 90 90 70 5.456 5.6 45 120 70 80 4.378 5.7 60 60 90 80 2.765 5.8 60 90 70 90 5.397 5.9 60 120 80 70 4.345 K1 4.780 3.460 4.545 4.554 K2 4.531 5.627 4.707 4.389 K3 4.169 4.483 4.316 4.631 R 0.611 2.167 0.391 0.242 由表 3-1 鱼腥草茎部多糖提取的正交实验结果可知对鱼腥草茎部多糖提取率 影响的主要因素依次为：水浴时间超声波浸提时间水浴温度乙醇浓度；而提 取率最佳的组合为:超声波浸提时间为 30min，水浴时间为 90min，水浴温度为 80，乙醇浓度为 80%；在这个组合的条件下其鱼腥草茎部的提取率为 6.023mg/g。 3.4 不同时期多糖的测定 图 3-3 不同时期鱼腥草茎部多糖提取测定图 Grape 3-3 Determination of Fig.in different periods of Houttuynia cordata stems to extract polysaccharide 由图 3-2 可以看出 6 月 10 日的鱼腥草吸光度最大，所以相对其他时期而 言其茎部多糖的含量比较丰富。 第 13 页 共 15 页 4 讨论 本次试验通过单因子实验，正交试验对鱼腥草茎部多糖的提取率的四个影响 因子进行比较分析，选择出组合搭配最佳的一组，即为乙醇浓度 80%，水浴温度 80，水浴时间 80min 和超声波浸提时间 30min。在这个组合下经过对不同时期 鱼腥草茎部的多糖含量进行比较可知，6 月份的多糖含量比较高。这次的实验只 考虑了四个刚面的单因子，其实影响多糖的提取率的因素还有许多，比如料液比， 超声波的频率等等，要想更佳全面准确的分析鱼腥草多糖的提取率，这些因素都 是不可以忽略的。就本实验而言是比较不同时期的含量的大小，所以不是那么重 要。从整个实验过程核试验数据的结论来看，整个四个时期多糖含量并未表现出 怎样的规律，而且多糖含量之间的差异也很小，这样的结果可能有多方面的原因。 首先，从材料的获取上鱼腥草四个时期间隔的太短，在时间上并不能体现出差距， 材料采集的时期上也没有季度上的跨度，因而多糖含量的变化并不是表现得很明 显。另一方面，在材料的获取上，是在黄山学院南区，但并不是同一个地方挖取 得，各个地方的土地环境光等等照条件不一样，所以鱼腥草长势的条件差异很大， 这也是对其含量影响比较大的因子。从图 3-3 来看，6 月份以后鱼腥草茎部多糖 的含量可能还会上升。所以要更明显有效测定鱼腥草茎部多糖含量的情况，应将 时间跨度拉大，并且侧更多的时期而且鱼腥草的来源应相同。 从单因子实验到正交实验中，我们可以明显的看到，在单因子试验中各个提 取率最高的的影响因子的组合，并不是正交试验的最佳组合。各个影响因子对多 糖提取率的影响是有大小的从，本实验表 3-1 看出对鱼腥草茎部多糖的提取影响 从大到小为水浴时间，超声波浸提时间，水浴温度和乙醇浓度。而只有在最佳的 组合水浴时间 90min，水浴温度 80，超声波浸提时间 30min，和乙醇浓度为 80%条 件下达到最大的提取率。而在多糖提取的过程中超声波的作用是关键的，它破坏 细胞，改变植物组织，发挥它像空化作用等特殊的作用加速以及提高物质的释放， 同时在有效的保持有效成分活性的同时又减少像蛋白质等杂质的析出，影响实验 的结果，所以超声波法提取多糖是一种不错的方法。 参考文献 1 孟江，周毅生，廖华为.超声波提取鱼腥草多糖工艺研究.广东药学院中药学 院，2008，19（1）：17-18 2张倩，江萍，秦礼康，等.鱼腥草水溶性多糖的提取及鉴定.食品科学， 2000，21（3）：49-50 3罗馨，赵卫星，温普红.正交超声法提取鱼腥草多糖工艺研究.化学工程师， 2